周霞　張堯　張成霞

摘要：研究了菌齡、滲透壓穩(wěn)定劑、酶系統(tǒng)、酶解時間等條件對荷葉離褶傘原生質(zhì)體制備的影響，通過紫外線誘變技術篩選得到1株高產(chǎn)多糖的菌株。結(jié)果表明，原生質(zhì)體制備最適菌齡為4 d，滲透壓穩(wěn)定劑為06 mol/L甘露醇，使用1%溶壁酶+1%蝸牛酶組合在30 ℃酶解25 h，原生質(zhì)體產(chǎn)量可達138×107個/mL，再生率為127%。經(jīng)誘變、篩選和遺傳穩(wěn)定性分析，獲得1株多糖含量較出發(fā)菌株提高3449%的突變菌株。

關鍵詞：荷葉離褶傘；原生質(zhì)體；紫外誘變；多糖

中圖分類號： S6461036文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2017）16-0126-03

收稿日期：2017-02-27

基金項目：江蘇省泰州市農(nóng)業(yè)科技支撐計劃（編號：TN201514）。

作者簡介：周霞（1983—），女，江蘇泰州人，碩士，講師，主要從事園林園藝專業(yè)的遺傳育種、栽培和食用菌栽培等教學與科研。Tel：（0523）86158388；E-mail：694416747@qqcom。

荷葉離褶傘（Lyophyllum decastes），隸屬于傘菌目（Agaricales）白蘑科（Tricholomataceae）離褶傘屬（Lyophyllum），是一種十分珍貴的野生食藥兼用菌，它口感鮮美，富含豐富的礦物質(zhì)、維生素和氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)。鹿茸菇為其商品名，是由于它的菌傘酷似我國名貴的中藥材鹿茸切片而得名，除了外觀與鹿茸相似外，據(jù)國內(nèi)相關文獻報道，它還具有多重藥用功效。多糖是荷葉離褶傘的主要有效成分，目前正成為國內(nèi)外眾多學科領域研究的熱點之一[6-8]。本研究通過紫外線誘變原生質(zhì)體技術[9-12]選育出高產(chǎn)多糖的荷葉離褶傘菌株。

1材料與方法

11材料

111菌種荷葉離褶傘供試菌種（中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號CGMCC No1518，菌株號ZY48-1，專利號：ZL2005100964050。）

112培養(yǎng)基菌絲固體培養(yǎng)基（PDA）、菌絲液體培養(yǎng)基（PGA）、原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、蛋白胨2 g、酵母粉2 g、K2HPO4 15 g、MgSO4·7H2O 15 g、瓊脂2%、水1 000 mL、06 mol/L甘露醇穩(wěn)滲劑）。

12試驗方法

121菌絲體培養(yǎng)及生長曲線

刮取培養(yǎng)好的斜面菌種放入盛有10 mL無菌水的小三角瓶中，內(nèi)置碎玻璃，充分振蕩，吸取2 mL菌絲懸液于盛有50 mL液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，25 ℃、120 r/min培養(yǎng)數(shù)天。3次重復，每隔1 d將菌絲體于60 ℃烘干至恒質(zhì)量，繪制生長曲線。

122原生質(zhì)體制備

將培養(yǎng)好的菌絲置于離心管中，4 000 r/min 離心20 min，棄去上清液，用穩(wěn)滲劑洗滌3 次，按200 mg/mL比例加入酶液，30 ℃酶解數(shù)小時，得純化原生質(zhì)體，整個過程在無菌條件下進行，用血球計數(shù)板計數(shù)計算原生質(zhì)體產(chǎn)量。

123原生質(zhì)體制備條件

在同等條件下分別研究酶系統(tǒng)、酶解時間、滲透壓穩(wěn)定劑種類、菌齡等條件對原生質(zhì)體制備的影響。酶系統(tǒng)：2%溶壁酶、2%纖維素酶、2%蝸牛酶、1%溶壁酶+1%纖維素酶、1%溶壁酶+1%蝸牛酶、1%纖維素酶+1%蝸牛酶。酶解時間為1、2、3、4、5 h。滲透壓穩(wěn)定劑：06 mol/L 的硫酸鎂、甘露醇、蔗糖、葡萄糖。菌齡：分別取菌齡2、4、6、8、10、12 d的菌絲體制備原生質(zhì)體并計數(shù)。

124原生質(zhì)體再生

用滲透壓穩(wěn)定劑將純化的原生質(zhì)體稀釋并涂布原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基平板，25 ℃培養(yǎng)，8～10 d后觀察原生質(zhì)體的再生情況。同時用無菌水漲破原生質(zhì)體后作為對照，消除非原生質(zhì)體所形成的菌落帶來的誤差。

125原生質(zhì)體紫外線誘變

無菌條件下，將制備好的原生質(zhì)體稀釋至104個/mL，取5 mL于9 cm無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，用磁力攪拌器使原生質(zhì)體懸液保持均勻。在預熱穩(wěn)定的15 W紫外燈下距離30 cm處分別照射0、10、20、30、40、50、60、80、100 s，每組2個重復。吸取原生質(zhì)體懸液200 μL，涂布再生培養(yǎng)基，25 ℃避光培養(yǎng)，計菌落數(shù)，繪制荷葉離褶傘原生質(zhì)體紫外線誘變劑量效應曲線，計算原生質(zhì)體紫外線誘變的半致死劑量，并確定誘變劑量。

126高產(chǎn)多糖突變菌株的篩選

以半致死劑量誘變荷葉離褶傘原生質(zhì)體，挑取優(yōu)先再生、生長最旺盛的菌落進行拮抗試驗（3點接種法），初步篩選出40株誘變菌株。在此基礎上，分別將出發(fā)菌株和誘變菌株接入100 mL液體培養(yǎng)基中，25 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)6 d，測定培養(yǎng)液多糖含量（苯酚-硫酸法[12]），進一步篩選多糖產(chǎn)量高的菌株。

127遺傳穩(wěn)定性分析

將高產(chǎn)多糖誘變菌株連續(xù)轉(zhuǎn)接10代，均進行搖瓶培養(yǎng)，取第1、3、5、6、7、8、9、10代分別測定菌絲多糖含量。

2結(jié)果與分析

21菌絲生長曲線

（0472 g/L），8 d以后曲線呈下降趨勢。根據(jù)生長曲線，初步確定菌齡在對數(shù)期4 d時進行原生質(zhì)體制備。

22不同酶系統(tǒng)對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

使用3種單一酶和3種酶組合，30 ℃條件下對培養(yǎng)4 d的菌絲酶解2 h。從圖2可以看出，選用不同種類或組合的脫壁酶對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響較大，在供試的6種酶解液中，使用酶組合進行脫壁的效果要顯著優(yōu)于使用單一酶。其中1%溶壁酶+1%蝸牛酶組合原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，達1463×106個/mL；2%纖維素酶（84×105個/mL）原生質(zhì)體產(chǎn)量最低。

23酶解時間對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

使用1%溶壁酶+1%蝸牛酶組合，30 ℃條件下對培養(yǎng)4 d 的菌絲分別酶解1、2、3、4、5 h。從圖3可以看出，酶解時間在10～25 h范圍內(nèi)，原生質(zhì)體產(chǎn)量迅速提高，在3 h時達到最大（131×107個/mL），隨后產(chǎn)量逐漸下降。故最適酶解時間為25 h。

24滲透壓穩(wěn)定劑對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

分別使用06 mol/L硫酸鎂、甘露醇、蔗糖、氯化鉀作為滲透壓穩(wěn)定劑，1%溶壁酶+1%蝸牛酶組合酶解，30 ℃條件下對培養(yǎng)4 d的菌絲酶解25 h制備原生質(zhì)體并計數(shù)。從圖4可以看出，同等條件下，06 mol/L的甘露醇作為滲透壓穩(wěn)定劑原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，為13×107個/mL，其次是蔗糖和氯化鉀，硫酸鎂作為滲透壓穩(wěn)定劑產(chǎn)量最低，故荷葉離褶傘原生質(zhì)體制備的最適滲透壓穩(wěn)定劑為 06 mol/L 甘露醇。

25菌齡對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

分別取菌齡2、3、4、5、6、7 d的菌絲體同等條件下制備原生質(zhì)體并計數(shù)。從圖5可以看出，培養(yǎng)4 d時原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，達138×107個/mL，培養(yǎng)時間超過4 d后，原生質(zhì)體產(chǎn)量逐漸下降，故最佳菌齡為培養(yǎng)4 d，與圖1生長曲線基本吻合。

26原生質(zhì)體再生

以06 mol/L甘露醇作為滲透壓穩(wěn)定劑，25 ℃培養(yǎng)，在第9天出現(xiàn)再生菌落，再生率為127%。

27原生質(zhì)體紫外線誘變

荷葉離褶傘紫外線誘變劑量效應曲線見圖6，由此計算半致死率照射劑量約為20 s。

28高產(chǎn)多糖突變菌株的篩選

根據(jù)拮抗反應和菌落生長狀況，在紫外線照射時間為 20 s 的平板上篩選出20株菌落形態(tài)無明顯變化，生長速度較快的突變菌株。以原始出發(fā)菌株為對照，測定其多糖含量，結(jié)果見表1。篩選出6株誘變菌株，分別為菌株02、10、11、15、21、28。

29遺傳穩(wěn)定性分析

將6株誘變菌株連續(xù)轉(zhuǎn)接10代，測定菌絲多糖含量，結(jié)果見表2。10號誘變菌株雖然多糖含量最高，但遺傳穩(wěn)定性不好，11號菌株遺傳穩(wěn)定性好，且多糖含量也高，較出發(fā)菌株提高了3449%。

3結(jié)論與討論

荷葉離褶傘原生質(zhì)體制備最佳條件為：菌齡4 d，用 06 mol/L 甘露醇作為滲透壓穩(wěn)定劑，1%溶壁酶+1%蝸牛酶組合30 ℃酶解25 h，原生質(zhì)體產(chǎn)量達138×107個/mL，再生率達127%。原生質(zhì)體紫外線誘變半致死劑量為20 s，根據(jù)拮抗反應和菌落生長狀況，篩選出40株誘變菌株，從中選出6株多糖含量較高的菌株，通過遺傳穩(wěn)定性分析，獲得1株多糖含量為6 01872 mg/L的誘變菌株，較原始出發(fā)菌株多糖含量提高3449%。

影響原生質(zhì)體釋放的因素有很多[13-15]，本試驗通過對荷葉離褶傘原生質(zhì)體的制備條件的研究，明確了搖瓶發(fā)酵條件下，菌齡、滲透壓穩(wěn)定劑、酶系統(tǒng)、酶解時間等條件對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響，其中酶系統(tǒng)的選擇對原生質(zhì)體產(chǎn)量影響較大，采用復合酶的效果要顯著優(yōu)于使用單一酶進行酶解。紫外線誘

注：表中00號為出發(fā)菌株。

變原生質(zhì)體育種技術是一種簡單、有效的育種技術，但經(jīng)紫外線照射后，原生質(zhì)體的再生一般比較困難，給育種工作帶來一定麻煩。本試驗經(jīng)過多次重復大量的誘變工作，篩選到1株高產(chǎn)多糖的菌株。

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