李晶　李芳娜　林雄杰

摘要：鯊烯環(huán)氧酶（squalene epoxidase，SE）是多數(shù)中草藥植物、藥用菌中三萜合成途徑中的限速酶，能影響三萜含量的積累。構(gòu)建了牛樟芝鯊烯環(huán)氧酶基因（se）原核表達(dá)載體，并進(jìn)行其重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化。以牛樟芝cDNA為模板擴(kuò)增se，純化后將其克隆到pMD18-T載體上，篩選陽(yáng)性克隆并將其連接到原核表達(dá)載體pET28a，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-se，經(jīng)酶切驗(yàn)證后轉(zhuǎn)化Ecoil BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，利用L9（34）[JP2]正交試驗(yàn)優(yōu)化目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件及純化。結(jié)果表明，不同正交處理間的蛋白表達(dá)差異顯著（P<005），其誘導(dǎo)因素的主次為時(shí)間>溫度>IPTG濃度，誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組蛋白表達(dá)影響最顯著（P<005）。而IPTG濃度和溫度對(duì)重組蛋白表達(dá)影響并不顯著（P>005），且當(dāng)IPTG終濃度為02 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為7 h，誘導(dǎo)溫度為26 ℃時(shí)，對(duì)SE重組蛋白的誘導(dǎo)效果最佳。

關(guān)鍵詞：牛樟芝；鯊烯環(huán)氧酶；原核表達(dá)；正交設(shè)計(jì)

中圖分類號(hào)： S5673+901文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1002-1302（2017）16-0050-04

收稿日期：2016-04-10

基金項(xiàng)目：福建農(nóng)林大學(xué)發(fā)展研究基金（編號(hào)：KF2015111）；福建省2011計(jì)劃（編號(hào)：K80ND8002）。

作者簡(jiǎn)介：李晶（1985—），女，湖北武漢人，博士，助理研究員，主要從事食用菌研究。E-mail：13959197195@163com。

通信作者：林占熺，研究員，主要從事菌草技術(shù)推廣研究。E-mail：lzxjuncao@163com。

三萜是多數(shù)食藥用菌和藥用植物中重要的活性物質(zhì)之一，研究表明三萜具有保肝、抗炎癥、抗過(guò)敏和抗腫瘤等功效，因此具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益。鯊烯環(huán)氧酶（squalene epoxidase，SE）是三萜合成途徑中的一種重要調(diào)控酶，它位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的微粒體中，催化鯊烯（squalene，SQ）合成2，3-氧化鯊烯（2，3-oxidosqualene），可進(jìn)一步合成三萜、甾醇、膽固醇等重要萜類物質(zhì)[2-3]。同時(shí)，SE也催化氧原子插入到C-C雙鍵在P450類型反應(yīng)中形成環(huán)氧結(jié)構(gòu)的重要酶[4]。目前，已在人類、動(dòng)物、植物和真菌中克隆到鯊烯環(huán)氧酶基因（se），王森等對(duì)中草藥五味子se的研究表明其mRNA的表達(dá)量與三萜的生成量呈正相關(guān)[5]；Han等在人參根中克隆se后利用RNAi技術(shù)抑制其表達(dá)后三萜的產(chǎn)量顯著下降，因此SE被認(rèn)為是三萜生物合成中限速酶；人參SE蛋白的表達(dá)證實(shí)了其與人參皂苷含量相關(guān)。

牛樟芝（Antrodia cinnamomea），別稱樟芝、牛樟菇、樟生薄孔菌，是20世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)于我國(guó)臺(tái)灣的傳統(tǒng)藥用菌，通常生長(zhǎng)在空心、腐爛的牛樟木中[8]，其生長(zhǎng)極其緩慢，但三萜類化合物含量較高，對(duì)抗腫瘤、降血脂、降血糖等具有良好的療效，深受消費(fèi)者歡迎[9]。在牛樟芝中SE催化生成的2，3-氧化鯊烯是合成羊毛甾醇（Lanosterol）的重要底物，進(jìn)而形成膽固醇、三萜等化合物，SE作為反應(yīng)中的限速酶具有重要意義[10]。大腸桿菌（Escherichia coli，Ecoil）BL21（DE3）是高效表達(dá)異源蛋白常用的原核表達(dá)菌株之一，具有表達(dá)效率高等優(yōu)點(diǎn)，但是外源蛋白的表達(dá)效率，受到培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度和誘導(dǎo)劑等因素的影響差別較大[11]，為在體外獲得牛樟芝SE蛋白表達(dá)的最佳條件，將pET28a-se重組質(zhì)粒導(dǎo)入Ecoil BL21（DE3）中，利用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)溫度進(jìn)行篩選，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化誘導(dǎo)條件，篩選出牛樟芝se原核表達(dá)最佳條件，為進(jìn)一步探討牛樟芝SE蛋白活性和三萜合成機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

11材料與試劑

臺(tái)灣牛樟芝菌株AC001（GenBank登錄號(hào)：KM925002）由臺(tái)灣神農(nóng)真菌生物技術(shù)有限公司惠贈(zèng)，保存于國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心；原核表達(dá)載體pET28a由福建農(nóng)林大學(xué)功能基因組學(xué)研究中心提供。

2×Taq Master Mix、Ecoli DH5α、Ecoli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司；His60 Ni Superflow Resin、pMDTM18-T購(gòu)于TaKaRa公司；D2000 Plus Marker、Direct-load Color prestained Marker、N，N，N′，N′-四甲基乙二胺（TEMED）購(gòu)于Genestar公司；TRIzol試劑購(gòu)于Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于TOYOBO公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)于OMEAG公司；氨芐（Amp）、卡那霉素（Kan）、IPTG、丙烯酰胺（Acr）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、三羥基甲基氨基甲烷（Tris）等購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；限制性內(nèi)切酶、T4連接酶購(gòu)于Thermo公司；其他藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純。引物合成及測(cè)序均由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司完成。

12方法

121牛樟芝菌絲體RNA提取及cDNA合成

收集液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d的新鮮牛樟芝菌絲體，按TRIzol法提取樣品RNA[12]，檢測(cè)純度和濃度合格后，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明合成cDNA，每20 μL體系中含有500 ng RNA樣品，產(chǎn)物保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

122se的擴(kuò)增及回收

從已克隆并上傳至NCBI的se序列（GenBank 登錄號(hào)：KT070558）設(shè)計(jì)引物se-pe-F：CG-GGATCCATGTGGTCAACTAACTACG和se-pe-R：CCCA-AGCTTTCACCACCACCGAATCTC，上下游引物中分別加入BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)及相應(yīng)的保護(hù)堿基，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min；32個(gè)循環(huán)進(jìn)行94 ℃變性30 s，623 ℃退火40 s，72 ℃延伸100 s；最后72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后回收，克隆到pMDTM18-T載體上，轉(zhuǎn)化到Ecoli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性克隆，進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒并送樣測(cè)序。

123重組質(zhì)粒pET28a-se的構(gòu)建

將測(cè)序正確的的pMD18-se和pET28a質(zhì)粒分別用BamHⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙切，酶反應(yīng)體系為30 μL：含3 μL 10×Fast Digest Buffer，20 μL pMD18-se或pET28a質(zhì)粒，BamHⅠ、HindⅢ各 15 μL、4 μL ddH2O，反應(yīng)條件為37 ℃ 20 min，80 ℃滅活 10 min。酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳后回收后用T4連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Ecoli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，并篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切驗(yàn)證，將驗(yàn)證后的菌液保存?zhèn)溆谩?/p>

124pET28a-se融合蛋白誘導(dǎo)的單因素篩選

針對(duì)影響蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的3個(gè)因素，分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)。蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化方法參考林雄杰等的方法進(jìn)行，分別取10 μL破碎后上清液及沉淀樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果表明目的蛋白位于樣品上清中。

IPTG濃度對(duì)目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的影響：將培養(yǎng)液中的IPTG終濃度分別設(shè)為01、02、04、06、08 mmol/L，15 ℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)5 h后收集菌體并用超聲波破碎后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，以不添加IPTG試驗(yàn)組為對(duì)照（CK）。

培養(yǎng)時(shí)間對(duì)目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的影響：培養(yǎng)液的IPTG終濃度為06 mmol/L，培養(yǎng)溫度為15 ℃，200 r/min分別振蕩培養(yǎng)3、5、7、9、11 h，收集菌體破碎后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

培養(yǎng)溫度對(duì)目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的影響：培養(yǎng)液的IPTG終濃度為06 mmol/L，培養(yǎng)溫度分別為15、18、21、24、27 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)5 h后收集菌體破碎后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

125L9（34）正交試驗(yàn)對(duì)目的蛋白誘導(dǎo)及純化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)（表1），進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化，提取樣品總蛋白和純化后的目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳（5%濃縮膠，12%分離膠），觀察試驗(yàn)結(jié)果。

126數(shù)據(jù)處理

利用ExPASy數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)分子量、等電點(diǎn)；通過(guò)Gel Pro Analysis軟件對(duì)SDS-PAGE電泳結(jié)果進(jìn)行分析；利用SPSS 200對(duì)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果進(jìn)行方差分析。

2結(jié)果與分析

21pET-28a-se表達(dá)載體的構(gòu)建及驗(yàn)證

以牛樟芝菌絲體cDNA為模板進(jìn)行se片段的PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得與預(yù)期片段大小相符的單一條帶（1 446 bp），將其純化后克隆至pMD18-T載體，篩選出陽(yáng)性克隆并提取質(zhì)粒，用BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后與經(jīng)相同的酶雙切的pET28a載體相連，轉(zhuǎn)入Ecoli DH5α后獲得陽(yáng)性克隆后提取其質(zhì)粒，進(jìn)行BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果得到與目的片段大小相同的條帶（圖1），表明載體pET28a-Se已構(gòu)建成功。

22原核表達(dá)條件優(yōu)化及目的蛋白純化

目的蛋白表達(dá)量太低不利于后續(xù)的蛋白純化，因此本試驗(yàn)采用單因素正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行原核蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化。將驗(yàn)證好的重組質(zhì)粒pET28a-se轉(zhuǎn)化到Ecoli BL21（DE3），利用不同誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度及IPTG濃度進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，隨著IPTG終濃度的逐漸升高，目的蛋白表達(dá)量也逐漸增加，當(dāng)濃度為01～06 mmol/L時(shí)，其表達(dá)量相當(dāng)（圖2-a），對(duì)IPTG單因素誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化后表明其大小約為50 ku（圖2-b）； 當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為3～5 h時(shí)， 目

的蛋白表達(dá)量逐漸上升，但當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間大于7 h后，其表達(dá)量開(kāi)始下降（圖3）；當(dāng)溫度為15～27 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，目的蛋白的表達(dá)量呈先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)溫度達(dá)到或高于26 ℃時(shí)，其表達(dá)量下降（圖4）。

23正交試驗(yàn)對(duì)目的蛋白誘導(dǎo)優(yōu)化及純化

采用L34正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)誘導(dǎo)劑IPTG終濃度、誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)溫度進(jìn)行優(yōu)化，并將誘導(dǎo)表達(dá)后的蛋白用His60 Ni純化后進(jìn)行SDS-PAGE，利用Gel Pro Analysis對(duì)蛋白濃度進(jìn)行預(yù)測(cè)（圖5-a、圖5-b，表2），SPSS 20對(duì)正交試驗(yàn)的主體間效應(yīng)及處理因素效應(yīng)曲線分析結(jié)果表明，當(dāng)IPTG終濃度為02 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為7 h，誘導(dǎo)溫度為26 ℃時(shí)，se表達(dá)量達(dá)到最佳，模型具有顯著性差異（R2=0986，調(diào)整R2=0943，P<005）（表3、圖6），且對(duì)SE目的蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)因素的主次為時(shí)間>溫度>IPTG終濃度，且時(shí)間對(duì)目的蛋白的表達(dá)具有顯著影響（P<005），而IPTG終濃度和溫度對(duì)目的蛋白的表達(dá)不具有顯著性（P>005）。

3討論與結(jié)論

三萜牛樟芝子實(shí)體和菌絲體中重要的活性物質(zhì)，具有抗氧化[14]、防止細(xì)胞凋亡[15]等顯著藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。SE是三萜類化合物合成途徑中重要的限速酶之一[10]，目前已從人參[16]、刺五加[17]、絞股藍(lán)[18]等中草藥中克隆到se。李寶財(cái)?shù)劝l(fā)現(xiàn)se的表達(dá)量與刺五加葉中皂苷含量之間存在顯著正相關(guān)性[19]；蔣世翠等研究發(fā)西洋參須根、側(cè)根、莖、葉片、葉柄

等14個(gè)器官中的皂苷含量也與鯊烯合酶基因（sqs）和se呈正相關(guān)[20]。胡薇等對(duì)人參中se原核表達(dá)和活性測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其與人參皂苷的合成相關(guān)性較大。因此，SE重組蛋白的純化和制備體系的建立為牛樟芝菌絲體、子實(shí)體中三萜合成的研究奠定了基礎(chǔ)。

通常研究蛋白功能的主要手段為原核重組，且Ecoli是表達(dá)重組蛋白功能最強(qiáng)大的系統(tǒng)之一[21]。常見(jiàn)的原核表達(dá)載體pET28a中連有T7噬菌體轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，其mRNA的合成速度是大腸桿菌的5倍，能使目的基因高效表達(dá)。同時(shí)，該載體中N、C端還含有組氨酸標(biāo)簽（His-Tag），能夠特異地與鎳等金屬離子結(jié)合，且不影響重組蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，提高目的蛋白的純化效率，是原核表達(dá)常用載體之一[21]，選用該載體對(duì)牛樟芝se進(jìn)行原核表達(dá)，具有高效、快速和準(zhǔn)確等有點(diǎn)。

反應(yīng)條件通常是生物反應(yīng)中影響反應(yīng)結(jié)果的主要因素，研究人員常常需要通過(guò)不同方式找到最佳的反應(yīng)條件和影響反應(yīng)的主次因素。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)來(lái)考察原核表達(dá)的主要因素（誘導(dǎo)劑IPTG終濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度3個(gè)因素）對(duì)se表達(dá)效率的影響，該方法具有處理次數(shù)少、試驗(yàn)結(jié)果直觀、效率高等優(yōu)點(diǎn)[22]，通過(guò)破碎Ecoil BL21菌體所獲得上清蛋白SDS-PAGE電泳與標(biāo)準(zhǔn)蛋白電泳觀察結(jié)果和Gel Pro Analysis軟件分析電泳結(jié)果，可為研究SE理化性質(zhì)和酶活等奠定基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果表明，牛樟芝se最佳誘導(dǎo)條件為IPTG終濃度為02 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為7 h，誘導(dǎo)溫度為26 ℃，誘導(dǎo)的主次因素為時(shí)間、溫度和IPTG終濃度，它對(duì)于大量蛋白樣品的收集具有指導(dǎo)意義，為se高效表達(dá)及后續(xù)功能驗(yàn)證奠定了良好的基礎(chǔ)。

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