李雪　安勝軍　邵鐵梅

摘要：為了建立高效亞麻愈傷組織誘導(dǎo)體系，對(duì)亞麻的無(wú)菌苗培養(yǎng)、外植體愈傷組織誘導(dǎo)、愈傷組織繼代擴(kuò)增3個(gè)方面進(jìn)行了研究。同時(shí)對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)亞麻愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了初步探索。結(jié)果表明，亞麻無(wú)菌苗接種培養(yǎng)基為MSB+1 mg/L 6-BA時(shí)有利于亞麻愈傷組織出愈，適合亞麻愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為MSB+01 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA，或在此基礎(chǔ)上添加10 mg/L 2，4-D，2種培養(yǎng)基在愈傷組織誘導(dǎo)階段差別不大。愈傷組織繼代擴(kuò)增培養(yǎng)基為MSB+01 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA，在此培養(yǎng)基上，愈傷組織量在25 d時(shí)達(dá)到頂峰。由抗生素抗性試驗(yàn)得出亞麻愈傷組織卡那霉素抗性臨界值為100 mg/L。亞麻愈傷組織轉(zhuǎn)化的方式為浸泡材料15 min后抽真空5 min較好，遺傳轉(zhuǎn)化率為31%。經(jīng)PCR分析驗(yàn)證，證明阿樸脂蛋白米蘭突變體外源基因已經(jīng)整合至亞麻抗性愈傷組織基因組中。

關(guān)鍵詞：亞麻；愈傷組織；遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類(lèi)號(hào)： S5632043文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1002-1302（2017）16-0046-04

收稿日期：2017-01-20

基金項(xiàng)目：河北省教育廳高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（編號(hào)：ZD2014087）；河北省教育廳項(xiàng)目（編號(hào)：Z2015214）。

作者簡(jiǎn)介：李雪（1979—），女，河北趙縣人，碩士，講師，從事植物生物反應(yīng)器的研究。E-mail：lixue712@126com。

通信作者：安勝軍，博士，教授，從事動(dòng)物細(xì)胞方面及蛋白類(lèi)藥物的研究與開(kāi)發(fā)。E-mail：sjsjan@126com。

亞麻是一種古老的栽培植物，包含13個(gè)屬300個(gè)種，主要于纖維用、油用、藥用等方面。亞麻是高度自花授粉作物，常規(guī)育種方法耗時(shí)且受到遺傳資源有限和近親雜交的障礙[3]，因此基因工程新技術(shù)應(yīng)用于亞麻植物上勢(shì)在必行，而基因工程新技術(shù)的發(fā)展離不開(kāi)植物愈傷組織快速誘導(dǎo)體系的建立。

自1975年至今，愈傷組織誘導(dǎo)在很多植物上均有研究，最早的有水稻[4]、楊樹(shù)[5]、甘蔗、大蒜、小麥[8]、紅豆杉[9]、大麥[10]、火龍果[11]、桑樹(shù)[12]等，且取得了成功。有關(guān)亞麻的愈傷組織誘導(dǎo)報(bào)道較少，國(guó)外亞麻組織培養(yǎng)方面的研究多集中在亞麻花藥愈傷培養(yǎng)上[13-16]，操作難度大，影響因素多，且重復(fù)性差。趙瑋等發(fā)表的有關(guān)亞麻下胚軸愈傷的研究[17]，在本實(shí)驗(yàn)室未能很好的重復(fù)再現(xiàn)。同一基因型不同操作手法結(jié)果的差異，限制了亞麻愈傷組織誘導(dǎo)及基因轉(zhuǎn)化的發(fā)展。研究亞麻愈傷組織誘導(dǎo)及轉(zhuǎn)化，目的是以愈傷組織作為植物生物反應(yīng)器原材料，轉(zhuǎn)入分泌型的外源基因，提取抗性愈傷組織的蛋白，用于后續(xù)的基因工程研究。

本研究對(duì)亞麻品種隴亞10號(hào)下胚軸進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，探索愈傷組織誘導(dǎo)、擴(kuò)繁增殖的條件，并建立了亞麻愈傷組織的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，初步確定了基因轉(zhuǎn)化的條件，以期建立快速生長(zhǎng)且可重復(fù)的亞麻轉(zhuǎn)基因愈傷組織誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系，從而為亞麻基因轉(zhuǎn)化工程發(fā)展提供參考。

1材料與方法

亞麻種子隴亞10號(hào)由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

11種子消毒方法

挑選無(wú)破損的亞麻種子，75%乙醇消毒1 min，5%次氯酸鈉溶液消毒5 min，無(wú)菌水洗滌4次，沖洗干凈后浸泡無(wú)菌水中，置搖床上過(guò)夜萌發(fā)備用。培養(yǎng)基：所有的培養(yǎng)基均以MS[18]為基本培養(yǎng)基。

12無(wú)菌苗種植方法

將萌發(fā)好的種子接種于無(wú)菌苗生長(zhǎng)培養(yǎng)基上，無(wú)菌苗生長(zhǎng)培養(yǎng)基分別為MSB、MSB+1 mg/L 6-BA。

13下胚軸誘導(dǎo)愈傷方法

待無(wú)菌苗長(zhǎng)至5～7 cm時(shí)，切其下胚軸，切為05～10 cm 的小段，分別放置下胚軸誘導(dǎo)愈傷的培養(yǎng)基上。每次接種50小段，水平試驗(yàn)重復(fù)4次，使總接種量達(dá)到200小段左右。通過(guò)查閱資料，設(shè)置下胚軸誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基附加不同濃度、種類(lèi)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（表1）。在（25±1）℃下暗培養(yǎng)7～14 d觀(guān)察外植體的形態(tài)變化，25 d后統(tǒng)計(jì)外植體出愈率。

14愈傷組織生長(zhǎng)曲線(xiàn)的制定方法

愈傷從誘導(dǎo)開(kāi)始，中間繼代2次后得到生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織。以此為基礎(chǔ)，相同鮮質(zhì)量09 g的愈傷組織接種于固體培養(yǎng)基，共接種12瓶。暗培養(yǎng)，每隔2 d取1瓶，測(cè)定愈傷組織鮮質(zhì)量，直至24 d。水平試驗(yàn)重復(fù)1次，用2次鮮質(zhì)量平均增長(zhǎng)值制定亞麻愈傷組織生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

15繼代擴(kuò)增愈傷組織最適培養(yǎng)基的選定方法

篩選愈傷生長(zhǎng)外觀(guān)及形態(tài)均相似的2種培養(yǎng)基，采用上述方法制作愈傷組織生長(zhǎng)曲線(xiàn)，最終確定繼代擴(kuò)增愈傷組織的最佳培養(yǎng)基。

16亞麻愈傷組織對(duì)抗生素的敏感性試驗(yàn)

含卡那霉素的培養(yǎng)基制備，分別為卡那霉素10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 mg/L處理各3瓶，共30瓶，則為3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)。每瓶均接種鮮質(zhì)量1 g生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織，25 d后測(cè)量每瓶的鮮質(zhì)量增長(zhǎng)量，選取鮮質(zhì)量未增長(zhǎng)且減少的同一組處理，為愈傷組織的卡那霉素抗性臨界值。

17外源基因基于愈傷組織的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法

阿樸脂蛋白米蘭突變體基因命名為T(mén)A，含NPTII報(bào)告基因的質(zhì)粒雙元表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)中心構(gòu)建提供。侵染方法、時(shí)間等見(jiàn)表2。

注：農(nóng)桿菌D值均為04～06。[HT][FK）]

侵染后，共培養(yǎng)3 d、抑菌培養(yǎng)7 d，抑菌用頭孢噻肟鈉工作濃度為300 mg/L。然后進(jìn)入培養(yǎng)基抗性篩選階段。

18抗性愈傷組織的繼代培養(yǎng)及PCR鑒定

選取抗性愈傷繼代3次，確定無(wú)農(nóng)桿菌污染后，進(jìn)行外源基因PCR分析。提取抗性愈傷的基因組DNA，以未轉(zhuǎn)化的普通愈傷組織基因組DNA為陰性對(duì)照，阿樸脂蛋白米蘭突變體基因的質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照。設(shè)計(jì)阿樸脂蛋白米蘭突變體基因的擴(kuò)增引物，引物命名為：endprint

其中1、2擴(kuò)增阿樸脂蛋白的目的片段長(zhǎng)度為750 bp，2、3擴(kuò)增阿樸脂蛋白目的片段連接信號(hào)肽的長(zhǎng)度為840 bp，4、5擴(kuò)增阿樸脂蛋白目的片段連接信號(hào)肽、啟動(dòng)子后的總長(zhǎng)為 2 070 bp。

擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min、95 ℃ 1 min、60 ℃ 1 min、72 ℃ 50 s、72 ℃ 10 min，30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后，采用 14%～16%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

2結(jié)果與分析

21亞麻外植體培養(yǎng)

無(wú)菌苗生長(zhǎng)的2種培養(yǎng)基，添加6-BA的培養(yǎng)基上無(wú)菌苗下胚軸不僅外觀(guān)形態(tài)較未添加的粗短，而且下胚軸誘導(dǎo)出愈時(shí)間較未添加的早，因此在誘導(dǎo)愈傷組織的外植體培養(yǎng)上，應(yīng)選擇添加6-BA細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基。

22誘導(dǎo)愈傷

接種在不同培養(yǎng)基上的外植體出愈率、出根率、愈傷表披白霜率等見(jiàn)表3，采用DPS數(shù)據(jù)分析。結(jié)果表明，出愈率方面，培養(yǎng)基A5、A10與其他13種培養(yǎng)基有顯著差異，而這13種培養(yǎng)基間沒(méi)有明顯差異，出愈率均較高。在出芽率方面，幾種培養(yǎng)基間差異較大，其中A8、A9、A10培養(yǎng)基沒(méi)有芽發(fā)生，A2、A7、A14培養(yǎng)基芽發(fā)生率較低，芽發(fā)生率最高的為A4培養(yǎng)基。出根率，幾種培養(yǎng)基間也有顯著差異。A7、A8、A9、A10培養(yǎng)基沒(méi)有根發(fā)生，A2、A5、A14培養(yǎng)基根發(fā)生率較低，生根率最高的為A1培養(yǎng)基。愈傷表披白霜率方面，A0、A1、A2、A3、A4、A5、A6、A11、A12、A13、A14培養(yǎng)基上的愈傷組織沒(méi)有出現(xiàn)白霜，A7培養(yǎng)基上的愈傷組織白霜率最高。15種培養(yǎng)基上的愈傷組織顏色呈現(xiàn)2種，分別為黃色、黃白色，愈傷組織顏色好的培養(yǎng)基為A0、A1、A2、A3、A4、A5、A6、A11、A12、A13、A14，不好的培養(yǎng)基為A7、A8、A9、A10。不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的愈傷組織狀態(tài)，是衡量培養(yǎng)基合適與否的一個(gè)重要指標(biāo)，從表3可以看出，A2、A14培養(yǎng)基培養(yǎng)的愈傷組織狀態(tài)最好，A7、A8、A9、A10培養(yǎng)基培養(yǎng)愈傷組織的狀態(tài)最差。綜合考慮各方面因素，亞麻誘導(dǎo)愈傷組織適合的培養(yǎng)基為A2、A14。

23愈傷組織生長(zhǎng)曲線(xiàn)的制定

由不同培養(yǎng)天數(shù)亞麻愈傷組織的鮮質(zhì)量增殖量，建立了亞麻愈傷組織的生長(zhǎng)曲線(xiàn)（圖1），2種培養(yǎng)基愈傷組織的生長(zhǎng)曲線(xiàn)均呈S形。從亞麻的愈傷組織生長(zhǎng)曲線(xiàn)可以看出，2種培養(yǎng)基上的愈傷組織在0～7 d時(shí)呈現(xiàn)緩慢生長(zhǎng)。從7 d開(kāi)始，A2培養(yǎng)基上的愈傷進(jìn)入快速增長(zhǎng)期，至25 d達(dá)到頂峰，25 d后愈傷組織生長(zhǎng)量開(kāi)始下降。A14培養(yǎng)基上的愈傷組織，從7 d開(kāi)始也進(jìn)入快速增長(zhǎng)期，至28 d時(shí)達(dá)到頂峰，但 17～28 d期間，愈傷組織呈現(xiàn)平穩(wěn)緩慢增長(zhǎng)，28 d后愈傷組織生長(zhǎng)量開(kāi)始下降。從圖1可以看出，A2、A14 2種培養(yǎng)基上的愈傷組織生長(zhǎng)達(dá)到頂峰時(shí)的愈傷組織增長(zhǎng)量和時(shí)間有明顯的差異，A2培養(yǎng)基明顯優(yōu)于A(yíng)14培養(yǎng)基，因此選定A2培養(yǎng)基為亞麻愈傷組織繼代擴(kuò)增的最適培養(yǎng)基。

24卡那霉素臨界濃度值確定

從圖2可以看出，卡那霉素的濃度變化對(duì)亞麻愈傷組織的增殖量有明顯的抑制作用。隨著卡那霉素的濃度增加，亞麻愈傷組織生長(zhǎng)的增殖量會(huì)相應(yīng)減少。當(dāng)卡那霉素濃度達(dá)到

100 mg/L 時(shí)，亞麻愈傷組織出現(xiàn)了負(fù)增長(zhǎng)的現(xiàn)象，即25 d后亞麻愈傷組織鮮質(zhì)量比初接種時(shí)鮮質(zhì)量減少了021 g，因此，當(dāng)侵染亞麻愈傷組織時(shí)，卡那霉素100 mg/L為抗性篩選濃度。

[FK（W11][TPLX2tif][FK）]

25愈傷組織的轉(zhuǎn)化分析

從表4可以看出，7種侵染方式中，只有A、B、D 3種方式能夠得到抗性愈傷，且侵染后愈傷組織的顏色會(huì)有差別。農(nóng)桿菌與愈傷組織浸泡過(guò)夜后得到的愈傷均為灰白色，其他2種方式得到的愈傷組織為黃褐色和紅褐色。其中，抗性愈傷能夠在褐色愈傷組織上生長(zhǎng)出白色愈傷組織（圖3）。A、B、D 3種方式的轉(zhuǎn)化率各不相同，以B方式最高，為31%。而A、D 2種方式的轉(zhuǎn)化率分別為267%、164%。因此，在用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化亞麻愈傷組織時(shí)，適宜采用B方式轉(zhuǎn)化，即對(duì)受體材料采取農(nóng)桿菌菌液浸泡15 min，然后5 min抽真空處理轉(zhuǎn)化方式較好。

26PCR分析

PCR擴(kuò)增結(jié)果（圖4）表明，隨機(jī)選取的抗性愈傷組織均擴(kuò)增到和陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒同樣大小的片段。阿樸脂蛋白的目的片段長(zhǎng)度為750 bp，阿樸脂蛋白目的片段連接信號(hào)肽的長(zhǎng)度為 840 bp，阿樸脂蛋白目的片段連接信號(hào)肽、啟動(dòng)子后的總長(zhǎng)為2 070 bp，樣品和質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照片段大小均一致，且由于提取基因組DNA的樣品為經(jīng)過(guò)3次繼代后的抗性愈傷組織材料，表明外源基因已經(jīng)隨機(jī)整合到亞麻愈傷組織基因組DNA中，且穩(wěn)定遺傳。

3討論與結(jié)論

本研究在無(wú)菌苗培養(yǎng)階段，加入了植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，結(jié)果縮短了亞麻下胚軸的出愈時(shí)間，為獲得基因轉(zhuǎn)化的原材料節(jié)約了時(shí)間，以便能快速得到轉(zhuǎn)基因抗性材料，目前，還未見(jiàn)亞麻組培愈傷組織誘導(dǎo)在無(wú)菌苗培養(yǎng)階段進(jìn)行處理的報(bào)道。

Horsch等在植物轉(zhuǎn)化上采用了葉片浸泡法[18]，本研究選擇的是愈傷組織浸泡、超聲或抽真空處理的轉(zhuǎn)化方法，這在愈傷組織轉(zhuǎn)化上屬于新創(chuàng)。本研究發(fā)現(xiàn)抽真空處理提高了愈傷組織的轉(zhuǎn)化率，但總體來(lái)說(shuō)愈傷組織轉(zhuǎn)化率偏低，因此，提高愈傷組織轉(zhuǎn)化率方法還有待繼續(xù)研究。

選擇標(biāo)記基因最早于1989年，McHughen將選擇標(biāo)記基因應(yīng)用在亞麻植物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)化中，并且獲得了成功[19]。本研究起初設(shè)計(jì)了潮霉素抗性基因，鑒于植物愈傷組織量大且使用抗生素造價(jià)問(wèn)題，所以再次設(shè)計(jì)了卡那霉素抗性基因。同時(shí)，選擇標(biāo)記基因的臨界濃度值對(duì)于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的篩選至關(guān)重要，植物愈傷組織抗生素抗性臨界濃度值的確定不直觀(guān)，為了得到準(zhǔn)確的愈傷組織抗生素抗性臨界濃度值，本研究采取了定期稱(chēng)量愈傷組織增殖量的方法，多次重復(fù)以得到精準(zhǔn)的卡那霉素抗性臨界濃度值，期望在以后研究出簡(jiǎn)單實(shí)用適合植物愈傷組織篩選的抗生素濃度確定方法。endprint

在進(jìn)行PCR分析時(shí)，一般僅需擴(kuò)增轉(zhuǎn)入外源基因的目的片段即可，但在本試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，為了減少擴(kuò)增結(jié)果假陽(yáng)性的概率，同時(shí)進(jìn)行了阿樸脂蛋白目的片段、阿樸脂蛋白目的片段和連接的信號(hào)肽、阿樸脂蛋白目的片段連接信號(hào)肽和啟動(dòng)子，層層遞進(jìn)式擴(kuò)增，最終證明整個(gè)表達(dá)盒已經(jīng)整合進(jìn)抗性愈傷組織的基因組DNA中，保證了本試驗(yàn)的嚴(yán)謹(jǐn)性。

本研究以隴亞10號(hào)下胚軸為外植體，摸索到適合隴亞10號(hào)愈傷誘導(dǎo)和繼代擴(kuò)增的最佳培養(yǎng)基，建立了隴亞10號(hào)高效愈傷組織誘導(dǎo)體系。以愈傷組織為受體材料，研究了農(nóng)桿菌介導(dǎo)愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化條件，確定了轉(zhuǎn)化愈傷組織最佳的農(nóng)桿菌侵染時(shí)間和方式，而且篩選到合適的抗生素臨界濃度。同時(shí)采用抗生素篩選和PCR電泳檢測(cè)雙重驗(yàn)證了外源基因于愈傷組織基因組DNA中的整合。

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