李翔宇+馬慧+焦冠儒+楊宏黎

摘要：以麩皮為原料，以枯草芽孢桿菌和康氏木霉為菌種，以粗蛋白含量為指標，采用正交試驗的方法，研究單菌和混菌固體發(fā)酵生產(chǎn)微生態(tài)蛋白飼料的條件。結(jié)果表明，混菌發(fā)酵的最佳工藝條件為：發(fā)酵溫度32 ℃，含水量20%，接種比例（康氏木霉：枯草芽孢桿菌）1‥3，發(fā)酵時間72 h。

關(guān)鍵詞：麩皮；正交試驗；工藝；粗蛋白

中圖分類號：S816.31 文獻標識碼：A 文章編號：1674-1161（2017）07-0048-04

我國是小麥種植大國，在小麥的加工中，麩皮的產(chǎn)量約占小麥加工量的20%?，F(xiàn)代制粉工藝多采用脫麥胚處理以獲得比較純凈的小麥麩皮。麩皮的主要成分是粗纖維，經(jīng)固態(tài)發(fā)酵后，營養(yǎng)價值顯著提高，發(fā)酵產(chǎn)物無不良氣味且略帶醇香，同時，粗蛋白和粗纖維含量亦可達到蛋白飼料的標準，是一種新型的發(fā)酵蛋白飼料，具有一定的應(yīng)用價值。以枯草芽孢桿菌和康氏木霉為菌種，以粗蛋白含量為指標，研究單菌和混菌固體發(fā)酵對蛋白飼料質(zhì)量的影響，旨在探討麩皮生產(chǎn)微生態(tài)蛋白飼料的最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 菌種

康氏木霉和枯草芽孢桿菌，購于西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 PDA培養(yǎng)基 馬鈴薯洗凈去皮，稱取200 g切成大小適中的方塊，煮20～30 min（筷子一戳即入即可）。然后，取八層紗布過濾、加熱，加葡萄糖20 g、磷酸二氫鉀3 g、硫酸鎂1.5 g，以及適量的瓊脂粉、維生素B1。繼續(xù)加熱并攪拌混勻，稍冷卻后補足水分至

1 000 mL，分裝，于121 ℃滅菌30 min，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，確定無菌生長后方可使用。

1.2.2 固體培養(yǎng)基 稱取麩皮適量，加入適量溫水和其他微量元素，攪拌混勻，分裝入500 mL錐形瓶，用棉塞塞緊瓶口，于121 ℃滅菌30 min，冷卻，備用。

1.3 試驗方法

在60 g麩皮中加適量水，添加葡萄糖和適量有機元素，滅菌，制得發(fā)酵培養(yǎng)基。此后接入在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h的菌種，在一定條件下培養(yǎng)一定時間后，于60 ℃低溫烘干，測定其成分變化。發(fā)酵工藝路線如圖1所示。

1.3.1 單菌發(fā)酵試驗 進行單菌發(fā)酵試驗，改變發(fā)酵溫度、含水量、接種量及發(fā)酵時間等條件，測定發(fā)酵物粗蛋白質(zhì)變化情況，確定最佳條件。

1.3.2 混菌發(fā)酵試驗 由兩種菌種（康氏木霉和枯草芽孢桿菌）進行混菌發(fā)酵，改變菌種比例、培養(yǎng)基含水量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時間等條件，測定粗蛋白質(zhì)含量，確定最佳試驗條件。

1.4 測定方法

采用凱氏定氮法測定樣品中的蛋白質(zhì)含量。

1.5 正交試驗設(shè)計

正交試驗的水平及因素見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單菌發(fā)酵

2.1.1 發(fā)酵溫度對蛋白質(zhì)含量的影響 發(fā)酵溫度對微生物存活與生長具有重要作用。溫度升高會使微生物細胞的生長速率加快，但蛋白質(zhì)和核酸對溫度極其敏感，高溫會使蛋白質(zhì)變性，降低微生物繁殖速度；過低溫度會抑制酶活性，降低蛋白質(zhì)合成速率，因此，適宜的溫度對發(fā)酵過程具有重要意義。在15%接種量、培養(yǎng)時間48 h、加水量30%、pH值自然的條件下，改變培養(yǎng)溫度（28，30，32，34，36 ℃），考察溫度對粗蛋白含量的影響，結(jié)果如圖2所示。

試驗結(jié)果表明：分別以康氏木霉、枯草芽孢桿菌為菌種單菌發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)含量隨發(fā)酵溫度升高而升高；溫度繼續(xù)提高，發(fā)酵產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)含量有下降趨勢。結(jié)合實際情況，確定康氏木霉的最佳發(fā)酵溫度為32 ℃、枯草芽孢桿菌的最佳發(fā)酵溫度為30 ℃。

2.1.2 加水量對蛋白質(zhì)含量的影響 加水量是發(fā)酵的關(guān)鍵因素之一。在發(fā)酵過程中，如果含水量過低，則菌體無法正常生長發(fā)育；而加水過多，則會造成傳質(zhì)和傳氧困難，增加生產(chǎn)成本。在15%接種量、培養(yǎng)48 h、培養(yǎng)溫度固定（康氏木霉32 ℃；枯草芽孢桿菌30 ℃）、pH值自然的條件下，改變含水量（20%，40%，60%，80%及100%），將產(chǎn)物在60 ℃下烘干至恒質(zhì)量，測定其粗蛋白含量，結(jié)果見圖3。

由圖3可看出：隨著水分的增加，發(fā)酵產(chǎn)物中的粗蛋白含量逐步增加；加水量為40%時，蛋白質(zhì)含量達最大值（康氏木霉為15.76%，枯草芽孢桿菌為14.93%）；但當(dāng)水分含量增加至60%時，蛋白質(zhì)含量反而有所下降，且發(fā)酵物稍有霉味。這可能是由于水分含量高造成發(fā)酵物粘度過大，從而致使發(fā)酵物通透性差。發(fā)酵溫度上升過高不利于菌體生長，致使發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量明顯下降。

2.1.3 接種量對蛋白質(zhì)含量的影響 接種量可根據(jù)菌種繁殖速度確定。接入的菌種量較大，可以縮短菌絲繁殖的峰值時間，使產(chǎn)物的合成期提前，但會造成菌絲生長過快及培養(yǎng)基黏度增大，使溶解氧含量偏低，細胞衰老加快，影響發(fā)酵后勁，進而影響產(chǎn)物合成。接種量過少，會延長發(fā)酵周期，增加雜菌污染機會。

在培養(yǎng)時間48 h、培養(yǎng)溫度固定（康氏木霉32 ℃；枯草芽孢桿菌30 ℃）、加水量20%、pH值自然的條件下，改變接種量（0，5%，10%，15%，20%，25%，30%），將產(chǎn)物在60 ℃下烘干至恒質(zhì)量，分析測定粗蛋白含量，結(jié)果見圖4。

由圖4可以看出，康氏木霉菌及枯草芽孢桿菌的接種量從5%增至15%，以及由15%增至20%，粗蛋白的含量均有顯著增加；由20%增至25%時，粗蛋白含量沒有明顯變化。因此，康氏木霉及枯草芽孢桿菌的最佳培養(yǎng)基接種量均為20%。

2.1.4 發(fā)酵時間對蛋白質(zhì)含量的影響 在發(fā)酵過程中，發(fā)酵終點對蛋白含量提高具有重要意義。一般來說，發(fā)酵初期，粗蛋白含量隨發(fā)酵時間延長而提高；到產(chǎn)品穩(wěn)定期，粗蛋白含量基本保持恒定，此時應(yīng)停止發(fā)酵；進入衰退期后，由于微生物自溶，產(chǎn)品的粗蛋白含量會逐漸降低，可能造成雜菌污染，影響產(chǎn)品品質(zhì)，且增加生產(chǎn)成本。因此，在實際生產(chǎn)中，發(fā)酵時間應(yīng)根據(jù)實際情況確定。endprint

在接種量20%、培養(yǎng)溫度固定（康氏木霉32 ℃，枯草芽孢桿菌30 ℃）、pH值自然、含水量30%的條件下，改變培養(yǎng)時間（24，48，72，96 h），將產(chǎn)物在60 ℃下烘干至恒質(zhì)量，分析測定粗蛋白含量，結(jié)果見圖5。

由圖5可以看出：從發(fā)酵起至72 h，隨著發(fā)酵時間的延長，2種菌種發(fā)酵產(chǎn)物中的粗蛋白含量均持續(xù)顯著增加；當(dāng)發(fā)酵時間超過72 h后，粗蛋白含量無明顯提高?？紤]生產(chǎn)成本和經(jīng)濟效益，確定發(fā)酵時間為72 h。

2.2 混菌發(fā)酵正交試驗結(jié)果

選擇發(fā)酵溫度、含水量、接種比例（康氏木霉和枯草芽孢桿菌）和發(fā)酵時間4個因素為自變量，設(shè)計四因素三水平正交試驗，詳見表2。

從表2直觀分析可以看出：極值R的大小順序為RD>RA>RB>RC，即各因素對粗蛋白含量影響順序：發(fā)酵時間>發(fā)酵溫度>含水量>接種比例；最佳組合D3A2B2C3，即發(fā)酵時間72 h，發(fā)酵溫度32 ℃，含水量20%，接種比例3‥1。

3 結(jié)論與討論

試驗結(jié)果表明：1） 在接種量20%、加水量40%、（康氏木霉32 ℃，枯草芽孢桿菌30 ℃）培養(yǎng)72 h的條件下，單菌發(fā)酵的粗蛋白質(zhì)含量達峰值；2） 從實驗室保存的霉菌中篩選出一株產(chǎn)纖維素酶活力較高的康氏木霉，將其與枯草芽孢桿菌進行混菌發(fā)酵，通過優(yōu)化混菌固態(tài)發(fā)酵麩皮工藝，確定最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵時間72 h，發(fā)酵溫度32 ℃，含水量20%，接種比例3‥1；3） 固態(tài)發(fā)酵的麩皮己經(jīng)達到蛋白飼料的產(chǎn)品標準。

在枯草芽孢桿菌和康氏木霉混合發(fā)酵試驗中，若康氏木霉的比例較高，產(chǎn)物中的粗蛋白含量高于單菌發(fā)酵；若枯草芽孢桿菌的比例較高，產(chǎn)物中的粗蛋白含量較單菌發(fā)酵低，抑制康氏木霉生長。枯草芽孢桿菌作為一種重要益生菌，有改善畜禽內(nèi)環(huán)境的重要作用，所以在發(fā)酵后期作為混合菌株加入，不僅可產(chǎn)生足夠的益生菌，還能避免菌種間的相互抑制作用。

發(fā)酵過程中，發(fā)酵時間、溫度對發(fā)酵有顯著影響，其中發(fā)酵時間是首要因素。在試驗中，發(fā)酵24 h的固體培養(yǎng)基外觀上沒有太大變化，但蛋白酶活力較高；發(fā)酵48 h后，固體培養(yǎng)基發(fā)生明顯變化，康氏木霉固體培養(yǎng)基為綠色；當(dāng)發(fā)酵進行72 h時，固體發(fā)酵培養(yǎng)基由開始的松軟變得板結(jié)、堅硬，康氏木霉固體培養(yǎng)基顏色變化不大，粗蛋白含量基本達到峰值，但隨著時間推移，粗蛋白含量變化不明顯甚至降低。因為隨著發(fā)酵時間的延長，固體發(fā)酵基質(zhì)在不斷被消耗。

參考文獻

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Abstract： In this paper， the wheat bran used as raw material， bacillus subtilis and trichoderma koningii as culture and the crude protein content as the index， and the orthogonal experimental method was used to study the conditions for producing solid fermenting microbial protein feed bysingle bacterium and mixed bacteria solid. The optimum conditions of mixed fermentation： 32 ℃ of fermentation temperature， 20% of water content， 1‥3 of inoculation ratio （trichoderma koningi： bacillus subtilis） and 72 h of fermentation time.

Key words： bran； orthogonal experiment； technology； crude proteinendprint