董 堯 王前勇 （武漢市農(nóng)業(yè)學(xué)校 湖北 武漢 430043）

試驗研究

金黃色葡萄球菌的耐藥性分析

董 堯 王前勇 （武漢市農(nóng)業(yè)學(xué)校 湖北 武漢 430043）

為調(diào)查金黃色葡萄球菌的耐藥性現(xiàn)狀，用世界衛(wèi)生組織(WTO)推進(jìn)的Kirby-Bauer法，完成11株金黃色葡萄球菌對林可霉素、頭孢氨芐、丁胺卡那霉素、青霉素G、恩諾沙星、慶大霉素、萬古霉素、復(fù)方新諾明、氨芐青霉素、氟哌酸、紅霉素、阿莫西林12種抗菌藥的藥敏試驗，試驗按美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(NCCLS)1999年版標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。結(jié)果表明：金黃色葡萄球菌對萬古霉素100%敏感，對頭孢氨芐和丁胺卡那霉素的敏感程度僅次于萬古霉素。但是對β-內(nèi)酰胺類抗生素幾乎全部耐藥。對林可霉素、恩諾沙星、慶大霉素、復(fù)方新諾明、氟哌酸、紅霉素的耐藥率分別為63.6%、36.4%、9.1%、45.5%、63.6%、81.8%。

金黃色葡萄球菌 耐藥性 抗生素

由于抗菌藥的廣泛使用，導(dǎo)致耐藥菌株的不斷增加，尤其是廣譜抗菌藥的濫用，造成了耐藥突變株的大量出現(xiàn)。從而使經(jīng)驗用藥失敗率增高，重癥感染因抗菌藥物劑量不足，而延誤治療，或盲目加大劑量造成中毒。細(xì)菌的耐藥性不斷增加，使臨床用藥愈顯棘手。

在獸醫(yī)領(lǐng)域，臨床上許多動物疾病，在沒有得到確診的情況下，就大劑量使用廣譜抗菌藥，因而造成細(xì)菌耐藥性的普遍存在[1]。而在規(guī)?；B(yǎng)殖場生產(chǎn)中，抗菌藥長期作為預(yù)防藥物使用，這樣便為細(xì)菌耐藥性的增強(qiáng)，提供了便利的“溫床”。如此，一旦規(guī)?；B(yǎng)殖場中爆發(fā)流行性疾病，便會在抗菌藥的選用以及抗菌藥劑量的選擇上，很難做出判斷。這樣便需要對細(xì)菌的耐藥性做好監(jiān)測和分析，以便了解抗菌藥對其的臨床治療效果[2]。而金黃色葡萄球菌無論是在臨床還是規(guī)?；B(yǎng)殖生產(chǎn)中，都讓人覺得棘手的病原菌。由于其耐藥機(jī)制復(fù)雜，耐藥譜廣，耐藥突變株多等諸多性質(zhì)，使對其耐藥性監(jiān)測顯得更為重要[3]。因而可以利用藥敏試驗對金黃色葡萄球菌進(jìn)行耐藥性監(jiān)測，以此為臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株 11株金黃色葡萄球菌菌株分別從不同地區(qū)的臨床標(biāo)本中分離，純培養(yǎng)后得到。其中豬源6株，氣源2株，雞源1株，羊源1株。

1.1.2 質(zhì)控菌株 金黃色葡萄球菌ATCC25923，由中國藥品檢察所提供。

1.1.3 抗菌藥紙片 林可霉素Lincomycin(30μg/片)，頭孢氨芐Cefalexin(30μg/片)，丁胺卡那霉素Amikacin(30μg/片)，青霉素G Penicillin(10U/片)，恩諾沙星Enfloxacin(5μg/片)，慶大霉素Gentamycin(10μg/片)，萬古霉素Vancomycin(30μg/片)，復(fù)方新諾明SMZ/TMP(23.75/1.25g/片)，氨芐青霉素Ampicillin(10μg/片)，氟哌酸Norfloxacin(10μg/片)，紅霉素Erythromycin(15μg/片)，阿莫西林Amoxicillin(10μg/片)12種抗菌藥紙片，由杭州天和微生物試劑有限公司提供，生產(chǎn)批號均為：20030417。零下20℃保存，有效期2年。

1.1.4 試劑 氯化鋇、1%硫酸、蛋白胨、牛肉浸膏等；MH肉湯，普通營養(yǎng)瓊脂由實驗室自制，MH瓊脂由杭州天和微生物試劑有限公司提供。

1.1.5 培養(yǎng)皿 直徑90mm的一次性塑料培養(yǎng)皿，環(huán)氧。

1.1.6 單糖發(fā)酵管和麥?zhǔn)媳葷峁?6種單糖發(fā)酵管：蕈糖、甘露醇、松二糖、纖維二糖、木糖、麥芽糖、蔗糖，現(xiàn)購自杭州天和微生物試劑有限公司。0.5號麥?zhǔn)媳葷峁苡杀緦嶒炇易灾啤?/p>

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌鑒定 取純培養(yǎng)菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，根據(jù)其染色及形態(tài)特征，做血漿凝固酶，甘露醇發(fā)酵試驗等生化鑒定。

1.2.2 質(zhì)量控制試驗[4]質(zhì)量控制試驗是在藥敏試驗相同條件下，同樣采取Kirby-Bauer法進(jìn)行質(zhì)控菌株的藥敏試驗。

1.2.3 藥敏試驗 采用Kirby-Bauer[4,5]。（1）增菌液的制備：可溶性淀粉1.5g，酸水解酪蛋白17.5g，牛肉膏6g，蒸餾水1000ml。將上述成分混合，校正pH値至7.2～7.4，121℃15min高壓滅菌后，4℃冰箱保存，使用1個月。（2）0.5號麥?zhǔn)媳葷峁苤苽洌涸?0ml的小試管中，將1%氯化鋇0.5ml和1%硫酸9.5ml充分混合后，即成相當(dāng)于10 ℃ C FU/ml 的菌濃度。在使用時應(yīng)充分搖勻。（3）MH瓊脂平板的制備：臨用時，取36gMH瓊脂粉，加1000ml蒸餾水混合，校正pH值至7.2～7.4，121℃15min高壓滅菌后，冷卻至45℃左右，傾注培養(yǎng)皿，培養(yǎng)基厚度為4mm，凝固備用。（4）藥敏試驗：在已分純的待測菌平板上挑取4～5個直徑約1mm左右的菌落接種到3～5mlMH肉湯中，35℃培養(yǎng)6～8h。用無菌生理鹽水校正菌液濁度汁0.5麥?zhǔn)媳葷峁軜?biāo)準(zhǔn)，菌液校正后應(yīng)在15min內(nèi)接種完成。無菌棉拭子蘸取菌液，在MH平板表面均勻涂布接種3次，每次旋轉(zhuǎn)平板60度，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周。涂布菌液的平板于室溫中干燥3～5min后，用無菌鑷子去藥敏紙片，貼于平板表面，并輕壓紙片，使其貼平。每張紙片的間距不應(yīng)少于24mm，紙片的中心距平板的邊緣不小于15mm，90mm的平板貼6張為宜。將貼好的紙片的平板置于35℃孵育18～24h后，用游標(biāo)卡尺量取抑菌圈直徑。將所測得抑菌圈直徑，與NCCLS1999年公布的相應(yīng)抗生素敏感性判定標(biāo)準(zhǔn)比較，判定結(jié)果為敏感（s)、耐藥(R)或中度敏感(I)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌鑒定結(jié)果

取純培養(yǎng)菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢，鏡下均呈現(xiàn)藍(lán)紫色的(呈革蘭氏陽性著色的)葡萄串狀球菌[9]。生化鑒定結(jié)果：在血漿凝固酶試驗中，玻片法與試管法均變渾濁，呈陽性，見表1.

表1 細(xì)菌生化鑒定結(jié)果

2.2 質(zhì)量控制試驗結(jié)果

藥敏試驗應(yīng)NCCLS的要求在一周內(nèi)完成，在一周內(nèi)做3次質(zhì)量控制試驗，3次的質(zhì)控菌株藥敏試驗結(jié)果見表2，與質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)比較，結(jié)果均在控制范圍。

表2 質(zhì)量控制試驗結(jié)果及標(biāo)準(zhǔn)菌株質(zhì)控范圍 (mm)

2.3 試驗菌株藥敏試驗結(jié)果

所測得的12種抗菌藥對11株金黃色葡萄球菌的抑菌圈大小見表3。

表3 藥敏試驗結(jié)果(x±SD，n=6) (mm)

續(xù)表 藥敏試驗結(jié)果(x±SD，n=6) (mm)

12種抗生素對金黃色葡萄球菌的體外抗菌活性表明，僅萬古霉素敏感率為100%，對β-內(nèi)酰胺類抗生素幾乎全部耐藥。對林可霉素、恩諾沙星、慶大霉素、復(fù)方新諾明、氟哌酸紅霉素等的耐藥率分別為63.6%、36.4%、9.1%、45.5%、63.6%、81.8%。其中對頭孢氨芐、丁胺卡那霉素的敏感性程度也較高(見表4)。

表4 金黃色葡萄球菌的耐藥率

3 討論

3.1 方法的選擇與評價

Kirby-Baeur 法為世界衛(wèi)生組織推薦的體外抗菌藥物敏感性試驗的標(biāo)準(zhǔn)方法，它的優(yōu)點是操作方法簡單，試劑量較低，不需要特殊設(shè)備，易于人為判斷，可自由選擇抗菌藥物[10]。但是試驗必須標(biāo)準(zhǔn)化，即必須在NCCLS所規(guī)定的一系列標(biāo)準(zhǔn)下，進(jìn)行嚴(yán)格的試驗操作，以減少人為的失誤因素，以及避免抗菌藥擴(kuò)散早期的濃度梯度不穩(wěn)地性所產(chǎn)生的缺點。同時必須在統(tǒng)計學(xué)上與產(chǎn)生判定結(jié)果的抑菌圈直徑相關(guān)，才能對結(jié)果作出臨床意義的評價[11]。在抑菌圈直徑測量方面應(yīng)當(dāng)注意：在金黃色葡萄球菌對萬古霉素的抑菌圈內(nèi)允許有少量細(xì)菌的存在，在量取結(jié)果時，可忽略不計，以外圈為準(zhǔn)[12]。

3.2 金黃色葡萄球菌的耐藥機(jī)制

3.2.1 產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶 大部分金黃色葡萄球菌菌株能產(chǎn)生青霉素(一種β-內(nèi)酰胺酶)，β-內(nèi)酰胺酶早在β-內(nèi)酰胺類抗生素應(yīng)用于臨床前便已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，并不是細(xì)菌生長所必需的，因為其唯一功能是水解β-內(nèi)酰胺[13]。

3.2.2 PBP改變介導(dǎo)的細(xì)菌耐藥 PBP改變包括獲得新的對抗生素低親和力的PBP和本身發(fā)生修飾導(dǎo)致對抗生素低親和力的PBP，從而導(dǎo)致耐藥[13]。

3.2.3 DNA螺旋酶的改變 金黃色葡萄球菌在對喹諾酮類藥物耐藥時，易發(fā)生DNA螺旋酶的改變[14]。

3.2.4 主動外排系統(tǒng) 在金黃色葡萄球菌的細(xì)菌外膜上還有特殊的藥物泵出外排系統(tǒng)，使細(xì)菌內(nèi)的藥物濃度不足以發(fā)揮抗菌而導(dǎo)致耐藥[15]。

3.2.5 其它機(jī)制 金黃色葡萄球菌 可通過增加對抗菌藥物拮抗物的產(chǎn)量而耐藥[15]。

3.3 耐藥性研究的意義

（1）本組藥敏試驗結(jié)果顯示，金黃色葡萄球菌對常用抗生素藥物敏感性均呈下降趨勢，它對青霉素G、氨芐青霉素和阿莫西林的耐藥性的耐藥性率最高，幾乎都為100%。此類藥物均為β-內(nèi)酰胺類抗生素，說明金黃色葡萄球菌的耐藥即使仍是以產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶為主，因此臨床用藥時，一般不采用此類藥物[16]。而萬古霉素對金黃色葡萄球菌活性最佳，無1株耐藥。雖然如此，但體外實驗證實，高水平的萬古霉素耐藥性可從腸球菌轉(zhuǎn)移到金黃色葡萄球菌，且Noble已經(jīng)在實驗室構(gòu)建了耐萬古霉素金黃色葡萄球菌，其預(yù)示著金黃色葡萄球菌耐萬古霉素的可能性[17]。因此臨床應(yīng)用時不應(yīng)該把萬古霉素作為預(yù)防和常規(guī)治療金黃色葡萄球菌感染的首選要[18]。（2）在獸醫(yī)領(lǐng)域，由于目前許多現(xiàn)代化養(yǎng)殖場普遍使用抗菌藥物預(yù)防各類疾病，且使用抗菌藥物作為飼料添加劑，同時有不少養(yǎng)殖場發(fā)生疾病時，常不做藥敏試驗就主觀投藥，從而破壞了敏感菌株與耐藥菌株之間的細(xì)菌區(qū)系的菌態(tài)平衡，使敏感菌株受到抑制，耐藥菌株得以優(yōu)先繁殖。從本組藥敏試驗結(jié)果來看，金黃色葡萄球菌對某些藥物的耐藥性，雖然要比近年來人醫(yī)所檢測到的耐藥性要弱，但是因為對于細(xì)菌的耐藥性的重視程度，獸醫(yī)遠(yuǎn)不及人醫(yī)。那么如果常此以往，對付細(xì)菌耐藥性的工作，獸醫(yī)將比人醫(yī)更顯棘手。目前在細(xì)菌耐藥性監(jiān)測方面，人醫(yī)領(lǐng)域已經(jīng)較具規(guī)模，且正在不斷完善；在獸醫(yī)領(lǐng)域，監(jiān)測工作做得卻很不夠，所以應(yīng)該盡早在該領(lǐng)域做好耐藥菌的監(jiān)測與檢測，從而指導(dǎo)獸醫(yī)臨床用藥。

4 結(jié)論

本試驗嚴(yán)格按照NCCLS規(guī)定的一系列標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行實驗操作，所得數(shù)據(jù)真實、可靠。12種常用抗生素對金黃色葡萄球菌的體外抗菌活性表明，僅萬古霉素敏感率為100%，對β-內(nèi)酰胺類抗生素幾乎全部耐藥。對頭孢氨芐、丁胺卡那霉素的敏感率均為90.9%，而對林可霉素、恩諾沙星、慶大霉素、復(fù)方新諾明、氟哌酸、紅霉素等的耐藥率分別為63.6%、36.4%、9.1%、45.5%、63.6%、81.8%，所以，臨床選用藥物時應(yīng)盡量選擇頭孢氨芐、丁胺卡那霉素、慶大霉素等敏感藥物，但萬古霉素雖然極其敏感，卻不宜作為首選藥和臨床一線藥。

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