宋予震，董 青，邢廣旭，胡驍飛，呂全建，柳巨雄

(1.吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062； 2.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院 動物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046；3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物免疫學(xué)重點實驗室，河南 鄭州 450002)

免疫分析方法在磺胺類藥物殘留檢測中的應(yīng)用

宋予震1,2，董 青1,2，邢廣旭3，胡驍飛3，呂全建2，柳巨雄1*

(1.吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062； 2.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院 動物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046；3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物免疫學(xué)重點實驗室，河南 鄭州 450002)

磺胺類藥物是一類常用的廣譜型抗菌藥，主要用于預(yù)防和治療細菌感染性疾病，并可作為添加劑在動物飼料中長期添加。但磺胺類藥物的不規(guī)范使用會導(dǎo)致不同程度的藥物殘留，從而引起生態(tài)環(huán)境污染，威脅人類健康?；前奉愃幬镌谌梭w內(nèi)蓄積會引起過敏反應(yīng)、造血功能紊亂、腎臟損傷等。因此，研究簡單快速、靈敏度高、特異性強的磺胺類藥物殘留檢測方法十分必要。免疫分析方法利用高親和力抗體對抗原進行特異性識別，是近幾年磺胺類藥物殘留快速檢測的研究熱點。綜述了放射性免疫、化學(xué)發(fā)光免疫、酶聯(lián)免疫、免疫層析、免疫傳感器等免疫分析方法在磺胺類藥物殘留快速檢測中的應(yīng)用，并對免疫分析方法今后的發(fā)展進行展望。

磺胺類藥物； 免疫分析； 殘留檢測

磺胺類藥物(sulfonamides，SAs)是指具有對氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類藥物的總稱，常用于預(yù)防和治療細菌引起的感染性疾病，因其性質(zhì)穩(wěn)定、廉價易得、廣譜抑菌，在獸醫(yī)臨床和飼料添加劑中應(yīng)用廣泛。但是，隨著其廣泛應(yīng)用，副作用也逐漸凸顯出來。磺胺類藥物的不規(guī)范使用會導(dǎo)致其在動物體內(nèi)殘留超標，進而通過食物鏈傳遞給人類?；前奉愃幬镌谌梭w內(nèi)蓄積會造成過敏反應(yīng)、細菌耐藥、造血系統(tǒng)障礙、致畸和致癌等危害[1-2]，所以應(yīng)嚴格規(guī)范其使用，并在動物屠宰前注意休藥期。國際上很多組織和地區(qū)都對磺胺類藥物殘留限量做出了嚴格的規(guī)定，國際食品法典委員會(CAC)、世界衛(wèi)生組織(WHO)、美國食品藥品管理局(FDA)、歐盟以及我國規(guī)定食品和飼料中磺胺類藥物最大殘留限量均為100 μg/kg[3]。日本要求最為嚴格，規(guī)定動物性食品中不得檢出磺胺類藥物。然而，在現(xiàn)實生產(chǎn)中，許多企業(yè)為追求利益最大化，超量使用磺胺類藥物，或在動物屠宰前為掩蓋病情使用磺胺類藥物，這就要求有關(guān)部門需加大對該類藥物殘留的監(jiān)測力度。目前，常用的檢測動物性食品中磺胺類藥物殘留的方法主要包括高效液相色譜(HPLC)法[4-6]、高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)法[7-9]和免疫分析方法[10]。HPLC和HPLC-MS的靈敏度高，能夠滿足食品監(jiān)督管理、出入境檢驗檢疫機構(gòu)的檢測需求，但前處理過程均較復(fù)雜，需要大型儀器設(shè)備和專業(yè)人員操作，不易進行大批量樣品的篩查，限制了其在實際檢測中的推廣應(yīng)用。免疫分析方法主要是利用特異性抗體對抗原進行高靈敏和高親和的識別，不需要大型儀器，能夠?qū)崿F(xiàn)快速、靈敏、特異的高通量檢測，適合進行初步篩查，滿足了監(jiān)督部門對食品中磺胺類藥物快速、準確檢測的需要。綜述了磺胺類藥物殘留免疫分析方法的應(yīng)用，以期為食品中磺胺類藥物痕量殘留檢測方法的發(fā)展提供參考。

1 磺胺類藥物理化性質(zhì)

磺胺類藥物具有共同的對氨基苯磺酰胺母核結(jié)構(gòu)，其基本結(jié)構(gòu)上的氫能夠被不同取代基取代，形成不同的衍生物(圖1)。常用的磺胺類藥物有20多種，與母核相比，衍生物具有毒性小、效價高、廣譜抗菌、易吸收等優(yōu)點，規(guī)范使用磺胺類藥物可提高飼料利用率，促進禽畜生長。磺胺類藥物的基本結(jié)構(gòu)與對氨基苯甲酸(PABA)相似，可競爭PABA作用于細菌的二氫葉酸合成酶，影響細菌的葉酸代謝從而抑制細菌的生長繁殖。根據(jù)吸收難易程度，可將其分為易吸收型和難吸收型，前者常被用于治療全身感染，而后者多用于治療腸道感染?；前奉愃幬镆话銥榘咨蝾惏咨Y(jié)晶，粉末狀，味微苦，遇光易變質(zhì)，色漸變深。大多數(shù)磺胺類藥物在水中溶解度極低，形成鈉鹽后則易溶于水，水溶液呈強堿性[3]。

圖1 磺胺類藥物的基本結(jié)構(gòu)

2 磺胺類藥物毒性作用

合理規(guī)范地使用磺胺類藥物可預(yù)防和治療動物的細菌感染性疾病，但不當(dāng)使用會造成其在動物組織中富集，最終通過食物鏈傳遞對人體產(chǎn)生一定的毒副作用，主要表現(xiàn)為泌尿系統(tǒng)損傷與過敏反應(yīng)、細菌耐藥性、致畸、致癌、致突變作用等?；前奉愃幬锏拇x產(chǎn)物乙?；前返娜芙舛鹊?，經(jīng)腎臟排出時，若尿液偏酸性，可在腎盂、輸尿管析出結(jié)晶，造成泌尿系統(tǒng)阻塞損傷，引起泌尿系統(tǒng)毒性作用。磺胺類藥物常見過敏反應(yīng)有皮疹、藥熱，一般用藥1周左右出現(xiàn)，藥停即逐漸恢復(fù)，但重者將會休克甚至死亡。除此之外，磺胺類藥物可引起急性溶血性貧血、再生障礙性貧血、粒細胞缺乏癥；還可引起消化系統(tǒng)障礙，表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐、食欲不振等癥狀[11]。

3 磺胺類藥物殘留檢測免疫分析方法

免疫分析方法主要包括放射性免疫(RIA)法、化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)法、酶聯(lián)免疫(ELISA)法、化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫法(CLEIA)、免疫層析法(ICA)、免疫傳感器法等。

3.1RIA法

RIA法是建立較早的標記免疫檢測方法[11]，該方法將放射性同位素作為標記物標記抗原，標記的抗原與待測樣品中的抗原競爭與抗體反應(yīng)，根據(jù)放射性強度，可以間接反映出樣品中的抗原含量。

目前，在磺胺類藥物殘留檢測中應(yīng)用最為廣泛的RIA法是美國開發(fā)的基于細菌受體分析的CharmⅡ放射免疫試劑盒檢測方法，該方法已被美國FDA和歐盟認可。Su等[12]利用CharmⅡ放射免疫試劑盒完成了牛血清中磺胺類藥物殘留的快速檢測，檢測限達20 μg/kg；李佐卿等[13]利用RIA法分別檢測魚肉和雞肉中磺胺類藥物殘留，檢測限為10 μg/kg，達到國家限量要求。RIA法操作簡單、靈敏度高、特異性強，大大提高了檢測效率，可在短時間得到初篩結(jié)果。但RIA法會產(chǎn)生放射性污染且難以處理，制約了RIA法的普及應(yīng)用。

3.2CLIA法

CLIA法是用化學(xué)發(fā)光相關(guān)的酶等物質(zhì)標記抗原或者抗體，當(dāng)抗原抗體特異性結(jié)合時，往體系中加入其他化學(xué)發(fā)光相關(guān)的物質(zhì)，使其發(fā)出輻射光，根據(jù)發(fā)光強度確定抗原或抗體含量的分析方法。

劉俊偉[14]通過制備抗磺胺類藥物的多克隆抗體建立CLIA法，對16種磺胺藥物進行競爭檢測，與傳統(tǒng)ELISA方法相比，靈敏度較高，檢測限范圍在0.1～31.0 μg/L；通過對HPLC和CLIA法的檢測結(jié)果進行線性回歸分析，證明CLIA法準確度較高。CLIA法具有操作簡單快速、靈敏度高、特異性強、沒有輻射、標記物不易丟失等優(yōu)點，但化學(xué)反應(yīng)的穩(wěn)定性會影響其準確性，從而限制了CLIA法的應(yīng)用。

3.3ELISA法

ELISA法是將酶分子作為標記物與抗體或二抗共價結(jié)合，此結(jié)合不改變抗體的免疫活性和酶的活性。ELISA法應(yīng)用較多的是競爭模式，待測樣品中的抗原與固相載體上的抗原競爭結(jié)合抗體，再加入酶標記的二抗(酶主要為辣根過氧化物酶)，與結(jié)合在固相載體抗原上的抗體結(jié)合，加入酶底物后，發(fā)生顯色或發(fā)光反應(yīng)，反應(yīng)的強弱與樣品中抗原的含量成反比。酶的高催化性放大了反應(yīng)結(jié)果，大大提高了其靈敏度。

杜玉玲等[15]合成了磺胺類藥物的母核結(jié)構(gòu)，通過偶聯(lián)載體蛋白制備人工抗原，經(jīng)過免疫小鼠和細胞融合，篩選得到了針對母核結(jié)構(gòu)且免疫學(xué)特性良好的單克隆抗體，對磺胺間甲氧嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶等藥物均有良好的交叉反應(yīng)性，并在此基礎(chǔ)上開發(fā)了ELISA試劑盒，實現(xiàn)了磺胺類藥物的多殘留快速檢測[16]。ELISA法的結(jié)果可通過酶標儀快速分析，且使用設(shè)備簡單、成本低，且具有較高的靈敏度和良好的特異性，已廣泛應(yīng)用于磺胺類藥物殘留的篩選檢測[17]。目前，該法已用于多種磺胺類藥物的單殘留檢測，如磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲惡唑等[18-19]，但ELISA法也易受基質(zhì)效應(yīng)影響。

3.4CLEIA法

近幾年，ELISA法在應(yīng)用中也得到了進一步的發(fā)展，由傳統(tǒng)的顯色底物變?yōu)榘l(fā)光底物，形成了CLEIA法，該方法通過檢測發(fā)光信號提高了ELISA法的靈敏度[20]，在磺胺類藥物殘留的快速檢測中應(yīng)用較廣泛。CLEIA法主要使用競爭模式。馬玲等[21]在制備磺胺二甲基嘧啶單克隆抗體的基礎(chǔ)上，運用競爭模式建立了檢測動物食品中磺胺二甲基嘧啶的間接競爭化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫法，具有較低的檢測限(0.174 μg/L)。萬宇平等[22]采用CLEIA法檢測豬肉中磺胺類藥物的含量，檢測范圍是1.0～81.0 ng/mL，檢測半數(shù)抑制量(IC50)達3.047 ng/mL，檢測限為0.74 ng/g。目前，已開發(fā)出商業(yè)化的CLEIA試劑盒用于磺胺類藥物的快速檢測[23]。

3.5ICA法

ICA法是相對于RIA法、ELISA法和CLEIA法更為快速的一種檢測方法，可在5～10 min得到檢測結(jié)果。最經(jīng)典的ICA法是膠體金免疫層析(GICA)法，GICA法利用膠體金納米材料作為抗體標記物，可在反應(yīng)膜的特定區(qū)域(檢測線和質(zhì)控線)與抗原(或抗體)形成裸眼可見的紫紅色，具有簡便、直觀、省時的特點，在磺胺類藥物的定性檢測或者半定量檢測中發(fā)揮著重要的作用。

國內(nèi)外許多研究人員和檢測公司都相繼研發(fā)出了基于ICA的商業(yè)化磺胺類藥物快速檢測試紙條[24-25]，包括單殘留檢測和多殘留檢測2種類型。Zhang等[26]制備了具有良好特異性的磺胺間甲氧嘧啶單克隆抗體，并利用膠體金標記該抗體，采用競爭模式，組裝了用于檢測豬尿中磺胺間甲氧嘧啶單殘留的試紙，檢測限為15 ng/mL；韓靜等[27]利用對磺胺類藥物具有廣譜特異性的多克隆抗體，通過膠體金標記，研制了能夠檢測豬肉、雞肉、鯽魚中5種磺胺類藥物的多殘留層析檢測試紙，目測檢測限為0.01 mg/kg。

除了膠體金作為標記材料，一些新型納米標記材料也開始應(yīng)用于磺胺類藥物的ICA檢測方法中，王娟[28]制備了CdTe/ZnS核殼型量子點，并將其作為標記材料研制了快速檢測豬肉中殘留的磺胺對甲氧嘧啶免疫層析試紙條，檢測限為50 ng/mL，為動物源性食品中磺胺對甲氧嘧啶殘留的ICA法檢測提供了新方法。

3.6免疫傳感器法

免疫傳感器是生物傳感器中重要的一種，其原理是將抗原或抗體作為敏感識別元件制備傳感器的生物敏感層，然后與樣品中的目標檢測物發(fā)生免疫反應(yīng)，隨即產(chǎn)生一些物理化學(xué)變化，這些變化通過不同原理的傳感器轉(zhuǎn)換成光信號、電信號或其他形式的信號輸出，具有高通量、選擇性強、響應(yīng)快、靈敏度高等特點[29]。

目前，在磺胺類藥物殘留檢測中應(yīng)用較多的免疫傳感器是表面等離子體共振(SPR)傳感器[30-32]，抗原抗體間的相互作用可以通過SPR信號反映出來，可進行實時檢測。周宏敏等[33]將磺胺甲惡唑共價偶聯(lián)到表面等離子共振芯片表面，優(yōu)化了抗體結(jié)合濃度和芯片再生條件，利用免疫競爭原理建立檢測方法，檢測限為3.2 ng/mL，實現(xiàn)了牛奶中磺胺甲惡唑的高通量檢測。符運良等[34]同樣利用競爭模式建立了牛奶中磺胺二甲基嘧啶的SPR傳感器檢測方法，添加回收率為102.8%，相對標準偏差為6.3%，具有較高的精確度和穩(wěn)定性。免疫傳感器法親和力高、廣譜性好，是具有潛力的新型檢測方法。

4 小總結(jié)及展望

在眾多的檢測方法中，RIA法操作簡單、靈敏度高，幾乎可以測定生物體內(nèi)任何物質(zhì)，包括生物本身分泌的各種激素、病人口服或注射的各種藥物、一些病毒抗原等，但該方法會產(chǎn)生放射性污染且難以處理；CLIA法既具有發(fā)光檢測的高度敏感性，又具有高度特異性，是公認的快速、精確、重復(fù)性好且安全無毒的方法，但化學(xué)反應(yīng)不穩(wěn)定會增大其結(jié)果的變異系數(shù)；ELISA法特異性強、靈敏度高、成本低、操作簡單快速且試劑使用壽命長，可用于現(xiàn)場檢測，但其易受多方面因素干擾，穩(wěn)定性、重復(fù)性差；ICA法操作簡單、特異性強、靈敏度高，可利用該技術(shù)對目標物進行純化、富集，再與其他檢測技術(shù)聯(lián)用進行檢測；免疫傳感器法是基于抗原抗體特異性識別功能而研制的傳感器，靈敏度高、特異性強，可將輸出的結(jié)果數(shù)字化，以達到定量檢測的效果，但其制作比較復(fù)雜，測定次數(shù)有限。因此，構(gòu)建操作簡單、靈敏度高、特異性強的新型檢測方法已成為目前研究的熱點。

除了上述幾種主要的免疫分析方法之外，時間分辨熒光免疫法(TRFIA)[35-36]、熒光偏振免疫法(FPIA)[37-39]等方法在磺胺類藥物殘留檢測中也有應(yīng)用。這些免疫檢測方法雖各具優(yōu)勢，但仍有待于進一步完善。免疫檢測不僅需要穩(wěn)定的抗體，同時也需要穩(wěn)定快速的樣品前處理方法，以縮短整體檢測時間，真正實現(xiàn)快速檢測，確保檢測穩(wěn)定；免疫檢測中抗體的特異性至關(guān)重要，但目前能夠檢測多種磺胺類藥物、具有良好特異性的抗體仍較為缺乏，這在一定程度上制約了多殘留快速檢測產(chǎn)品的開發(fā)。提高檢測穩(wěn)定性和靈敏度，簡化樣品前處理及操作步驟，實現(xiàn)高通量和多殘留篩查將是未來磺胺類藥物殘留快速檢測的主要發(fā)展方向。隨著與納米、傳感、光譜等技術(shù)的不斷融合，免疫分析方法在磺胺類藥物的殘留檢測中必將發(fā)揮更為重要的作用。

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Application of Immunoassay in the Sulfonamides Residues Detection

SONG Yuzhen1,2,DONG Qing1,2,XING Guangxu3,HU Xiaofei3,Lü Quanjian2,LIU Juxiong1*

(1.College of Veterinary Medicine,Jilin University,Changchun 130062,China; 2.College of Veterinary Medicine,Henan University of Animal Husbandry and Economy,Zhengzhou 450046,China; 3.Key Laboratory of Animal Immunology, Henan Academy of Agriculture Sciences,Zhengzhou 450002,China)

Sulfonamides is a type of commonly used broad-spectrum antimicrobials which are used primarily for the prevention and treatment of bacterial infectious diseases and are used as feed supplements in animal feeding for a long time.However,the use of non-standard use of sulfa drugs will lead to different levels of residues,causing ecological pollution and human health hazards.The accumulation of the drug in the human body can cause allergic reactions,hematopoietic disorders and damage the kidneys.Therefore,the study of simple and rapid,high sensitivity,specificity of the detection method for the protection of human health is of great significance.Immunoassay is one of the hotspots in the rapid detection of sulfa drug residues in recent years by using high affinity antibodies to specifically recognize antigens.In this paper,the application of radio immunoassay,chemiluminescence immunoassay,enzyme-linked immunosorbent assay,immunochromatography and immunosensor in rapid detection of sulfonamides residues is reviewed,and its future development is prospected.

sulfonamides； immunoassay； residue detection

S859.84

A

1004-3268(2017)10-0008-05

2017-04-22

河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院科技創(chuàng)新團隊支持計劃項目(HUAHE2015008)；河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院重點學(xué)科建設(shè)項目(MXK2016102)

宋予震(1979-)，男，河南新鄉(xiāng)人，副教授，在讀博士研究生，研究方向：動物免疫與食品安全檢測。E-mail:zzmzsong@163.com

*通訊作者：柳巨雄(1963-)，男，山西河曲人，教授，博士，主要從事動物免疫調(diào)節(jié)方面研究。E-mail:juxiongliu@sina.com