陳繼康,譚龍濤,喻春明,朱愛國,陳平,王延周,朱濤濤,熊和平

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南 長沙 410205)

不同氮素水平對飼用苧麻氮代謝關(guān)鍵酶的影響

陳繼康**,譚龍濤**,喻春明,朱愛國,陳平,王延周,朱濤濤,熊和平*

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南 長沙 410205)

苧麻是適于中國南方種植的優(yōu)質(zhì)植物蛋白質(zhì)飼料作物，但缺乏氮素利用的生理基礎(chǔ)研究。為了明確氮素水平對飼用苧麻氮代謝相關(guān)酶的影響，本研究以氮高效基因型苧麻H2000-03和氮低效基因型苧麻冊亨家麻為材料進行了盆栽試驗，設(shè)置0、6、9、12、15 mmol/L氮素處理水平，分析了苧麻幼苗期(15 d)、旺長期(40 d)和成熟期(54 d)氮代謝及抗性關(guān)鍵酶活性的動態(tài)變化特征及相關(guān)關(guān)系，并采用模糊隸屬函數(shù)法進行了綜合評價。結(jié)果表明：(1)隨著氮素處理濃度的增加，兩個苧麻品種的株高、鮮重及葉片蛋白質(zhì)含量呈先增加后下降或趨于平穩(wěn)的趨勢，表明苧麻對氮素需求存在最適量，低于或高于最適水平將導(dǎo)致顯著的產(chǎn)量降低或報酬遞減現(xiàn)象。H2000-03在不同氮素水平下的株高和鮮產(chǎn)均顯著高于冊亨家麻，在適宜氮素水平下(9～12 mmol/L)葉片蛋白質(zhì)含量也顯著較高，并在高氮脅迫下可維持鮮產(chǎn)，整體表現(xiàn)出較高的生產(chǎn)力和穩(wěn)產(chǎn)性。(2)在不同生長時期，兩個苧麻品種NR活性隨氮素濃度的提高逐漸升高，而GS、GOGAT、GLDH、CAT、SOD和POD等酶活呈單峰變化趨勢。H2000-03的NR、GS、GOGAT、CAT活性及高氮水平下的SOD、POD活性均高于冊亨家麻，而GLDH和低氮水平下的SOD和POD活性較低，整體表現(xiàn)出較高的生理響應(yīng)和適應(yīng)能力。(3)苧麻氮代謝與抗性關(guān)鍵酶與其產(chǎn)量和品質(zhì)變化特征一致，可用于監(jiān)測、表征苧麻基因型間氮素利用的差異。本研究認為：相對于持續(xù)提高氮素用量，苧麻可在適宜的氮素水平下達到生理特性與生產(chǎn)性能的契合，旺長期氮代謝相關(guān)酶活性可作為飼用苧麻品種選育的指標之一。

飼用苧麻；氮效率；氮代謝；抗性；酶活性

苧麻(Boehmerianivea)是適于我國南方種植的優(yōu)質(zhì)植物蛋白質(zhì)飼料作物之一[1-2]。大量研究表明充分利用苧麻高蛋白的特性，是其產(chǎn)業(yè)高效、可持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)[3-6]。其合成蛋白質(zhì)主要依賴土壤氮素的吸收和利用，為獲得更高產(chǎn)量的粗蛋白，生產(chǎn)中普遍存在重施氮肥的現(xiàn)象，平均年施氮量達到300～552 kg/hm2[7]。氮肥施用量的持續(xù)增高，不僅對作物的貢獻越來越小，造成氮肥利用效率普遍偏低，而且可能導(dǎo)致飼料原料中硝態(tài)氮含量超標[8]和面源污染問題[9-10]。因此，實施苧麻種植氮肥減施和提高苧麻氮素利用效率具有重要意義。

氮效率的基因型差異在作物間、品種間普遍存在，明確氮高效基因型的生理機制、篩選氮高效基因型，進行品種改良是提高氮素利用效率最有效的措施之一[11-12]。硝酸還原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸合酶(GOGAT)是氮素同化過程中的關(guān)鍵酶[13]，GS/GOGAT偶聯(lián)形成的循環(huán)是高等植物氨同化的主要途徑，在無機氮轉(zhuǎn)化為有機氮的過程中起關(guān)鍵作用[14]。作物氮代謝及抗性相關(guān)酶對氮素的響應(yīng)機制，決定其生產(chǎn)性能和氮素利用效率[15-16]。大量研究分析了施氮水平對苧麻產(chǎn)量和品質(zhì)的影響[17-19]，Deng等[20]進行了氮素缺失下苧麻蛋白質(zhì)組的分析，Zheng等[16]克隆了GS相關(guān)基因BnGS1-2并在煙草(Nicotianatabacum)中進行了超量表達，Liu等[15]研究了干旱脅迫及噴施GA3對苧麻POD等酶活性的影響。但目前尚未見不同氮素水平下苧麻相關(guān)關(guān)鍵酶的變化特征研究。本研究以氮高效和氮低效苧麻品種為材料設(shè)置不同氮素處理水平，對苧麻氮代謝及抗性相關(guān)酶進行系統(tǒng)對比分析，明確飼用苧麻對不同氮素水平的生理響應(yīng)特征，為苧麻氮素利用提升和品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗區(qū)域概況

采用盆栽試驗，于2014年在位于湖南省長沙市岳麓區(qū)的中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所溫室進行。供試的苧麻基因型為前期水培試驗，從30個苧麻資源中篩選出氮低效基因型冊亨家麻和氮高效基因型H2000-03，其中冊亨家麻在9 mmol/L氮素營養(yǎng)液中的氮素利用效率為15.81%，H2000-03為46.01%。

選取生長狀況一致的、嫩梢扦插培育的種苗進行試驗。采用盆栽試驗，每盆一株。試驗塑料盆直徑60 cm，高55 cm，每盆裝干土30 kg。盆栽用土壤自然風(fēng)干、過篩去雜后裝盆，用水沉實，土壤最大持水量為63.8%，土壤養(yǎng)分含量為：全氮1.01 g/kg，速效氮75.1 mg/kg，速效磷16.25 mg/kg，速效鉀37.41 mg/kg，有機質(zhì)含量2.35 mg/kg。

1.2試驗材料與方法

試驗設(shè)5個處理，用氮素水平分別為0、6、9、12、15 mmol/L的營養(yǎng)液澆灌，代號分別為N0、N6、N9、N12和N15，每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)15株。為避免水分脅迫影響，每3 d澆300～500 mL營養(yǎng)液，在第3天上午8:00-10:00一次性完成，各處理澆灌量一致。營養(yǎng)液的全生育期60 d，共澆灌20次，總灌水量為8 L。大量元素營養(yǎng)液配方參考Hoagland營養(yǎng)液配方，微量元素營養(yǎng)液配方參考[21]，具體見表1。

表1 大量元素培養(yǎng)液配方Table 1 Components of mass elements in nutrient solution mg/L

2014年5月10日將苧麻扦插苗移栽至花盆中，用清水澆灌培養(yǎng)至7月14日，剪除地上部進行破稈，正式開始氮素處理試驗。分別在幼苗期(第15天，7月29日)、旺長期(第40天，8月23日)、成熟期(第54天，9月6日)取樣，取樣時間為上午10點，取樣部位為從頂部數(shù)第3～8片功能葉和植株中部韌皮組織，先用液氮固定30 s，然后放入-80 ℃冰箱中保存，用以測定樣品相關(guān)酶活性，每個樣品3個重復(fù)。每隔6 d測定一次苧麻株高，測定時間為上午9點，測定方法為地面至主莖葉尖的拉直長度，測定全部植株后平均，觀察苧麻生長動態(tài)。至60 d，收獲苧麻，并測定鮮重。目前飼用苧麻以利用鮮株為主，因此本研究選取鮮重為產(chǎn)量指標。

收獲后對整個植株稱取鮮重。之后用自來水和蒸餾水沖洗干凈，將植株在105 ℃下殺青30 min，再將溫度調(diào)到75 ℃烘干24 h，最后用粉碎機粉碎。粉碎后的樣品經(jīng)H2SO4-H2O2消化后[15]，對樣品中的蛋白質(zhì)含量按GB/T 6432-1994進行測定。

酶活性的測定，谷氨酸合成酶(GOGAT)活性測定參照鄭朝峰等[22]的方法；硝酸還原酶(NR)，谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸脫氫酶(GLDH)活性、過氧化物酶(POD)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量參照《現(xiàn)代植物生理學(xué)實驗指南》[23]；過氧化氫酶(CAT)活性用H2O2紫外吸收法測定[24]。

1.3數(shù)據(jù)處理

運用模糊隸屬函數(shù)法進行排序，隸屬函數(shù)公式為：R(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)，其中Xi代表指標測定值，Xmin和Xmax代表某一指標的最小值和最大值。

采用Microsoft Excel 2016對所得到的數(shù)據(jù)進行初步整理和圖表繪制，用IBM SPSS statistics 19.0軟件進行方差分析和一般線性相關(guān)分析。采用Duncan法在0.05和0.01水平上進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1不同氮素水平對苧麻生長的影響

從苧麻株高的動態(tài)變化特征可以看出(圖1)，兩個不同氮效率的苧麻基因型在0～18 d生長速率較為一致，不同氮素水平下沒有顯著差異。從6 d開始，苧麻生長速率迅速提升，H2000-03在不同氮素水平下的株高增長速率較冊亨家麻平均高22.9%，最大達到33.3%。從18 d開始，施氮與不施氮(N0)相比株高差異迅速加大，且氮高效基因型H2000-03株高增長顯著高于氮低效基因型冊亨家麻。至60 d收獲時，H2000-03在N0、N6、N9、N12和N15處理下的株高分別較冊亨家麻高40.1%、71.4%、27.4%、97.6%和73.8%。

分析不同氮素水平下苧麻鮮重產(chǎn)量可知(圖2)，在0～9 mmol/L的范圍內(nèi)，隨著氮素水平的提高，苧麻鮮重顯著增加(P<0.01)。超過9 mmol/L后，H2000-03維持了較高的產(chǎn)量，而冊亨家麻則顯著下降(P<0.01)。5個氮素水平下H2000-03的鮮重均顯著高于冊亨家麻?？梢姡咝Щ蛐鸵环矫婺軌蜻m應(yīng)較高氮素水平，另一方面能夠通過獲得更高的產(chǎn)量而顯著提升氮素利用效率。

兩個基因型苧麻的葉片蛋白質(zhì)含量均隨氮素水平的提高而提高。H2000-03葉片蛋白質(zhì)含量在N9、N12和N15處理下沒有顯著差異，但均極顯著高于N6和N0處理，N6處理又極顯著高于N0處理。冊亨家麻葉片蛋白質(zhì)含量隨氮素水平提高的增長趨勢與H2000-03相似，但在低氮素水平(N0～N9)的增長率較低，而在高氮素水平(N9～N15)的增長率較高，其中N9處理相對于N0處理冊亨家麻增長29.0%，小于H2000-03的65.8%；N15處理相對于N9處理冊亨家麻增長10.6%，大于H2000-03的6.2%。

圖1 不同氮素水平下苧麻株高動態(tài)變化Fig.1 Dynamic of plant height of ramie at different nitrogen levels

圖2 不同氮素水平對單株苧麻鮮重和葉片蛋白質(zhì)含量的影響Fig.2 Effects of different nitrogen levels on fresh yield of single ramie plant and its leaf protein content 同一基因型不同小寫字母表示在P<0.05水平差異顯著性(t測驗), * 表示兩個基因型在同一氮素水平下差異顯著(P<0.05)。下同。Small letters indicate significant difference among nitrogen levels (P<0.05), * indicate significant difference between genotypes at the same nitrogen level (P<0.05). The same below.

2.2不同氮素水平對苧麻氮代謝相關(guān)酶活性的影響

NR活性隨苧麻生長時間表現(xiàn)出先升高后降低的現(xiàn)象，而各時期內(nèi)均表現(xiàn)為隨氮素水平的增加而逐漸升高的現(xiàn)象(圖3)。H2000-03的NR活性在幼苗期和旺長期提高比率高于冊亨家麻，其中幼苗期兩個基因型NR活性N15較N0分別提高80.2%和76.2%，旺長期則分別提高126.4%和74.7%。成熟期N0處理下冊亨家麻NR活性僅為29.36 μg/(g·h)，其隨氮素濃度提高的增長比率較大。比較兩個基因型的差異發(fā)現(xiàn)，氮高效基因型H2000-03在所有處理和生育時期均高于氮低效基因型冊亨家麻，且在旺長期和成熟期的N15處理下達到顯著差異(P<0.05)。

GS活性隨苧麻生長時間也表現(xiàn)出先升高后降低的現(xiàn)象，而在3個生長時期內(nèi)則表現(xiàn)為隨氮素水平的提高呈現(xiàn)先升高后緩慢降低的趨勢(圖4)。H2000-03各生長階段苧麻GS活性均在N9處理下達到最大值，并在較高濃度氮素處理間保持了較高的水平和比冊亨家麻更緩和的變化幅度，尤以旺長期明顯。冊亨家麻則表現(xiàn)為在N12處理下達到最大值，說明氮低效基因型苧麻需要更高濃度的氮素來促進GS活性的提高。至成熟期，H2000-03的GS活性在低濃度氮素條件下(N0、N6)顯著較高，而在高濃度氮素條件下(N9、N12、N15)顯著較低(P<0.05)。在同一氮素水平上，幼苗期和旺長期表現(xiàn)為H2000-03顯著高于冊亨家麻。

GOGAT活性隨苧麻生長時間的變化趨勢與GS活性相似，表現(xiàn)出先升高后降低的現(xiàn)象，但各生長時期內(nèi)僅H2000-03表現(xiàn)為隨氮素水平的提高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(圖5)。冊亨家麻在各生長時期內(nèi)的變化規(guī)律不一致，其GOGAT活性變化幅度隨苧麻生長推進逐步變小，至成熟期，不同氮素水平間沒有顯著差異。兩個基因型在N9、N12處理下達到GOGAT活性的最大值。H2000-03較冊亨家麻不僅在生育期內(nèi)GOGAT活性較高，還表現(xiàn)出對氮素水平更敏感的特征。

圖3 不同氮素水平對各生長時期苧麻硝酸還原酶(NR)活性的影響Fig.3 Effects of different nitrogen levels on nitrate reductase (NR) activity of ramie at different growth periods

圖4 不同氮素水平對各生長時期苧麻谷氨酰胺合成酶(GS)活性的影響Fig.4 Effects of different nitrogen levels on glutamine synthetase (GS) activity of ramie at different growth periods

圖5 不同氮素水平對各生長時期苧麻谷氨酸合成酶(GOGAT)活性的影響Fig.5 Effects of different nitrogen levels on glutamate synthase (GOGAT) activity of ramie at different growth periods

各生長時期冊亨家麻的GLDH活性往往顯著高于H2000-03(圖6)。各時期內(nèi)苧麻GLDH活性均表現(xiàn)為隨著氮素水平升高逐漸增大的趨勢，但當?shù)貪舛?9 mmol/L時，變化趨于平緩，N9、N12和N15處理間均沒有顯著差異。GLDH活性隨苧麻生長時間的推進表現(xiàn)出逐漸增加的趨勢，其中H2000-03和冊亨家麻在N9處理下成熟期較幼苗期分別增加88.7%和85.8%，N15處理分別增加109.7%和112.8%。

由表2可以看出，在幼苗期和成熟期，苧麻葉片蛋白質(zhì)含量與GLDH、NR活性顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)正相關(guān)，而與GS、GOGAT活性相關(guān)不顯著。旺長期苧麻葉片蛋白質(zhì)含量則與GS、GOGAT和NR活性顯著正相關(guān)，而且各個酶的活性均顯著或極顯著正相關(guān)。NR活性在各個時期均與葉片蛋白質(zhì)含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系。

圖6 不同氮素水平對各生長時期苧麻谷氨酸脫氫酶(GLDH)活性的影響Fig.6 Effects of different nitrogen levels on glutamic dehydrogenase (GLDH) activity of ramie at different growth periods

表2 不同氮素水平葉片蛋白質(zhì)含量與氮代謝相關(guān)酶活性間的相關(guān)系數(shù)Table 2 The correlation coefficient of leaf protein content and enzyme activity related to nitrogen metabolism at different nitrogen levels

NR: 硝酸還原酶Nitrate reductase; GS: 谷氨酰胺合成酶Glutamine synthetase; GOGAT: 谷氨酸合成酶Glutamate synthase; GLDH：谷氨酸脫氫酶Glutamic dehydrogenase.*P<0.05. **P<0.01.

2.3不同氮素水平對苧麻抗性相關(guān)酶活性的影響

兩個基因型苧麻CAT活性隨氮素水平的提高均表現(xiàn)出明顯的先升高后下降的趨勢，并在N9處理下達到最大值(圖7)。H2000-03在各生長時期均高于冊亨家麻。N6、N9、N12下兩者之間差異往往大于N0、N15，其中旺長期N6處理下兩者存在顯著差異(P<0.05)，N9、N12處理下H2000-03分別為冊亨家麻的21.4%和23.2%，而N0、N15處理下差異均小于10%。

兩個基因型苧麻的SOD活性隨生長時間推進在低氮水平下整體表現(xiàn)增加，而在高氮水平下整體表現(xiàn)降低的趨勢(圖8)。在各生長階段內(nèi)，隨著氮素水平的提高，H2000-03整體表現(xiàn)為升高趨勢，而冊亨家麻表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢。幼苗期和旺長期，H2000-03的SOD活性在低氮水平低于冊亨家麻，而在高氮水平下相對較高；成熟期則均低于冊亨家麻。

兩個基因型苧麻POD活性在3個生長時期隨著氮素水平的提高均呈現(xiàn)先升高后下降的現(xiàn)象，同一氮素水平下POD活性具有相同的變化特征(圖9)。兩個基因型在3個時期均表現(xiàn)為N9處理時呈現(xiàn)最大值，且顯著高于其他處理(P<0.05)。兩個基因型間的差異與SOD相似，表現(xiàn)為幼苗期和旺長期，H2000-03的在低氮水平低于冊亨家麻，而在高氮水平下較高；成熟期則均低于冊亨家麻。

圖7 不同氮素水平對不同時期苧麻CAT活性的影響Fig.7 Effects of different nitrogen levels on catalase (CAT) activity of ramie at different growth periods

圖8 不同氮素水平對不同時期苧麻SOD活性的影響Fig.8 Effects of different nitrogen levels on superoxide dismutase (SOD) activity of ramie at different growth periods

圖9 不同氮素水平對不同時期苧麻POD活性的影響Fig.9 Effects of different nitrogen levels on peroxidase (POD) activity of ramie at different growth periods

2.4不同氮素水平下苧麻相關(guān)酶活性的綜合評價

運用模糊隸屬函數(shù)法，計算上述8個相關(guān)酶活性的隸屬度函數(shù)值，進行排序后發(fā)現(xiàn)，兩個基因型苧麻在不同氮素水平下的平均隸屬度函數(shù)值排序均表現(xiàn)為N9>N12>N15>N6>N0(表3)?？梢?，苧麻對氮素的需求具有最適水平，較低或者較高均顯著影響到苧麻氮代謝及抗性相關(guān)酶活性，進而會降低氮素利用效率。相對于低氮水平，苧麻更容易在高氮水平下表現(xiàn)出較強的氮代謝能力。結(jié)合苧麻株高和產(chǎn)量數(shù)據(jù)，進一步驗證了這個結(jié)論。

表3 旺長期苧麻若干生理變化影響的綜合評價Table 3 Comprehensive assessment on several physiological changes of ramie at rapid growth phase

3 討論

3.1不同氮素水平對苧麻生長的影響

株高、鮮重和蛋白質(zhì)含量是表征飼草生長速率、產(chǎn)量和品質(zhì)的重要指標。研究得出，氮高效基因型苧麻在同一氮素水平下的生產(chǎn)力、氮素脅迫條件下的穩(wěn)產(chǎn)性上均優(yōu)于較氮低效基因型，具體表現(xiàn)在同一氮素水平下較高的株高、鮮重，適宜氮素水平下的葉片蛋白質(zhì)含量及在持續(xù)提高氮素水平時穩(wěn)產(chǎn)的特性上。研究還發(fā)現(xiàn)，苧麻對氮素的需要存在最適量，低于或高于最適水平將導(dǎo)致顯著的產(chǎn)量降低或報酬遞減現(xiàn)象，適宜氮素水平下不僅可獲得氮肥投入與產(chǎn)量、品質(zhì)的契合。這與文中對氮代謝及抗性相關(guān)酶的分析結(jié)果是一致的。

本研究采用的是盆栽試驗，較嚴格地控制了溫度、土壤水分和營養(yǎng)供給等條件，在對比不同氮素水平處理和苧麻基因型間的差異中可獲得更客觀的數(shù)據(jù)。但這與大田復(fù)雜的影響因素不同，因此進一步研究還須綜合考慮多因素的互作。同時，盆栽試驗針對單株苧麻，忽略了作物群體內(nèi)的競爭關(guān)系及綜合表現(xiàn)等因素，還需要進一步的研究來論證。

3.2不同氮素水平對苧麻氮代謝相關(guān)酶活性的影響

NR是硝酸氮同化的限速酶和調(diào)節(jié)酶，對植物吸收氮素至關(guān)重要，其活性的大小受植物體內(nèi)氮素影響顯著。胡潤芳等[25]用不同形態(tài)氮素處理大豆(Glycinemax)，發(fā)現(xiàn)大豆花莢期高蛋白品種功能葉片中NR活性高于低蛋白大豆品種。張磊等[26]的研究得出了相似的結(jié)論。本研究中NR活性隨著氮素水平增加而持續(xù)升高，而且兩個基因型的差距越來越大，并在生長中后期的N15處理下差異顯著(P<0.05)。表明氮高效基因型具有對氮素高吸收高轉(zhuǎn)化能力，而且更高的施氮水平能夠促進苧麻NR活性的提高。

GS/GOGAT是高等植物體內(nèi)氨同化的主要途徑[14,27]，可以把無機氮轉(zhuǎn)化為有機氮，作為氨的貯存庫，可以形成有機氮形式的有效轉(zhuǎn)化，解除植物體內(nèi)多余的氨態(tài)氮。GS是氮代謝中心的多功能酶，參與多種氮代謝的調(diào)節(jié)，GOGAT可以直接反映氨同化的強弱[28]。張國英[29]對水稻(Oryzasativa)碳氮代謝關(guān)鍵酶的研究表明，隨著氮素的增加，GS活性不斷升高，加速了無機氮的轉(zhuǎn)化，在品種間和氮素水平處理間均表現(xiàn)為顯著性差異；在高氮條件下，GOGAT活性升高增加了谷氨酸的合成，加強了體內(nèi)氮素代謝，低氮條件下，側(cè)重于增加氮素的吸收。本研究結(jié)果表明，苧麻在幼苗期和旺長期GS和GOGAT活性隨著氮素水平提高而增加，說明此時對氨的同化較為活躍，氮高效基因型GS和GOGAT酶活性更強，主要表現(xiàn)為氮素的形式轉(zhuǎn)化，成熟期后活性降低較為明顯，說明隨著植物葉片的衰老，其GS和GOGAT活性下降，氨同化合成受阻。H2000-03的GS和GOGAT活性高于冊亨家麻，表明氮高效基因型具有更高的無機氮轉(zhuǎn)化成有機氮的能力。

GLDH具有對GS/GOGAT循環(huán)的輔助作用。張國英[29]對水稻在低氮和高氮條件下對GLDH活性研究表明，由于GLDH對氨的親和力較低，在氨同化作用中發(fā)揮的作用較小，GS/GOGAT循環(huán)在體內(nèi)發(fā)揮主要作用，減少GLDH作用，可減少能量消耗。本研究發(fā)現(xiàn)苧麻H2000-03的GLDH活性較冊亨家麻低，可見氮高效基因型更節(jié)約氮代謝的能量，而且氮低效基因型苧麻的GS/GOGAT循環(huán)能力較弱，需要通過GLDH增加對氨的吸收，來輔助苧麻對氮素的利用。GLDH活性也是隨著氮素水平升高和生長時間推進均表現(xiàn)出增加的趨勢，說明隨著苧麻的生長，需要越來越強的GLDH活性來加強氮的吸收。

張智猛等[30]對花生(Arachishypogaea)葉片可溶性蛋白質(zhì)含量與GS、GLDH和NR活性的關(guān)系研究表明，可溶性蛋白含量與GS和GLDH活性間的相互關(guān)系均不明顯，但與NR活性達到顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)水平。李晶等[31]研究表明，小黑麥(Triticalerimpau)花后各時期，旗葉可溶性蛋白含量與NR和GS活性呈極顯著(P<0.01)正相關(guān)，增施氮肥可以增強小黑麥花后葉片對氮素的同化能力，而GS活性與蛋白質(zhì)合成關(guān)系密切，GS活性越高越有利于蛋白質(zhì)合成[32]。也有研究表明NR活性的增加可以誘導(dǎo)GS和GLDH酶活性的提高[33]。本研究發(fā)現(xiàn)，苧麻生長較弱的幼苗期和成熟期，其葉片蛋白質(zhì)含量與GLDH、NR活性顯著相關(guān)，在旺長期則與GS、GOGAT和NR活性顯著或極顯著正相關(guān)，而且各個酶的活性均顯著或極顯著正相關(guān)。旺長期是決定苧麻產(chǎn)量的關(guān)鍵時期，將該時期的氮代謝相關(guān)酶作為高蛋白苧麻品種的選育指標之一，有利于提高苧麻的氮素利用效率和生產(chǎn)性能。

3.3不同氮素水平對苧麻抗性相關(guān)酶活性的影響

CAT、SOD和POD的高低可以衡量作物在逆境條件下的適應(yīng)能力，間接通過改善植物的生理狀況而增強作物氮代謝能力，提高產(chǎn)量和品質(zhì)[34-35]。謝美玲[36]通過提高氮素水平增加了烤煙苗期葉片中CAT的活性，降低了MDA的含量，減輕了煙株膜脂氧化程度，并認為高氮水平處理可增加葉片SOD活性，延緩了葉片的衰老，利于烤煙苗期的生長。本研究結(jié)果表明，各時期苧麻CAT、SOD、POD隨氮素水平的提高有先上升后下降的趨勢，并在N9處理時達到最大值，這與王賀正等[37]的研究結(jié)果相似，說明合理施用氮肥可以提高抗氧化酶活性，增強苧麻對逆境的抵抗能力，延長葉片功能期，但施氮過量對抗氧化酶活性將起到抑制作用。劉連濤等[27]研究表明從盛鈴末期開始，與中氮、高氮相比，低氮處理棉花(Gossypiumhirsutum)的SOD和POD活性降低，組織含水量和干物質(zhì)積累量快速下降，而MDA含量快速升高，加速了棉株衰老的進程。增加氮素營養(yǎng)能夠明顯提高葉片的生理活性，延緩衰老。此研究結(jié)果與本研究中成熟期一致，氮素水平能提高抗氧化酶活性，有效清除體內(nèi)活性氧，延緩成熟期苧麻葉片衰老速度。

3.4不同氮素水平下苧麻相關(guān)酶活性的綜合評價

植物對氮素的生理生化反應(yīng)受到許多因素的影響，不同的生理生化指標對氮素的影響也不盡相同，所以單個生理生化指標不能充分反映某一氮素濃度對其有害還是有利，因此需對多個生理生化指標進行綜合分析。本研究對苧麻氮代謝關(guān)鍵酶(直接因素)和抗性關(guān)鍵酶(間接因素)進行了比較分析，并通過隸屬函數(shù)法將影響苧麻氮代謝的兩類因素，進行綜合分析，有利于全面評價苧麻氮代謝能力。對旺長期苧麻的生理指標平均隸屬函數(shù)值的比較，氮高效和氮低效基因型在不同氮素濃度的平均隸屬函數(shù)值均表現(xiàn)為N9>N12>N15>N6>N0?？梢娖r麻在氮素代謝能力上存在較明顯的最適水平，較高或較低均會降低苧麻氮素代謝能力。苧麻更偏向于高氮水平與苧麻品種選育中長期以耐重肥為主要選擇性狀之一有關(guān)。

另外，本研究的綜合分析采用各項生理指標的平均隸屬函數(shù)值為參考，由于本研究的各項指標隨氮素水平的提高變化規(guī)律較明顯，不會對結(jié)果產(chǎn)生影響，但尚沒有考慮到各指標的權(quán)重，沒有充分反映出不同氮素水平間的差距，這需要進一步的分析方法創(chuàng)新。

4 結(jié)論

氮高效基因型苧麻較氮低效基因型，在同一氮素水平下具有較高的生產(chǎn)力，在氮素脅迫條件下具有較高的穩(wěn)產(chǎn)性。不同氮效率苧麻氮代謝關(guān)鍵酶和抗性相關(guān)關(guān)鍵酶隨氮素水平的變化特征，及隨生長時間的變化特征相似。氮高效基因型苧麻NR、GS、GOGAT、CAT活性及高氮水平下的SOD、POD活性均高于氮低效基因型，GLDH和低氮水平下的SOD和POD活性較低，整體表現(xiàn)出較高的生理響應(yīng)和適應(yīng)能力。苧麻各個生長時期NR活性隨氮素濃度的提高逐漸升高，GS、GOGAT、GLDH、CAT、SOD、POD等酶活隨氮素水平提高表現(xiàn)出較明顯的先升高后下降的趨勢，并可在適宜氮素水平下達到最大值。苧麻產(chǎn)量和株高可在該氮素水平下與氮代謝生理響應(yīng)特征契合。苧麻更容易在高氮水平下表現(xiàn)出較強的氮代謝能力。旺長期氮代謝相關(guān)酶活性可作為品種選育的指標之一。

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Effectsofdifferentnitrogenlevelsonkeyenzymeactivitiesassociatedwithnitrogenmetabolismoffeedramie

CHEN Ji-Kang**, TAN Long-Tao**, YU Chun-Ming, ZHU Ai-Guo, CHEN Ping, WANG Yan-Zhou, ZHU Tao-Tao, XIONG He-Ping*

InstituteofBastFiberCrops,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Changsha410205,China

Ramie (Boehmerianivea) is an important source of plant protein in South China. Few studies investigating the physiological mechanisms of nitrogen utilization in feed ramie have been reported. To evaluate the activities of key enzymes associated with nitrogen metabolism in ramie, a potted experiment was conducted under different nitrogen levels. Two ramie varieties, H2000-03 which has high nitrogen utilization efficiency (NUE, 46.01%) and Ceheng Jiama with low NUE (15.81%) were treated with 0, 6, 9, 12 and 15 mmol/L nitrogen, and enzyme activity tested at the seedling stage (15 days), maximum growth (40 days) and at maturity (54 days). The results showed that as nitrogen concentration increased plant height, fresh yield and leaf protein content of both varieties increased and subsequently decreased or plateaued, indicating that the range of treatments imposed was able to meet the nitrogen requirement of the ramie plants. Plant height and fresh yield of H2000-03 were significantly higher than that of Ceheng Jiama under all treatments. The leaf protein content of H2000-03 was distinctly higher than that of Ceheng Jiama under a range of nitrogen levels (9-12 mmol/L). These results suggest that H2000-03 has better productivity under a range of nitrogen availabilities and more stable production under nitrogen deficient conditions. At different growth periods, the activity of NR (nitrate reductase) in H2000-03 and Ceheng Jiama gradually increased with increased nitrogen supply, while the activities of glutamine synthetase (GS), glutamate synthase (GOGAT), glutamic dehydrogenase (GLDH), catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD) and peroxidase (POD) first increased and then decreased. The activities of POD, GS, GOGAT, CAT in H2000-03 under all nitrogen levels and the activities of SOD and POD under high nitrogen levels were higher than in Ceheng Jiama, while lower GLDH at all nitrogen levels and lower SOD and POD at low nitrogen levels were detected in H2000-03 compared to Ceheng Jiama. These results indicate that H2000-03 had a better physiological response and adaptability to different nitrogen fertility levels. The dynamic characteristics of ramie yield and quality were consistent with enzyme activity related to nitrogen metabolism and resistance which could be used to monitor and characterize nitrogen utilization differences among genotypes. Our research suggests that an appropriate nitrogen fertility range, rather than continuously increasing nitrogen should be ascertained to coordinate productivity with physiological characteristics. The activity of key enzymes during the rapid growth phase is suggested as an important trait for feed ramie breeding.

feed ramie; nitrogen use efficiency; nitrogen metabolism; plant resistance; enzyme activity

10.11686/cyxb2016501http//cyxb.lzu.edu.cn

陳繼康, 譚龍濤, 喻春明, 朱愛國, 陳平, 王延周, 朱濤濤, 熊和平. 不同氮素水平對飼用苧麻氮代謝關(guān)鍵酶的影響. 草業(yè)學(xué)報, 2017, 26(10): 207-218.

CHEN Ji-Kang, TAN Long-Tao, YU Chun-Ming, ZHU Ai-Guo, CHEN Ping, WANG Yan-Zhou, ZHU Tao-Tao, XIONG He-Ping. Effects of different nitrogen levels on key enzyme activities associated with nitrogen metabolism of feed ramie. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(10): 207-218.

2016-12-28；改回日期：2017-03-14

湖南省科技計劃重點研發(fā)計劃項目(2016NK2205)，國家麻類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-19)和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程多年生麻類作物遺傳改良團隊資金(ASTIP-IBFC04)資助。

陳繼康(1985-)，男，寧夏海原人，助理研究員。E-mail: chenjikang@caas.cn。譚龍濤(1984-)，男，黑龍江佳木斯人，在讀博士。E-mail: 3828134@163.com。**共同第一作者These authors contributed equally to this work.

*通信作者Corresponding author. E-mail: ramiexhp@vip.163.com