高振 王晶 姜敏 李爭(zhēng) 徐丹 哈木拉提?吾甫爾 荊晶 李風(fēng)森

摘要：目的 觀察止嗽散加減方對(duì)慢性阻塞性肺疾?。–OPD）寒燥模型大鼠表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）及中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（NE）的影響。方法 利用氣管滴注彈性蛋白酶結(jié)合煙熏90 d建立COPD模型，在此基礎(chǔ)上予以寒燥應(yīng)激90 d建立COPD寒燥模型。將COPD寒燥模型大鼠隨機(jī)分為寒燥組和中藥組，中藥組連續(xù)干預(yù)7 d。第97日處死大鼠，觀察其肺組織病理形態(tài)。RT-qPCR和Western blot分別檢測(cè)肺組織EGFR mRNA和蛋白表達(dá)，ELISA檢測(cè)血清和肺泡灌洗液NE含量。結(jié)果 COPD組、寒燥組、中藥組肺組織EGFR mRNA和蛋白表達(dá)較對(duì)照組均升高，中藥組肺組織EGFR蛋白表達(dá)較COPD組和寒燥組均降低；COPD組、寒燥組和中藥組血清和肺泡灌洗液NE含量較對(duì)照組升高，寒燥組肺泡灌洗液NE含量高于COPD組，中藥組肺泡灌洗液NE含量低于寒燥組。結(jié)論 止嗽散加減方可能通過(guò)降低寒燥COPD模型大鼠肺組織EGFR和NE的水平，達(dá)到治療COPD的目的。

關(guān)鍵詞：慢性阻塞性肺疾??；寒燥；止嗽散加減方；表皮生長(zhǎng)因子受體；中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.10.013

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2017）10-0053-04

Effects of Modified Zhisou Power on Epidermal Growth Factor Receptor and Neutrophil Elastase in Rats with Cold-Dryness Chronic Obstructive Pulmonary Disease GAO Zhen， WANG Jing， JIANG Min， LI Zheng， XU Dan， Halmurat UPUR， JING Jing， LI Feng-sen （National Clinical Research Base of Traditional Chinese Medicine， Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University， Urumqi 830000， China）

Abstract： Objective To reveal the effects of cold-dryness and modified Zhisou Power on epidermal growth factor receptor （EGFR） and neutrophil elastase （NE） in rats with COPD. Methods COPD model was established with an elastase dose into the trachea combined with exposure to smoking for 90 d； cold-dryness COPD group was further developed by exposure to a cold， dry environment for 90 d. After 90 days， cold-dryness COPD rats was divided into cold-dryness group and Zhisou Power intervention group （treated with modified Zhisou Power for 7 days）. On the 97th day， all rats were killed. Pathological changes in lungs were observed. mRNA and protein expression of EGFR were measured by RT-qPCR and Western blot， and the amount of NE in serum and BALF were examined by ELISA. Results EGFR mRNA and protein expression were significantly higher in COPD group， cold-dryness group and Zhisou Power intervention group than in control group. EGFR was significantly lower in Zhisou Power intervention group than in COPD group and cold-dryness group. NE was significantly higher in serum and BALF in COPD group， cold-dryness group and Zhisou Power intervention group than in control group. NE in BALF was significantly higher in cold-dryness group than in COPD group. NE in BALF was significantly lower in Zhisou Power intervention group than in cold-dryness group. Conclusion Modified Zhisou Power can down-regulate the expression of EGFR and the mount of NE in cold-dryness COPD rats to treat COPD.

Key words： COPD； cold-dryness； modified Zhisou Power； epithelial growth factor receptor； neutrophil elastase

新疆地處中國(guó)西北部，為世界上離海洋最遠(yuǎn)的地

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金（2015211C138）

通訊作者：李風(fēng)森，E-mail：fengsen602@163.com

區(qū)，氣候干燥寒冷。新疆慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）在中醫(yī)證型、證素、癥狀等中醫(yī)特點(diǎn)上與內(nèi)地有別，表現(xiàn)出寒、燥的臨床特點(diǎn)[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，西北寒燥證是新疆COPD的特殊和多發(fā)證型之一[2]。前期研究發(fā)現(xiàn)，寒燥可以降低COPD模型大鼠肺組織水通道蛋白（aquaporin，AQP）4和AQP5表達(dá)，升高黏蛋白（mucin，MUC）5AC和MUC5B表達(dá)[3]。本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上，觀察中藥止嗽散加減方對(duì)COPD寒燥模型大鼠表皮生長(zhǎng)因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）及中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）的影響，初步探討其可能的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)雄性Wistar大鼠65只，5周齡，體質(zhì)量（150±20）g，新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（新）2003-0001。飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度（25±3）℃、相對(duì)濕度60%～80%。

1.2 藥物及制備

止嗽散加減方由《醫(yī)學(xué)心悟》中止嗽散化裁而成，由荊芥10 g、陳皮10 g、炙甘草10 g、桔梗10 g、百部30 g、紫菀20 g、款冬花20 g、紫蘇葉10 g、苦杏仁15 g、生姜10 g、川貝母9 g組成，上述飲片購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部，水煎2次，蒸發(fā)去液體后低溫烘干制成粉狀浸膏，7劑中藥計(jì)1078 g原藥材，共制得粉狀浸膏370 g，低溫干燥保存待用。

1.3 主要試劑與儀器

PCR、Western blot ELISA試劑盒（美國(guó)Santa Cruz Biotechnology），彈性蛋白酶（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。FLI-2000H型人工氣候箱（日本EYELA公司），BUXCO MA1320呼吸功能實(shí)驗(yàn)平臺(tái)（美國(guó)Buxco公司），BS-1105型電子天平（北京賽多克斯天平有限公司），DM600B-1顯微鏡（德國(guó)Leica公司），JEM-1230型生物用透射電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社），亞克力染毒箱（自制），哈德門(mén)牌卷煙（山東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組、造模和給藥

實(shí)驗(yàn)大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為COPD寒燥組30只、COPD組20只、對(duì)照組15只。實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[4]制作COPD模型。于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后第30日按每100 g體質(zhì)量氣管滴注溶于0.8 mL生理鹽水20 U NE；第1～29日、31～97日每日進(jìn)行煙熏。在規(guī)定時(shí)間每日置于亞克力染毒箱內(nèi)，染毒箱連接吸煙裝置，用三通管及80 mL喂食器將卷煙抽吸后注入染毒箱內(nèi)，以15吸/min隨時(shí)補(bǔ)充煙霧，保持煙霧濃度相對(duì)穩(wěn)定，每次18只大鼠吸煙1 h。在2組動(dòng)物吸煙中間清潔染毒箱，打開(kāi)入口及排氣口，風(fēng)扇鼓風(fēng)通氣5 min驅(qū)散殘存煙霧。參照文獻(xiàn)[5]方法制作COPD寒燥模型。在給予COPD模型施加因素的基礎(chǔ)上疊加以下處理因素：第1～97日每晚將大鼠置于系統(tǒng)設(shè)置為溫度（6±2）℃、濕度25%～32.8%的人工氣候箱，每日10 h。對(duì)照組正常環(huán)境中常規(guī)飼料喂養(yǎng)，第30日大鼠與模型組相同術(shù)式氣管滴注等體積生理鹽水。所有大鼠飼養(yǎng)97 d，第90日時(shí)將COPD寒燥模型大鼠隨機(jī)分為中藥組和寒燥組，中藥組給予止嗽散加減方灌胃，給藥劑量根據(jù)人體內(nèi)服劑量按人和動(dòng)物間體表面積折算的等效劑量進(jìn)行換算，每只大鼠予浸膏0.96 g溶于10 mL水，每次5 mL，早晚各1次，COPD組、寒燥組給予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)7 d。

2.2 肺組織病理觀察

第97日大鼠戊巴比妥鈉麻醉，下腔靜脈抽血處死，迅速摘取大鼠肺組織，取右肺中葉，部分氣管、支氣管，10%福爾馬林固定，常規(guī)脫水、浸蠟包埋、切片（2 μm），每塊組織連續(xù)切片3張，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)改變。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

RT-qPCR檢測(cè)肺組織EGFR mRNA水平。EGFR引物序列：上游TGCCCACCACTCATGCTGTA，下游GCCGTGATCTGTCACCACGTA，產(chǎn)物長(zhǎng)度153 bp。采用2步法：95 ℃、30 s，95 ℃、5 min，56 ℃、30 s，40個(gè)循環(huán)。以β-actin Ct值標(biāo)化EGFR Ct值，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算EGFR mRNA表達(dá)。

2.4 Western blot檢測(cè)

取大鼠肺組織，加適量RIPA裂解緩沖液，提取組織總蛋白。BSA法定量蛋白濃度后，取蛋白樣品20 μg經(jīng)120 g/L SDS-PAGE膠電泳分離，120 V條件下電泳約1 h，將膠從電泳槽取出，在轉(zhuǎn)移緩沖液中恒壓100 V下轉(zhuǎn)膜2 h。50 g/L脫脂奶粉TBST室溫封存1 h，EGFR大鼠單克隆抗體（EGFR 1∶200，羊抗鼠）4 ℃過(guò)夜孵育，抗羊IgG二抗（1∶1000）室溫孵育1 h，ECL發(fā)光劑顯影，Bio-Rad軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度掃描分析，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算EGFR相對(duì)表達(dá)量。

2.5 中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶含量檢測(cè)

切開(kāi)分離下腔靜脈，抽取靜脈血5 mL，5 ℃、2500 r/min離心15 min，吸取血清，置于-70 ℃冰箱保存待測(cè)。隨后，按以下方法收集支氣管肺泡灌洗液：經(jīng)下腔靜脈抽血處死大鼠，將氣管與雙肺暴露，做氣管下部橫行切口，對(duì)右主支氣管予以結(jié)扎，用接12號(hào)針頭（尖端磨平）的注射器經(jīng)氣管切口向左肺緩慢灌注無(wú)菌生理鹽水3 mL，每次灌注后立即回收灌注液，紗布過(guò)濾，重復(fù)3次。BALF離心，取其上清液移入無(wú)菌瓶?jī)?nèi)，置于-70 ℃超低溫冰箱保存待測(cè)。ELISA用于定量檢測(cè)大鼠血清及肺泡灌洗液中NE的濃度，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，凡符合正態(tài)分布和方差齊的數(shù)據(jù)采用方差分析，多組間兩兩比較采用LSD法，若方差不齊則用Tamhane方法進(jìn)行兩兩比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 肺組織病理觀察結(jié)果

對(duì)照組肺泡大小基本一致，肺泡壁厚度正常，外周未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，或見(jiàn)極少量炎癥細(xì)胞散在分布；COPD組見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肉芽腫發(fā)生；寒燥組見(jiàn)大量炎性浸潤(rùn)，肉芽腫發(fā)生，部分肺纖維化；中藥組見(jiàn)炎性浸潤(rùn)發(fā)生，較COPD組和寒燥組部分改善。結(jié)果見(jiàn)圖1。

4.2 止嗽散加減方對(duì)模型大鼠肺組織表皮生長(zhǎng)因子受體mRNA和蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，COPD組、寒燥組、中藥組大鼠肺組織EGFR mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.01）；中藥組EGFR mRNA表達(dá)較寒燥組有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；中藥組肺組織EGFR蛋白表達(dá)較COPD組和寒燥組明顯降低（P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)表1、圖2。

4.3 止嗽散加減方對(duì)模型大鼠肺組織血清和肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶含量的影響

與對(duì)照組比較，寒燥組血清NE含量明顯升高（P<0.01），中藥組血清NE含量明顯升高（P<0.05）；COPD組肺泡灌洗液NE含量明顯升高（P<0.05），寒燥組肺泡灌洗液NE含量明顯升高（P<0.01），中藥組肺泡灌洗液NE含量明顯升高（P<0.05）；與COPD組比較，寒燥組肺泡灌洗液NE含量明顯升高（P<0.05）；與寒燥組比較，中藥組肺泡灌洗液NE含量明顯降低（P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)表2。

5 討論

《寓意草·與門(mén)人定議病式》把“辨高卑燥濕，五方異宜”作為“議病式”的重要內(nèi)容之一；《注解傷寒論·傷寒例》更進(jìn)一步明確“醫(yī)之治病，當(dāng)審其土地所宜”。新疆處于中國(guó)西北地區(qū)，地勢(shì)高而寒冷少雨，其病多燥寒。寒燥與津液的關(guān)系密切，一方面影響津液的量，另一方面影響津液的功效，而中醫(yī)的津液表現(xiàn)在氣道則與黏液的功能相近[6]。

前期實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)，寒燥可促使COPD模型MUC5AC、MUC5B表達(dá)升高[3]。持續(xù)的氣道黏液過(guò)度分泌及流變學(xué)特性的改變會(huì)導(dǎo)致黏液纖毛清除功能受損、喪失，使細(xì)菌定植成為可能，甚至發(fā)生炎性改變；還會(huì)導(dǎo)致小氣道阻塞、氣流受限、氣體交換功能障礙，最終導(dǎo)致COPD進(jìn)行性加重，甚至增加病死率，是影響病情及預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。一系列因素可直接或間接作用于分泌細(xì)胞，致使MUC表達(dá)上調(diào)，分泌細(xì)胞過(guò)度化生，促使COPD患者氣道黏液分泌量增加。其中NE是一種最大潛能的黏液促分泌劑[8]，在所有刺激黏液生成和分泌的因素中，75%的作用由NE發(fā)揮[8]。NE可同時(shí)誘導(dǎo)MUC5AC和MUC5B表達(dá)增高，且具有濃度依賴趨勢(shì)[9]。NE不可逆轉(zhuǎn)地改變了Clara細(xì)胞正常呈現(xiàn)的黏蛋白特征，導(dǎo)致產(chǎn)生異常的黏液[10]。而MUC5AC的合成受EGFR信號(hào)傳遞系統(tǒng)調(diào)節(jié)[11]，EGFR在COPD患者氣道MUC的合成中發(fā)揮重要作用[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，COPD組、寒燥組和中藥組模型大鼠肺部EGFR mRNA和蛋白表達(dá)均較對(duì)照組升高，寒燥對(duì)大鼠模型EGFR mRNA和蛋白表達(dá)的影響不大，而止嗽散加減方可降低COPD寒燥模型肺組織EGFR蛋白的表達(dá)。COPD組、寒燥組和中藥組血清和肺泡灌洗液NE含量較對(duì)照組升高；同時(shí)，寒燥增加COPD模型大鼠肺泡灌洗液NE的含量，止嗽散加減方則可降低COPD寒燥模型大鼠肺泡灌洗液NE含量。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)止嗽散加減方可降低COPD寒燥模型大鼠肺組織EGFR和NE的水平，這可能是該方理肺祛痰治療COPD的機(jī)制之一。

參考文獻(xiàn)：

[1] 高振，李風(fēng)森，荊晶，等.新疆和內(nèi)地慢性阻塞性肺疾病中醫(yī)特點(diǎn)的對(duì)比研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2015，30（1）：195-198.

[2] 李風(fēng)森，高振，荊晶，等.慢性阻塞性肺疾病西北寒燥證分布及臨床特點(diǎn)[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2012，19（2）：22-24.

[3] GAO Z， UPUR H， WANG J， et al. Expression of airway mucus-associated proteins in rats with chronic obstructive pulmonary disease with a cold-dryness symptom pattern[J]. Journal of Traditional Chinese Medicine，2016，36（5）：671-677.

[4] GAO Z， LI F S， UPUR H， et al. Effect of cold-dryness on pulmonary and immunologic function in chronic obstructive pulmonary disease model rats[J]. J ournal of Traditional Chinese Mmedicine，2014， 34（2）：221-226.

[5] 高振，李風(fēng)森，王晶，等.止嗽散加減方對(duì)慢性阻塞性肺疾病西北寒燥證大鼠模型肺功能的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2014，34（5）：556-561.

[6] 王劍，徐志偉，嚴(yán)燦，等.從黏液類物質(zhì)病理改變探討痰證機(jī)理[J].上海中醫(yī)藥雜志，2007，30（6）：461-463.

[7] KISHIOKA K， OKAMOTO K， KIM J， et al. Regulation of secretion from mucous and serous cells in the excised ferret trachea[J]. Respir Physiol，2001，126（2）：163-171.

[8] 徐曉艷，周向東.中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶與黏蛋白[J].中國(guó)藥物與臨床，2004，4（10）：741-744.

[9] 蘭箭，孫航，劉杞，等.人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶誘導(dǎo)氣道黏液高分泌細(xì)胞模型的建立及其機(jī)制的初步研究[J].中國(guó)生物工程雜志，2008， 28（3）：1-7.

[10] JAMIL S， BREUER R， CHRISTENSEN T G. Abnormal mucous cell phenotype induced by neutrophil elastase in hamster bronchi[J]. Exp Lung Res，1997，23（4）：285-295.

[11] TAKEYAMA K， DABBAGH K， LEE H M， et al. Epidermal growth factor system regulates mucin production in airways[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1999，96（6）：3081-3086.

[12] 毛翎，白春學(xué)，張敏，等.表皮生長(zhǎng)因子受體和黏蛋白在慢性阻塞性肺疾病氣道中的表達(dá)及意義[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2004，27（9）：585- 588.

（收稿日期：2017-02-14）

（修回日期：2017-03-07；編輯：華強(qiáng)）