曹繼芬，孫道旺，張永妹，楊明英，趙志堅 *

(1.云南省農業(yè)科學院農業(yè)環(huán)境資源研究所，云南 昆明 650205；2.云南省農業(yè)科學院生物技術與種質資源研究所，云南 昆明 650223；3.迪慶州農業(yè)科學研究所，云南 香格里拉 674400)

云南省馬鈴薯晚疫病菌對氟嗎啉的敏感性測定

曹繼芬1，孫道旺2，張永妹3，楊明英1，趙志堅1 *

(1.云南省農業(yè)科學院農業(yè)環(huán)境資源研究所，云南 昆明 650205；2.云南省農業(yè)科學院生物技術與種質資源研究所，云南 昆明 650223；3.迪慶州農業(yè)科學研究所，云南 香格里拉 674400)

采用含藥平板法測定了分離自云南省馬鈴薯產區(qū)昭通、曲靖、大理、昆明和玉溪等地的晚疫病菌對新型殺菌劑氟嗎啉的敏感性。結果表明：氟嗎啉對云南省晚疫病菌的抑菌活性較高，50個菌株均為氟嗎啉敏感菌株，EC50值分布于0.0743～0.2934 μg/mL，平均EC50值為(0.1638±0.0420)μg/mL，最不敏感菌株是最敏感菌株的3.95倍。分離自昭通的晚疫病菌菌株對氟嗎啉最敏感，曲靖和大理的菌株次之，昆明和玉溪的菌株敏感性最低，但各地晚疫病菌對氟嗎啉的EC50值無顯著性差異。測定的馬鈴薯晚疫病菌對氟嗎啉的敏感性頻率分布呈連續(xù)的單峰曲線，可將平均EC50值(0.1638±0.0420)μg/mL作為云南省馬鈴薯晚疫病菌對氟嗎啉的敏感基線。氟嗎啉與甲霜靈之間無交互抗性，氟嗎啉可作為防控晚疫病的高效藥劑。

晚疫病菌；氟嗎啉；敏感基線；馬鈴薯

由致病疫霉(Phytophthorainfestans)引起的晚疫病是制約馬鈴薯產業(yè)健康發(fā)展的瓶頸因素之一，主要防治措施除種植抗病品種外，目前最重要的就是化學藥劑防治。在銅制劑和代森錳鋅等保護性殺菌劑被使用之后，以甲霜靈和霜脲氰為代表的苯基酰胺類和乙酰胺類內吸性殺菌劑被廣泛用于晚疫病的防治[1]，然而，目前在中國各省份的馬鈴薯和番茄產區(qū)已檢測到較高頻率的甲霜靈抗性菌株[2-5]，表明中國晚疫病菌群體對甲霜靈產生了抗藥性。近年來，由于羧酸酰胺類(Carboxylic acid amides, CAAs)殺菌劑對植物卵菌病害具有優(yōu)異的保護和治療作用，且與甲霜靈等苯酰胺類殺菌劑之間無交互抗藥氟嗎啉(flumorph)是沈陽化工研究院創(chuàng)制開發(fā)的擁有自主知識產權的羧酸酰胺類新型內吸性殺菌劑，具有優(yōu)異的保護活性、治療活性和抑制疫霉菌孢子萌發(fā)活性、持效期長、對作物安全等特點[7]。隨著氟嗎啉及烯酰嗎啉等其它同類殺菌劑的廣泛使用，抗藥性風險問題逐漸引起人們的關注。目前辣椒疫霉、瓜果疫霉、致病疫霉、霜霉菌等卵菌對烯酰嗎啉、氟嗎啉等羧酸酰胺類殺菌劑的抗藥性研究已有相關報道[9-12]。云南是中國最具代表性的西南馬鈴薯混作區(qū)，馬鈴薯種植區(qū)域廣、周年生產，種植面積達到了48.58萬hm2[13]。由于在馬鈴薯生育期適逢低溫高濕的氣候條件，全省馬鈴薯產區(qū)晚疫病常年發(fā)生、流行，危害嚴重。在生產中，氟嗎啉近年來已被用于云南馬鈴薯晚疫病的防治，但不同地理分布的病原菌群體對氟嗎啉的抗藥性水平尚不清楚。本研究擬通過云南不同地理來源的馬鈴薯晚疫病菌對氟嗎啉的敏感性進行測定，建立敏感基線，以期為云南馬鈴薯晚疫病菌的抗藥性監(jiān)測以及病害的科學防治提供理論依據。

表1 供試晚疫病菌菌株來源及對甲霜靈的敏感性

性而受到了廣泛重視，逐漸成為替代苯基酰胺類殺菌劑的一類重要的新型防治農藥[6]。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試馬鈴薯晚疫病菌菌株50個，其中甲霜靈中抗菌株12個，抗性菌株38個(表1)。2010-2011年分離自云南大春馬鈴薯主產區(qū)昭通、曲靖和大理，反季馬鈴薯產區(qū)昆明和玉溪，所有病原菌由作物疫病實驗室保存。

1.2 供試藥劑

供試95 %氟嗎啉(flumorph)原藥，由沈陽化工研究院提供。用分析天平稱取適量氟嗎啉原藥，溶于二甲基亞砜(Sigma, D5879)，配制成10 mg/mL貯液，置于4 ℃冰箱中備用。

1.3 供試培養(yǎng)基

黑麥培養(yǎng)基用于供試菌株的培養(yǎng)、氟嗎啉敏感性測定，制備方法參照Caten等的方法[13]。

1.4 氟嗎啉敏感性測定

采用含藥平板法測定氟嗎啉敏感性[1]。供試菌株在黑麥培養(yǎng)基上18 ℃黑暗培養(yǎng)7～10 d后，分別配制含氟嗎啉0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6和1.0 μg/mL 8個不同濃度梯度的黑麥培養(yǎng)基平板。用直徑為5 mm的打孔器在相同圓周的菌落邊緣上切取菌餅，將菌餅正面朝下，分別接種到含氟嗎啉系列濃度的平板上，每處理3次重復，置于18 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)5 d后，用十字交叉法測量菌落生長直徑。根據菌落直徑計算出生長量，計算氟嗎啉各濃度梯度對晚疫病菌菌絲生長抑制率，計算公式如下。

抑制率(%)=

1.5 數據分析

采用Microsoft Office Excel 2003軟件處理整理數據，用DPS數據處理軟件將試驗藥劑濃度轉化成對數(X)、抑制率轉換成幾率值(Y)，根據X與Y的線性關系求出毒力回歸方程Y=A+BX、根據X與Y的線性關系計算出相關系數(r)、氟嗎啉抑制菌絲生長50 %的有效質量濃度(EC50值)，最后根據敏感群體的EC50值分布建立馬鈴薯晚疫病菌對氟嗎啉的敏感基線。

2 結果與分析

2.1 不同地理來源的馬鈴薯晚疫病菌對氟嗎啉敏感性測定

昭通、曲靖、大理、昆明和玉溪等5個不同地理來源的馬鈴薯晚疫病菌菌株對氟嗎啉的敏感性如表2和圖1。各個馬鈴薯產區(qū)的晚疫病菌對氟嗎啉的敏感性與地理分布沒有明顯的相關性，來自同一個馬鈴薯產區(qū)的晚疫病菌菌株對氟嗎啉的敏感性有一定程度上的差異。相對而言，分離自昭通的馬鈴薯晚疫病菌株對氟嗎啉最敏感，EC50范圍為0.0836～0.1941 μg/mL，平均值為(0.1442±0.0291)μg/mL，其次是曲靖和大理兩地的馬鈴薯晚疫病菌株，EC50平均值分別為(0.1637±0.0346)和(0.1605±0.0214)μg/mL，而昆明和玉溪兩地的馬鈴薯晚疫病菌株對氟嗎啉的敏感性稍有下降，EC50平均值分別為(0.1824±0.0577)和(0.1759±0.0574)μg/mL。測定結果顯示：來自5個不同馬鈴薯產區(qū)的50個晚疫病菌中沒有發(fā)現(xiàn)對氟嗎啉有抗性的菌株，均為敏感菌株，且EC50值均小于0.3 μg/mL，表明氟嗎啉對云南省馬鈴薯晚疫病菌的抑制活性較高。經Duncan新復極差法比較，5個不同馬鈴薯產區(qū)的晚疫病菌對氟嗎啉的EC50值差別無顯著性意義。

表2 云南省馬鈴薯晚疫病菌對氟嗎啉的敏感性

注：表中 “a”表示5 %顯著水平。

Note: The‘a’ indicates a significant level of 5 %.

2.2 云南馬鈴薯晚疫病菌對氟嗎啉的敏感基線

分離自云南省昭通、曲靖、昆明、大理和玉溪等5個馬鈴薯產區(qū)的晚疫病菌對氟嗎啉的敏感性結果顯示：50個菌株對氟嗎啉的EC50值分布于0.0743～0.2934 μg/mL，最不敏感菌株是最敏感菌株的3.95倍，平均EC50值為(0.1638±0.0420)μg/mL。測定的50個馬鈴薯晚疫病菌株對氟嗎啉的敏感性頻率分布呈連續(xù)的單峰曲線(圖2)，可將平均EC50值(0.1638±0.0420)μg/mL作為云南省馬鈴薯晚疫病菌對氟嗎啉的敏感基線，對田間晚疫病菌群體的抗藥性水平進行監(jiān)測。

圖1 云南不同馬鈴薯產區(qū)晚疫病菌對氟嗎啉的EC50平均值Fig.1 The EC50 average value of Phytophthora infestans to flumorph of different potato producting areas in Yunnan

2.3 氟嗎啉與甲霜靈無交互抗性

分析供試的馬鈴薯晚疫病菌12個甲霜靈中抗菌株和38個抗性菌株對應的氟嗎啉敏感性發(fā)現(xiàn)，甲霜靈中抗菌株對氟嗎啉的EC50值范圍在0.1163～0.2155 μg/mL，抗性菌株對氟嗎啉的EC50值范圍在0.0836～0.2934 μg/mL。氟嗎啉對甲霜靈中抗和抗性菌株均表現(xiàn)出較高的抑制活性，表明晚疫病菌對甲霜靈的抗藥性水平與對氟嗎啉的抗藥性水平無相關性，甲霜靈中抗和抗性菌株并沒有表現(xiàn)出對氟嗎啉亦有較高的抗性水平，證明羧酸酰胺類(氟嗎啉)與苯基酰胺類(甲霜靈)殺菌劑之間無交互抗性。

3 討 論

從人類歷史上著名的“愛爾蘭饑饉”至今，馬鈴薯晚疫病仍舊在世界各地的馬鈴薯產區(qū)危害流行，造成巨大的經濟損失和社會影響。由于病原菌進化快、易發(fā)生變異，致病性強[15]，導致馬鈴薯抗病育種難度大，在生產上可供利用的抗性品種非常匱乏，目前對晚疫病的防治主要依賴于化學殺菌劑。20世紀80年代以來，隨著馬鈴薯晚疫病菌等植物病原卵菌對苯酰胺類殺菌劑抗藥性的普遍發(fā)生，對卵菌病害的防治提出了新的挑戰(zhàn)。羧酸酰胺類(CAAs)殺菌劑是目前生產上替代苯酰胺類殺菌劑的主要防治藥劑[6]。

圖2 馬鈴薯晚疫病菌對氟嗎啉EC50值的頻率分布Fig.2 Frequency distribution of the EC50 value of field isolates of Phytophthora infestans against flumorph

隨著CAA類殺菌劑廣泛在植物卵菌病害防治中的應用，各國對該類殺菌劑的作用機制和抗藥性風險進行了諸多研究。如在離體條件下，氟嗎啉對大豆疫霉菌4個發(fā)育階段均有顯著的抑制作用，對菌絲生長的EC50值為0.1906 μg/mL，在0.5 μg/mL濃度下對大豆疫霉菌孢子囊形成和孢子萌發(fā)抑制率達100 %，效果好于甲霜靈[16]。辣椒疫霉菌和黃瓜疫霉菌對氟嗎啉具有中等抗藥性風險[17-18]，而黃瓜霜霉菌對氟嗎啉則具有較高的抗藥性風險[12]。Yuan等報道了中國內蒙古和黑龍江馬鈴薯晚疫病菌對氟嗎啉的敏感性測定，結果顯示兩省區(qū)的晚疫病菌對氟嗎啉有相似的敏感性水平，EC50值范圍為 0.1016～0.3228 μg /mL，平均(0.1813± 0.0405)μg /mL[11]。本研究測定了50個云南馬鈴薯晚疫病菌菌株，氟嗎啉對所有菌株的抑制活性較高，EC50值范圍為0.0743～0.2934 μg/mL，平均EC50值(0.1638±0.0420)μg/mL，均為敏感菌株，與內蒙古和黑龍江晚疫病菌的平均EC50值相比，云南的菌株對氟嗎啉更敏感，表明云南馬鈴薯主產區(qū)晚疫病菌對氟嗎啉的抗藥性水平更低，可作為晚疫病田間防治的理想藥劑。通過云南晚疫病菌甲霜靈中抗和抗性菌株對氟嗎啉的敏感性分析，表明晚疫病菌對甲霜靈的抗藥性水平與對氟嗎啉的抗藥性水平無相關性，證明了氟嗎啉與甲霜靈之間無交互抗藥性。需要注意的是，盡管目前氟嗎啉對于緩解和治理植物卵菌病原菌對苯酰胺類殺菌劑的抗藥性問題起到了重要的作用，但要延緩病原菌對該殺菌劑抗性的產生，應與其它無交互抗性的殺菌劑輪換使用[19]，并盡量減少藥劑的施用量和使用次數，以合理延長每種防治藥劑在生產上的使用年限。

本研究測定的馬鈴薯晚疫病菌主要來源于大春馬鈴薯主產區(qū)昭通、曲靖和大理，以及反季馬鈴薯產區(qū)昆明和玉溪，能較好地反映出云南馬鈴薯產區(qū)晚疫病菌的地理分布情況。2010-2011年收集的不同地理來源的馬鈴薯晚疫病對氟嗎啉的敏感性水平雖然不盡相同，但無顯著差異，均為敏感菌株。隨著氟嗎啉在云南馬鈴薯產區(qū)的推廣應用，需加強對各產區(qū)晚疫病病原菌群體的抗藥性動態(tài)監(jiān)測，促進晚疫病的科學防治及抗性治理策略的制定。本研究測定的EC50值(0.1638±0.0420)μg/mL可作為云南省馬鈴薯晚疫病菌對氟嗎啉抗藥性監(jiān)測的敏感基線。

[1]袁善奎,趙志華,劉西莉,等.馬鈴薯晚疫病菌對甲霜靈和霜脲氰的敏感性檢測[J].農藥學學報,2005,7(3):237-241.

[2]王英華,國立耘,梁德霖,等.馬鈴薯晚疫病菌在內蒙古和甘肅的交配型分布及對幾種殺菌劑的敏感性[J].中國農業(yè)大學學報,2003,8(1):78-82.

[3]畢朝位,車興壁,馬金成,等.致病疫霉對甲霜靈抗性及抗性水平測定[J].西南農業(yè)大學學報,2002,24(4):307-309.

[4]張志銘,曹晨光,王慧生,等.呼倫貝爾市馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans)對甲霜靈抗藥性的研究[J].中國馬鈴薯,2004,18(5):272-273.

[5]曹繼芬,孫道旺,楊明英,等.云南省馬鈴薯?番茄晚疫病菌對甲霜靈敏感性及地理分布[J].西南農業(yè)學報,2007,20(5):1027-1031.

[6]朱書生,盧曉紅,陳 磊,等.羧酸酰胺類(CAAs)殺菌劑研究進展[J].農藥學學報,2010, 12(1):1-12.

[7]劉武成,劉長令.新型高效殺菌劑氟嗎琳[J].農藥,2002,41(1):8-11.

[8]袁善奎,劉西莉,劉 亮,等.馬鈴薯晚疫病菌對烯酰嗎啉的敏感性基線及其室內抗藥突變體的研究[J].植物病理學報,2005,35(6):545-551.

[9]崔小嵐,孟慶曉,畢 揚,等.辣椒疫霉對烯酰嗎啉的敏感性基線及室內抗藥突變體研究[J].植物病理學報,2009,39(6):630-637.

[10]朱書生,陳 磊,盧曉紅,等.三種羧酸酰胺類殺菌劑對黃瓜疫霉菌不同發(fā)育階段的影響及其敏感性測定[J].農藥學學報,2010,12(2):168-172.

[11]Yuan S K, Liu X L, Si N G, et al. Sensitivity ofPhytophthorainfestansto flumorph: in vitro determination of baseline sensitivity and the risk of resistance[J]. Plant Pathology, 2006, 55(2):258-263.

[12]Zhu S S, Liu P F, Liu X L, et al. Assessing the risk of resistance inPseudoperonosporacubensisto the fungicide flumorph in vitro[J].Pest Manage Sci, 2008, 64:255 -261.

[13]桑月秋,楊瓊芬,劉彥和,等.云南省馬鈴薯種植區(qū)域分布和周年生產[J].西南農業(yè)學報,2014, 27(3):1003-1006..

[14]Caten C E, Jinks J L. Spontaneous variability of single isolates ofPhytophthorainfestans.I.Cultural variation[J]. Canadian Journal of Botany, 1968, 46(3):329-348.

[15]Haas B J, Kamoun S, Zody M C, et al. Genome sequence and analysis of the Irish potato famine pathogenPhytophthorainfestans[J]. Nature, 2009, 461:393-398.

[16]孔祥清,劉 洋,左豫虎.氟嗎啉對大豆疫霉菌的抑制作用[J].中國農學通報,2007,23(2):371-373.

[17]Meng Q X, Cui X L, Bi Y, et al. Biological and genetic characterization ofPhytophthoracapsicimutants resistant to flumorph[J]. Plant Pathology, 2011, 60:957-966.

[18]黃立華,劉君麗,司乃國.辣椒疫病菌對氟嗎啉的抗藥性研究[J].農藥,2004,43(6):261-262.

[19]劉凌云,姚春光,盧麗麗,等.不同殺菌劑及組合對馬鈴薯晚疫病的防控效果分析[J].西南農業(yè)學報,2015,28(4):1646-1650.

(責任編輯 王家銀)

SensitivityDeterminationofPotatoLateBlightDiseasePathogenPhytophthorainfestanstoFlumorphinYunnan

CAO JI-fen1, SUN Dao-wang2, ZHANG Yong-mei3, YANG Ming-ying1, ZHAO Zhi-jian1 *

(1.Agricultural Environment & Resources Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Yunnan Kunming 650205, China; 2.Biotechnology and Germplasm Resources Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Yunnan Kunming 650223, China; 3.Diqing Institute of Agricultural Sciences, Yunnan Shangri-La 674400, China)

The sensitivity of fifty isolates ofPhytophthorainfestanscollected from potato production area Zhaotong, Qujing, Dali, Kunming and Yuxi in Yunnan province against new fungicide flumorph was assayed by fungicide-amended plates. The results showed that flumorph had high inhibition activity to all isolates ofP.infestans. All fiftyP.infestanisolates were sensitive, and the EC50value ranged from 0.0743 μg/mL to 0.2934 μg/mL, and the EC50average value was(0.1638±0.0420)μg/mL. The EC50value of the most insensitive isolate was 3.95 times to that of the most sensitive one.P.infestansisolated from Zhaotong were the most sensitive to flumorph, followed by isolates from Qujing and Dali, and the isolates from Kunming and Yuxi were lower sensitivity. However, the EC50value of all isolates from different geographical regions to flumorph had no statistical difference. The sensitivity frequency of fifty isolates to flumorph had a unimodal curve distribution, so the EC50average value(0.1638±0.0420)μg/mL could be used as baseline sensitivity ofP.infestansto flumorph in Yunnan province. The result also showed that there was no cross resistance between flumorph and metalaxyl. Flumorph could be used as a high effective agent to control late blight disease.

Phytophthorainfestans；Flumorph；Baseline sensitivity；Potato

1001-4829(2017)3-0580-04

10.16213/j.cnki.scjas.2017.3.017

S532

A

2015-12-28

國家自然科學基金(30960216)；云南省自然科學基金重點項目(2011FA020)；公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項(201303018)

曹繼芬(1971-)，女，副研究員，主要從事植物真菌、卵菌病害研究，E-mail：cjf016@sina.com，*為通訊作者：E-mail：zhijianzhao@hotmail.com。