楊 娜， 趙云鶴， 黃菲菲， 劉琦瑋， 陸 利△

(山西醫(yī)科大學(xué) 1人體解剖學(xué)教研室， 2生物制藥系， 山西 太原 030001)

18α-GA 激活Nrf2對(duì)成體神經(jīng)干細(xì)胞的影響*

楊 娜1， 趙云鶴1， 黃菲菲1， 劉琦瑋2， 陸 利1△

(山西醫(yī)科大學(xué)1人體解剖學(xué)教研室，2生物制藥系， 山西 太原 030001)

目的明確18α-甘草次酸(18α-GA)對(duì)核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)的激活作用，觀察上調(diào)Nrf2對(duì)成體神經(jīng)干細(xì)胞(aNSCs)增殖和分化能力的影響，探討維持aNSCs活力的有效途徑。方法體外培養(yǎng)新生、成年和老年小鼠的側(cè)腦室室膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)，觀察隨年齡增長(zhǎng)NSCs中Nrf2的表達(dá)變化。以18α-GA作用aNSCs，用real-time PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)比較18α-GA組與DMSO對(duì)照組aNSCs的Nrf2表達(dá)變化。構(gòu)建攜帶綠色熒光蛋白(GFP)基因的Nrf2-shRNA慢病毒載體(LV)感染aNSCs， 用real-time PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)shRNA對(duì)Nrf2的沉默效率。將aNSCs按照干預(yù)條件不同分為DMSO組、18α-GA組、LV-GFP組和LV-Nrf2-shRNA組，運(yùn)用BrdU摻入實(shí)驗(yàn)、Tuj1免疫熒光染色、CCK-8實(shí)驗(yàn)、Hoechst 33342/PI雙染色和活性氧簇(ROS)水平測(cè)定等方法評(píng)價(jià)18α-GA是否通過激活Nrf2對(duì)aNSCs的增殖、分化、細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡以及氧化應(yīng)激水平產(chǎn)生影響。結(jié)果隨年齡增長(zhǎng)，成年和老年小鼠aNSCs的Nrf2 mRNA表達(dá)水平較新生小鼠NSCs顯著降低(P<0.01)，但aNSCs的ROS水平顯著高于新生小鼠NSCs(P<0.05)。應(yīng)用18α-GA后， aNSCs的Nrf2 mRNA與蛋白表達(dá)水平較DMSO組明顯升高(P<0.01)， 并且aNSCs的BrdU陽性率也顯著增加(P<0.01)。2 mg/L 18α-GA 作用后，aNSCs的Tuj1陽性率和細(xì)胞活力較DMSO組顯著升高(P<0.05)，而凋亡率和ROS水平顯著下降(P<0.05和P<0.01)。但是，敲減aNSCs的Nrf2并應(yīng)用18α-GA干預(yù)后， LV-Nrf2-shRNA組BrdU陽性率、Tuj1陽性率以及細(xì)胞活力均較LV-GFP組顯著下降(P<0.05)，ROS水平卻顯著上升(P<0.05)。結(jié)論18α-GA可能通過激活Nrf2提高aNSCs的抗氧化能力，促進(jìn)aNSCs增殖和分化，維持aNSCs潛能。

18α-甘草次酸； 成體神經(jīng)干細(xì)胞； 核因子E2相關(guān)因子2； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞分化； 小鼠

成體神經(jīng)干細(xì)胞(adult neural stem cells，aNSCs)主要分布于成年哺乳動(dòng)物側(cè)腦室室膜下區(qū)(subventricular zone，SVZ)和海馬齒狀回(dentate gyrus，DG)，有自我更新和分化能力，能夠修復(fù)受損的神經(jīng)組織。然而，隨年齡增長(zhǎng)，神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)的增殖潛能和細(xì)胞活力逐步降低，其潛在的機(jī)制亟待闡明[1]。氧化應(yīng)激是導(dǎo)致細(xì)胞與組織損傷的重要原因，活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生過多或機(jī)體抗氧化能力減退使高活性氧自由基攻擊蛋白質(zhì)、脂肪和核酸，導(dǎo)致蛋白變性、DNA斷裂，引起細(xì)胞凋亡[2]。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)是近年發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞抵抗內(nèi)、外環(huán)境氧化刺激的關(guān)鍵因子，它通過與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)結(jié)合上調(diào)抗氧化基因的表達(dá)，抵抗氧化應(yīng)激[3]。那么，Nrf2在aNSCs功能維持中是否發(fā)揮重要作用，激活Nrf2是否有助于提高aNSCs活力？有文獻(xiàn)報(bào)道18α-甘草次酸(18α-glycyrrhetinic acid，18α-GA)可以促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)位，激活人胚胎成纖維細(xì)胞Nrf2表達(dá)[4]。為此，本研究擬運(yùn)用18α-GA作為Nrf2的激活劑，探討上調(diào)Nrf2表達(dá)水平對(duì)aNSCs的影響。

材 料 和 方 法

1動(dòng)物

清潔級(jí)BALB/c小鼠，雌雄不限，由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)為SCXK(晉)2015-0001。

2主要試劑

DMEM/F12 (Basic/KnockOut)、TrypLE Express、Accutase細(xì)胞消化液、ITS、B27和FBS購自Gibco；木瓜蛋白酶(papain)購自Worthington；表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor, EGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)購自BioEasy；兔抗Nrf2多克隆抗體購自Abcam；兔抗β-actin多克隆抗體、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑購自生工生物；鼠抗5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2’-deoxyuridine，BrdU)抗體和鼠抗Tuj1抗體購自ABclonal；Hoechst 33342/PI雙染試劑盒、BrdU、Cy3標(biāo)記山羊抗鼠 II 抗和DCFH-DA購自Sigma；辣根過氧化物酶偶聯(lián)抗兔 II 抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；山羊血清封閉液購自博士德生物；DAPI 購自Roche；CCK-8試劑盒購自日本同仁；PCR試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa；RIPA裂解液購自碧云天； BCA試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)板購自Corning；其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

3主要方法

3.1體外培養(yǎng)不同年齡階段小鼠的NSCs (1)新生NSCs的分離培養(yǎng)：新生鼠(postnatal day 0，P0)用75%乙醇充分消毒后斷頭處死，頭顱用冰冷0.01 mol/L HBSS分離液充分沖洗。在顱頂做正中切口，逐步剪開頭皮，剝除顱骨，取出大腦組織，再次用0.01 mol/L HBSS沖洗后剝離外層腦膜，用無菌尖鑷快速分離SVZ組織，放入含有DMEM/F12的離心管中，剪碎組織并加入適量TrypLE Express，37 ℃水浴5 min。用等量DMEM/F12終止消化，500×g離心5 min，棄去上清，用1 000 μL NSCs增殖培養(yǎng)基[DMEM/F12 (KnockOut)，2% B27無血清添加劑，20 μg/L bFGF，20 μg/L EGF，1% ITS，2 mg/L 肝素，1%青鏈霉素]充分重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種于用培養(yǎng)基浸潤(rùn)的6 孔培養(yǎng)板中，37 ℃、5% CO2靜置培養(yǎng)，隔3 d換液, 培養(yǎng)7 d至細(xì)胞成球。(2)aNSCs的分離培養(yǎng)：成年鼠(postnatal day 60，P60)和老年鼠(postnatal day 300，P300)斷頭處死，頭顱置于75%乙醇中沖洗消毒。剪開頭部皮膚與顱骨，分離腦組織，置于無菌培養(yǎng)皿中并用冰冷的0.01 mol/L HBSS分離液充分沖洗。將組織翻轉(zhuǎn)至腹側(cè)，在視交叉前1.5 mm處行冠狀切，用無菌尖鑷快速分離SVZ組織，收集組織放入含有DMEM/F12的離心管中。低速離心棄去上層收集液，用組織剪將組織剪碎呈勻漿狀，加入消化液(0.02 g papain和30 mL TrypLE Express)37 ℃水浴10 min。用等體積DMEM/F12終止消化后，500×g離心5 min。將細(xì)胞用aNSCs增殖培養(yǎng)基[DMEM/F12 (Basic)，2% B27無血清添加劑，20 μg/L bFGF，20 μg/L EGF，1% ITS，2 mg/L 肝素，1%青鏈霉素]重懸后種入培養(yǎng)板中。隔 3 d換液，培養(yǎng)7 d至細(xì)胞成球。

3.218α-GA體外干預(yù)實(shí)驗(yàn) 在aNSCs增殖培養(yǎng)基中加入用DMSO配制不同濃度的 18α-GA，每天換液，持續(xù)作用7 d，隨后進(jìn)行real-time PCR、Western blot、CCK-8實(shí)驗(yàn)和活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平測(cè)定。18α-GA連續(xù)作用于aNSCs 7 d后，用適量Accutase酶消化神經(jīng)球，按照8×107/L將細(xì)胞接種于多聚鳥氨酸(poly-orinithin，50 mg/L)和層黏連蛋白(laminin，20 mg/L)包被的玻片上，用含18α-GA的增殖培養(yǎng)基繼續(xù)作用12 h，觀察待細(xì)胞貼壁后，一部分細(xì)胞進(jìn)行BrdU 摻入實(shí)驗(yàn)和Hoechst 33342/PI雙染實(shí)驗(yàn)；另一部分細(xì)胞更換為含2 mg/L 18α-GA的促分化培養(yǎng)基[DMEM/F12 (Basic)、1% FBS、2% B27和1%的青鏈霉素]繼續(xù)作用3 d，進(jìn)行Tuj1免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)。

3.3慢病毒感染aNSCs 合成靶向鼠Nrf2基因的shRNA 通過基因重組技術(shù)將序列為5’-CCAAAGCUAGUAUAGCAAUAA-3’的片段連接到含U6啟動(dòng)子及綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因的慢病毒載體(lentiviral vector，LV)中，構(gòu)建shRNA重組質(zhì)粒，并包裝Nrf2 shRNA慢病毒顆粒(LV-Nrf2-shRNA)及其對(duì)照病毒顆粒(LV-GFP)。aNSCs培養(yǎng)7 d成球后，用Accutase酶消化為單個(gè)細(xì)胞，加入含病毒顆粒的培養(yǎng)基(MOI=40)，作用24 h。感染72 h后，于倒置顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)情況，并收集部分細(xì)胞進(jìn)行Real-time PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Nrf2的敲減效率。另一部分細(xì)胞加入含有2 mg/L 18α-GA 的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7 d，進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

3.4Real-time PCR實(shí)驗(yàn) 采用 RNAiso Plus(TaKaRa)試劑提取細(xì)胞總RNA。運(yùn)用分光光度法檢測(cè)RNA質(zhì)量和濃度。5×Prime Script?RT Master Mix試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用SYBR Green法，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA(100 ng)為模板在ABI StepOneTMPlus儀器檢測(cè)，反應(yīng)體系與條件參照SYBR? Premix Ex TaqTM(TaKaRa)說明書。反應(yīng)完畢后采用2-ΔΔCt法進(jìn)行基因表達(dá)的相對(duì)定量分析。內(nèi)參照GAPDH的上游引物為5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游引物為5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’；目的基因Nrf2的上游引物為5’- GAGCAAGTTTGGCAGGAGCTA-3’, 下游引物為5’-GCTGTCCATTTCTGTCAGTGTG-3’。

3.5Western blot實(shí)驗(yàn) 收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液，多次吹打使細(xì)胞懸浮，超聲粉碎細(xì)胞。高速離心15 min后提取蛋白質(zhì)上清。使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度并高溫變性備用。取20 μg蛋白進(jìn)行12% SDS-PAGE分離，電泳完畢后，取出凝膠進(jìn)行濕轉(zhuǎn)使蛋白質(zhì)由凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂牛奶封閉后以兔抗β-actin多克隆抗體(1∶1 000)和兔抗Nrf2多克隆抗體(1∶1 000)4 ℃孵育12 h。TBST漂洗3次，辣根過氧化物酶偶聯(lián)抗兔Ⅱ抗(1∶4 000)室溫孵育2 h，TBST緩沖液漂洗后ECL檢測(cè)，暗室曝光顯影。

3.6BrdU摻入實(shí)驗(yàn) 在培養(yǎng)基中加入10 μmol/L的BrdU，12 h之后用4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞15 min，加入2 mol/L HCl 37 ℃水浴10 min暴露抗原。10%山羊血清37 ℃封閉1 h，BrdU的 I 抗(1∶100)4 ℃孵育12 h，PBS漂洗3次，37 ℃孵育Cy3標(biāo)記的 II 抗2 h，DAPI染色15 min，抗熒光淬滅劑封片。Olympus熒光顯微鏡拍照，ImageJ軟件分析。

3.7免疫熒光染色實(shí)驗(yàn) 分化培養(yǎng)結(jié)束后，取出aNSCs貼附的蓋玻片，用4%多聚甲醛室溫固定15 min，10%山羊血清37 ℃封閉1 h，4 ℃孵育抗Tuj1的 I 抗(1∶200)12 h， PBS漂洗，37 ℃孵育Cy3標(biāo)記的 II 抗2 h， DAPI染色15 min，抗熒光淬滅劑封片。 Olympus熒光顯微鏡拍照，ImageJ軟件分析。

3.8CCK-8實(shí)驗(yàn) 收集aNSCs并將其消化為單個(gè)細(xì)胞，按照1×103/孔接種于96孔板，繼續(xù)作用72 h，培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入10 μL CCK-8試劑。培養(yǎng)結(jié)束后于450 nm測(cè)定吸光度(A)值。

3.9Hoechst 33342/PI雙染實(shí)驗(yàn) 在aNSCs增殖培養(yǎng)基中加入5 mg/L Hoechst 33342，置于37 ℃孵育20 min后棄染液，PBS漂洗3次，加入用PBS配制的10 mg/L 碘化丙啶染液，室溫孵育10 min后棄去染液，PBS漂洗后立即用Olympus 熒光顯微鏡觀察拍照，ImageJ 軟件分析。

3.10ROS水平的測(cè)定 收集aNSCs，按照5×104/孔接種于96孔板。用PBS清洗細(xì)胞2遍后，加入無血清培養(yǎng)液稀釋的10 μmol/L DCFH-DA，將96孔板置于37 ℃孵箱60 min。BioTek酶標(biāo)儀檢測(cè)激發(fā)光485 nm、發(fā)射光535 nm處的熒光強(qiáng)度。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1不同年齡小鼠NSCs的Nrf2表達(dá)變化

從P0、P60和P300小鼠的SVZ分離培養(yǎng)NSCs， real-time PCR 結(jié)果顯示P60組和P300組Nrf2 mRNA的表達(dá)水平均較P0組明顯下降(P<0.01)，提示成年和老年鼠aNSCs Nrf2的mRNA表達(dá)水平顯著低于新生鼠的NSCs，見圖1。

218α-GA上調(diào)體外培養(yǎng)aNSCs中Nrf2的表達(dá)水平

應(yīng)用1 mg/L與2 mg/L的18α-GA作用于體外培養(yǎng)的aNSCs 7 d， real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示Nrf2的mRNA表達(dá)水平均較DMSO組明顯上升(P<0.01)，見圖2A。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明給予18α-GA后，Nrf2的蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，提示應(yīng)用18α-GA能夠上調(diào)Nrf2的表達(dá)，見圖2B。

Figure 1. The mRNA expression of Nrf2 in the NSCs isolated from P0, P60 and P300 mice. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsP0 group.

圖1不同年齡小鼠NSCs的Nrf2mRNA表達(dá)水平

Figure 2. Nrf2 expression in the aNSCs was increased after treated with 18α-GA. A: quantification of mRNA expression level of Nrf2 was measured by real-time PCR; B: Western blot analysis for the protein level of Nrf2. Mean±SD.n=4.**P<0.01vsDMSO group.

圖218α-GA上調(diào)體外培養(yǎng)aNSCs中Nrf2的表達(dá)水平

3Nrf2shRNA慢病毒感染效率

慢病毒載體感染aNSCs 72 h后，于倒置顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)情況，計(jì)數(shù)結(jié)果顯示感染率可達(dá)86.2%±2.6%，見圖3A。real-time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LV-Nrf2-shRNA組Nrf2的mRNA表達(dá)水平較LV-GFP組明顯下降(P<0.01)；Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示LV-Nrf2-shRNA組Nrf2的蛋白表達(dá)水平較LV-GFP組顯著降低(P<0.01)，提示運(yùn)用LV-Nrf2-shRNA感染aNSCs可以有效敲低Nrf2的表達(dá)水平，見圖3B、C。

418α-GA上調(diào)Nrf2可提高aNSCs的增殖能力

應(yīng)用不同濃度的18α-GA作用于aNSCs，BrdU摻入實(shí)驗(yàn)觀察18α-GA對(duì)aNSCs增殖能力的影響。結(jié)果顯示，隨18α-GA濃度增高，aNSCs的BrdU陽性率增加，0.8 mg/L組、1 mg/L組、2 mg/L組和5 mg/L組aNSCs的BrdU陽性率均較DMSO組顯著升高(P<0.01)，提示應(yīng)用18α-GA能夠提高aNSCs的增殖能力，見圖4A。Nrf2基因敲減后應(yīng)用2 mg/L 18α-GA作用7 d，BrdU摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LV-Nrf2-sh-RNA組aNSCs的BrdU陽性率較LV-GFP組顯著下降(P<0.05)，提示18α-GA可能通過上調(diào)Nrf2提高aNSCs的增殖能力，見圖4B。

Figure 3. The infection efficiency of LV in the aNSCs. A: the images of aNSCs transfected with LV for 72 h (×200); B: the mRNA expression of Nrf2 in the aNSCs was measured by real-time PCR; C: the protein level of Nrf2 was analyzed by Western blot. Mean±SD.n=4～5.**P<0.01vsLV-GFP group.

圖3Nrf2shRNA慢病毒的感染效率

Figure 4. The effects of 18α-GA on the proliferation of aNSCsinvitro. A: the aNSCs were stained with antibody against BrdU (red), while the nuclei were counterstained with DAPI (blue) (×400)， and the quantitative analysis of BrdU positive cells in the aNSCs treated with 18α-GA or DMSO was shown； B： after treated with 18α-GA for 7 d, the proliferation of aNSCs in LV-Nrf2-shRNA group and LV-GFP group was measured (×400). Mean±SD.n=4～5.**P<0.01vsDMSO group；#P<0.05vsLV-GFP group.

圖418α-GA上調(diào)Nrf2提高aNSCs的增殖能力

518α-GA上調(diào)Nrf2提高aNSCs向神經(jīng)元分化的能力

應(yīng)用2 mg/L 18α-GA作用于aNSCs，分化培養(yǎng)3 d，Tuj1免疫熒光染色結(jié)果顯示18α-GA組陽性率為42.6%±3.8%，較DMSO組顯著上升(P<0.05)。但是，敲減Nrf2后， LV-Nrf2-shRNA組的Tuj1陽性率下降至32.5%±3.2%，較LV-GFP組顯著下降(P<0.05)，提示Nrf2在18α-GA促進(jìn)aNSCs向神經(jīng)元方向分化過程中發(fā)揮作用，見圖5。

Figure 5. Activation of Nrf2 by 18α-GA promoted the neuronal differentiation of aNSCs. The percentage of Tuj1+cells was evaluated for identifying neuronal differentiation (×400). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsDMSO group;#P<0.05vsLV-GFP group.

圖518α-GA上調(diào)Nrf2提高aNSCs向神經(jīng)元分化的能力

618α-GA上調(diào)Nrf2提高aNSCs活力，減少細(xì)胞凋亡

應(yīng)用2 mg/L 18α-GA作用于aNSCs，CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，18α-GA組的A值較DMSO組明顯增高(P<0.05); Hoechst 33342/PI雙染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，18α-GA組aNSCs的凋亡率為5.6%±0.4%，較DMSO組明顯下降(P<0.05)，提示18α-GA可以提高aNSCs的細(xì)胞活力，降低細(xì)胞凋亡率。敲減Nrf2基因后，LV-Nrf2-shRNA組的細(xì)胞活力較LV-GFP組顯著降低(P<0.05)，但兩組凋亡率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖6。

Figure 6. Activation of Nrf2 by 18α-GA affected the viability of aNSCs. A: the cell viability was measured by CCK-8 assay; B and C: a double-labeling assay for detecting apoptotic cells with PI (red) and Hoechst 33342 (blue) (×200). Mean±SD.n=3～4.*P<0.05vsDMSO group;#P<0.05vsLV-GFP group.

圖618α-GA上調(diào)Nrf2對(duì)aNSCs活力的影響

718α-GA上調(diào)Nrf2對(duì)aNSCsROS水平的影響

ROS水平的檢測(cè)結(jié)果表明，P60組小鼠aNSCs的ROS水平較P0組明顯上升(P<0.05)，見圖7A。應(yīng)用2 mg/L的18α-GA作用于aNSCs，其ROS水平較DMSO組顯著下降(P<0.01)，若敲減Nrf2基因，LV-Nrf2-shRNA組的ROS水平較LV-GFP組上升約0.2倍(P<0.05)，提示18α-GA可能通過激活Nrf2降低aNSCs ROS水平，見圖7B。

Figure 7. Activation of Nrf2 by 18α-GA affected the ROS levels of aNSCs. A: the ROS level of aNSCs in P60 group was higher than that of newborn NSCs; B: after treated with 18α-GA at 2 mg/L, the ROS level of aNSCs was measured. Mean±SD.n=3.△P<0.05vsP0 group；**P<0.01vsDMSO group;#P<0.05vsLV-GFP group.

圖718α-GA上調(diào)Nrf2對(duì)aNSCsROS水平的影響

討 論

成年哺乳動(dòng)物的NSCs主要存在于SVZ與DG，具有自我更新和多向分化潛能。當(dāng)神經(jīng)組織受到損傷時(shí)，NSCs可以分化為神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的功能修復(fù)[5-6]。但是，有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道NSCs的標(biāo)志物神經(jīng)巢蛋白中間微絲(nestin)在成年鼠的SVZ表達(dá)水平較新生鼠明顯下降，并且成年之后NSCs增殖和分化能力逐月下降，神經(jīng)發(fā)生功能障礙，導(dǎo)致難以修復(fù)和更新受損的神經(jīng)組織[1, 7]。因此，維持成年體內(nèi)NSCs庫的穩(wěn)定性，并在腦損傷時(shí)有效激活內(nèi)源性aNSCs參與神經(jīng)修復(fù)，將有望為預(yù)防和治療神經(jīng)退行性疾病提供新途徑。已有研究發(fā)現(xiàn)DNA損傷、端粒長(zhǎng)度減少、氧化應(yīng)激以及錯(cuò)誤折疊蛋白的產(chǎn)生與累積等可以導(dǎo)致細(xì)胞活力下降[8-9]。氧化應(yīng)激是影響NSCs活力和引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要因素，當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)外環(huán)境的刺激時(shí)，ROS產(chǎn)生超過細(xì)胞的抗氧化能力，機(jī)體氧化與抗氧化系統(tǒng)之間的平衡破壞從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激。我們研究發(fā)現(xiàn)NSCs的氧化應(yīng)激水平隨年齡增長(zhǎng)逐漸增高。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，誘導(dǎo)NSCs發(fā)生氧化應(yīng)激會(huì)造成細(xì)胞活力下降和DNA損傷等，最終導(dǎo)致NSCs老化進(jìn)而死亡[10]。因此，抵抗細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激將是維持NSCs功能和活力的重要途徑。

研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2是內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，在氧化應(yīng)激條件下Nrf2 發(fā)生核轉(zhuǎn)位，與ARE結(jié)合，發(fā)揮抗氧化的保護(hù)作用[3, 11]。腦內(nèi)Nrf2的表達(dá)水平隨年齡增長(zhǎng)而顯著下降，且ROS水平在成年之后顯著上升，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)失衡[12]。有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道Nrf2基因敲除小鼠SVZ區(qū)NSCs的生存能力和增殖能力以及向神經(jīng)元方向的分化能力降低，嗅覺精細(xì)辨別能力受到損害[13]。敲除離體培養(yǎng)NSCs的Nrf2基因，神經(jīng)球的數(shù)量和體積顯著下降。相反，通過慢病毒感染過表達(dá)Nrf2可以使神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖分化能力增強(qiáng)，抵抗Aβ1-42產(chǎn)生的損害[14]。進(jìn)一步說明Nrf2與NSCs的活力密切相關(guān)，可以作為研究維持NSCs潛能的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

18α-GA是甘草中最重要的生物活性化合物的五環(huán)三萜糖苷，在胃腸道被微生物分解吸收，具有抗菌、消炎、抗氧化、抗衰老等作用。研究證明應(yīng)用18α-GA治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤，可使caspase-3蛋白表達(dá)水平增加，細(xì)胞固縮體形成，促使神經(jīng)母瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[15]。此外，Papaevgeniou等[16]發(fā)現(xiàn)18α-GA可以減少Aβ1-42對(duì)小鼠原代皮層神經(jīng)元的損害，降低細(xì)胞死亡率。目前有研究表明，18α-GA可以上調(diào)人胚胎成纖維細(xì)胞和小鼠神經(jīng)元Nrf2的表達(dá)水平，延長(zhǎng)人成纖維細(xì)胞的壽命，降低小鼠神經(jīng)元的ROS水平，并改變Keap1的構(gòu)象，抑制Nrf2泛素化，促進(jìn)Nrf2發(fā)生核轉(zhuǎn)位[4, 17]。入核后的Nrf2可以與ARE結(jié)合，從而啟動(dòng)下游解毒酶及抗氧化蛋白基因的轉(zhuǎn)錄，提高細(xì)胞的抗氧化能力[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)18α-GA可以上調(diào)aNSCs的Nrf2表達(dá)水平，促進(jìn)aNSCs的增殖分化，提高細(xì)胞活力，降低細(xì)胞氧化應(yīng)激水平。但是，敲減Nrf2后，18α-GA對(duì)aNSCs的保護(hù)作用受到影響，提示18α-GA可能通過激活Nrf2上調(diào)aNSCs活力。因此，18α-GA作為一種甘草活性化合物，可以有效誘導(dǎo)激活Nrf2，并且操作簡(jiǎn)便安全易于推廣，在細(xì)胞保護(hù)方面具有潛在的應(yīng)用前景。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 宋延君)

ActivationofNrf2by18α-GAaffectsproliferationofadultneuralstemcells

YANG Na1, ZHAO Yun-he1, HUANG Fei-fei1, LIU Qi-wei2, LU Li1

(1DepartmentofAnatomy，2DepartmentofBiologicalPharmacy,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China.E-mail:luli@sxmu.edu.cn)

AIM: To investigate the effect of nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2) activation by 18α-glycyrrhetinic acid (18α-GA) on the proliferation and self-renewal of adult neural stem cells (aNSCs), and to explore an effective way of maintaining the viability of aNSCs.METHODSNSCs were dissociated from subventricular zone of the mice at postnatal days 0, 60, and 300. The expression levels of Nrf2 in the NSCs at various ages were compared. After treatment with 18α-GA, the expression of Nrf2 was examined by real-time PCR and Western blot. shRNA lentiviral vector (LV) carrying green fluorescent protein (GFP) gene was constructed to knock downNrf2 expression. The knockdown efficiency in the aNSCs was detected by real-time PCR and Western blot. Subsequently, the aNSCs were divided into DMSO group, 18α-GA group, LV-GFP group and LV-Nrf2-shRNA group. BrdU incorporation assay, Tuj1 staining, CCK-8 assay, Hoechst 33342/PI staining and detection of reactive oxygen species (ROS) were performed to analyze the proliferation, differentiation, viability, apoptosis and oxidative stress levels of the NSCs.RESULTSThe mRNA expression level of Nrf2 in adult and aged NSCs was significantly lower than that in newborn NSCs (P<0.01), while the ROS level of aNSCs was significantly higher (P<0.05). After treatment with 18α-GA, the expression level of Nrf2 in the aNSCs was significantly up-regulated as compared with DMSO group (P<0.01). Increased number of BrdU+and Tuj1+cells was observed in 18α-GA group， indicating that 18α-GA-treated cells had higher viability (P<0.05). Meanwhile, there were fewer apoptotic cells and lower ROS level in 18α-GA group than those in DMSO group (P<0.05). After knockdown ofNrf2 in aNSCs and then treated with 18α-GA, there were less BrdU+and Tuj1+cells, as well as the aNSCs with lower viability in LV-Nrf2-shRNA group (P<0.05). Moreover, the ROS level was increased in LV-Nrf2-shRNA group as compared with LV-GFP group (P<0.05).CONCLUSIONActivation of Nrf2 by 18α-GA elevates the antioxidant capacity of aNSCs， thus ameliorating the cell proliferation and differentiation potentials.

18α-glycyrrhetinic acid； Adult neural stem cells; Nuclear factor E2-related factor 2; Cell proli-feration; Cell differentiation; Mice

R741； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.10.002

1000- 4718(2017)10- 1738- 08

2017- 03- 30

2017- 07- 07

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81571381)；山西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 2015011132)；山西醫(yī)科大學(xué)校級(jí)博士啟動(dòng)基金(No. 03201604)

△通訊作者 Tel: 0351-4135781; E-mail: luli@sxmu.edu.cn

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