張海峰，鄭士亞，歐陽彬，楊登元，劉文慶，田繼輝*

(1.江蘇省南京市中心醫(yī)院外科，江蘇 南京 210000；2.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，江蘇 南京 210000；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬總醫(yī)院神經(jīng)外科，寧夏 銀川750004)

·論著·

阿霉素聯(lián)合熱療、程序死亡受體配體1抗體對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的影響

張海峰1，鄭士亞2，歐陽彬1，楊登元1，劉文慶3，田繼輝3*

(1.江蘇省南京市中心醫(yī)院外科，江蘇 南京 210000；2.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，江蘇 南京 210000；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬總醫(yī)院神經(jīng)外科，寧夏 銀川750004)

目的探討阿霉素聯(lián)合熱療、程序死亡受體配體1抗體對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制作用，以及阿霉素聯(lián)合熱療對(duì)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面程序死亡受體配體1表達(dá)的影響。方法采用CCK-8法確定阿霉素的半抑制濃度。建立U251與T細(xì)胞共培養(yǎng)體系，采用CCK-8法檢測(cè)不同處理組(阿霉素組，熱療組，程序死亡受體配體1抗體組，阿霉素聯(lián)合熱療組，阿霉素聯(lián)合程序死亡受體配體1抗體組，熱療聯(lián)合程序死亡受體配體1抗體組，阿霉素聯(lián)合熱療、程序死亡受體配體1抗體組)的細(xì)胞增殖抑制率。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)阿霉素聯(lián)合熱療對(duì)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面程序死亡受體配體1表達(dá)的影響。結(jié)果阿霉素聯(lián)合熱療、程序死亡受體配體1抗體相比單一治療方法抑制細(xì)胞增殖能力更強(qiáng)；阿霉素聯(lián)合熱療可以上調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面程序死亡受體配體1的表達(dá)。結(jié)論阿霉素聯(lián)合熱療、程序死亡受體配體1抗體是一種很有前景的聯(lián)合治療膠質(zhì)瘤方式，可為未來進(jìn)一步探索膠質(zhì)瘤治療新策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤；免疫療法；溫?zé)岑煼?；阿霉?/p>

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，大約占所有顱內(nèi)腫瘤的50%，占所有原發(fā)性腦腫瘤的15%。目前，以手術(shù)切除為主的綜合治療是神經(jīng)膠質(zhì)瘤的主要治療方法，然而由于膠質(zhì)瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，惡性程度高，增殖、遷移侵襲性強(qiáng)，膠質(zhì)瘤患者的生存期仍然很短，預(yù)后不容樂觀[1]。因此，探索新的有效的治療方法至關(guān)重要。近10年來，免疫治療取得了突破性進(jìn)展，這很大程度上歸功于免疫控卡點(diǎn)尤其是免疫負(fù)性調(diào)控點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)[2-5]?；诔绦蛩劳鍪荏w1(programmeddeath-1,PD-1)和程序死亡受體配體1(programmeddeathligand-1,PD-L1)的免疫治療成為免疫治療中的主力軍[6-7]。其對(duì)黑色素瘤、肺癌、腎癌、胃癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、乳腺癌等均顯示出良好的效果[8-10]。但單用PD-1/PD-L1抑制劑還是不能使所有患者獲益。為此，本研究探索一種聯(lián)合治療模式，即PD-L1抑制劑聯(lián)合阿霉素聯(lián)合熱療，并觀察阿霉素聯(lián)合熱療對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)的影響，旨在為尋求膠質(zhì)瘤有效的聯(lián)合治療方法提供理論依據(jù)。

1 資 料 與 方 法

1.1 細(xì)胞與試劑 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251為東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院外科研究所提供；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；鹽酸阿霉素由深圳萬樂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；PD-L1抗體購(gòu)自Bioxcell公司；PE-PD-L1抗體購(gòu)自Biolegend公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞傳代培養(yǎng) 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～5d更換培養(yǎng)液傳代。實(shí)驗(yàn)采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.3 藥物半抑制濃度(half-inhibitoryconcentration，IC50)的確定 離心收集U251細(xì)胞，用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋成2×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接種至96孔板；阿霉素稀釋成8個(gè)濃度組(0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00mg/L)加入96孔板中。孵育48h后加入10μLCCK-8試劑，4h后取出96孔板，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔OD值，參比波長(zhǎng)為650nm。計(jì)算各濃度組細(xì)胞活性率=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%，繪制濃度-細(xì)胞活性率曲線并擬合方程，計(jì)算IC50。

1.4CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率

1.4.1 外周血T淋巴細(xì)胞的制備 征得膠質(zhì)瘤患者同意后，取其外周血。采用Ficoll密度梯度離心，1 800r/min，30min，小心吸取白膜層即獲得人外周單個(gè)核細(xì)胞，加入細(xì)胞因子CD28、IL-2，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育。

1.4.2U251與T細(xì)胞共培養(yǎng)體系建立 取制備好的人T細(xì)胞(1×105/孔)和U251細(xì)胞(2×104/孔)接種于96孔板，建立200μL/孔體系。

1.4.3 細(xì)胞分組 將U251與T細(xì)胞共培養(yǎng)體系分為8組：對(duì)照組、阿霉素組、熱療組、PD-L1抗體組、阿霉素聯(lián)合熱療組、阿霉素聯(lián)合PD-L1抗體組、熱療聯(lián)合PD-L1抗體組、阿霉素聯(lián)合熱療和PD-L1抗體組。其中對(duì)照組未予任何干預(yù)；阿霉素濃度選用IC50(4mg/L)；熱療采用電熱恒溫水浴箱加熱1h，溫度為43 ℃；PD-L1抗體濃度1.5mg/L。

1.4.4 細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè) 各組于干預(yù)48h加入CCK-8試劑10μL/孔，酶標(biāo)儀450nm處測(cè)定各孔OD值，參比波長(zhǎng)為650nm。計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值)×100%。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)U251細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)

1.5.1 細(xì)胞分組U251細(xì)胞(2×104/孔)接種于96孔板，細(xì)胞分為未干預(yù)組、阿霉素單藥組、單一熱療組、阿霉素單藥聯(lián)合熱療組。

1.5.2PD-L1表達(dá)檢測(cè) 各組作用48h后，胰酶消化處理，PE-PD-L1抗體避光孵育30min，PBS洗2次，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較分別采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 阿霉素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的IC50 采用不同濃度阿霉素作用于U251細(xì)胞，48h后觀察阿霉素對(duì)細(xì)胞增殖的影響，可見呈濃度依賴性，曲線呈反“S”形，IC50 的阿霉素濃度為4.298mg/L，后期實(shí)驗(yàn)取4mg/L。

2.2 各組細(xì)胞48h增殖抑制率的比較 阿霉素單藥、PD-L1抗體單藥以及單獨(dú)應(yīng)用熱療組對(duì)U251細(xì)胞均有增殖抑制作用；聯(lián)合用藥組較單藥組增殖抑制更為明顯(P<0.05)；在聯(lián)合組中，阿霉素+熱療+PD-L1抗體組的增殖抑制作用最強(qiáng)，達(dá)(92.2±4.5)%，提示三者有明顯協(xié)同作用。見表1。

表1 作用于U251細(xì)胞48 h后不同處理組細(xì)胞增殖抑制率比較Table 1 Cell proliferation inhibition rate of U251 cells after different treatment

*P<0.05與阿霉素單藥組比較 #P<0.05與熱療組比較 △P<0.05與PD-L1抗體組比較 ☆P<0.05與阿霉素+PD-L1抗體組比較 ▲P<0.05與阿霉素+熱療組比較 ★P<0.05與熱療+PD-L1抗體組比較(SNK-q檢驗(yàn))

2.3 各組細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá) 未干預(yù)組PD-L1表達(dá)率為(65±8)%，阿霉素單藥作用后PD-L1表達(dá)率更加增高，阿霉素聯(lián)合熱療也可明顯上調(diào)PD-L1表達(dá)(P<0.05)；而單一熱療對(duì)PD-L1的表達(dá)影響不大(P>0.05)。見表2。

表2 處理后各組細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)比較Table 2 The expression of PD-L1 after different treatment

*P<0.05與未干預(yù)組比較 #P<0.05與阿霉素單藥組比較(SNK-q檢驗(yàn))

3 討 論

膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤之一。近年來，以手術(shù)、放療、化療和靶向治療為主的綜合治療均取得了一定進(jìn)展，但膠質(zhì)瘤患者的長(zhǎng)期生存率仍然較低。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞可通過免疫耐受和逃逸機(jī)制使得自身免受宿主防御機(jī)制的殺傷和清除，其中PD-L1與PD-1相互作用介導(dǎo)的負(fù)性協(xié)同刺激信號(hào)在腫瘤的免疫逃逸中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。PD-L1廣泛表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞，當(dāng)受體與配體結(jié)合可抑制下游NF-κB的轉(zhuǎn)錄并促使干擾素-δ分泌的下調(diào)，最終抑制T細(xì)胞免疫，導(dǎo)致免疫抑制性腫瘤微環(huán)境形成，使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)控和殺傷。而阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)通路可以逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫微環(huán)境，恢復(fù)T細(xì)胞的抗腫瘤活性，從而增強(qiáng)內(nèi)源性抗腫瘤免疫效應(yīng)[11]。目前，美國(guó)FDA批準(zhǔn)了2個(gè)具有劃時(shí)代意義的免疫治療藥物：針對(duì)PD-1的抗體Nivolizumab和Pembrolizumab，用于黑色素瘤和晚期非小細(xì)胞肺癌治療。針對(duì)PD-L1的抗體MPDL3280A在肺癌、黑色素瘤等臨床研究中也取得了可喜的成績(jī)[12-13]。免疫檢查點(diǎn)抑制劑的出現(xiàn)改寫了腫瘤治療的歷史，將腫瘤的藥物治療向前推進(jìn)了一大步。這些成功的臨床案例為免疫檢查點(diǎn)抑制劑在膠質(zhì)瘤中的應(yīng)用提供了實(shí)踐基礎(chǔ)。盡管免疫檢查點(diǎn)抑制劑(抗PD-1、PD-L1單抗)在腫瘤藥物治療中取得了重大進(jìn)展，但目前臨床上仍然面對(duì)兩大亟待解決的問題：①腫瘤患者的獲益人群仍然是有限的；②不能根治腫瘤，不能帶來徹底的臨床療效。對(duì)于前者，已經(jīng)進(jìn)行了大量的相關(guān)性因素分析，研究認(rèn)為PD-L1高表達(dá)的患者其臨床獲益率更高；對(duì)于后者，原因復(fù)雜，可能與表觀遺傳學(xué)的改變、免疫基因突變等因素有關(guān)。為了進(jìn)一步使免疫檢查點(diǎn)抑制劑在腫瘤治療中發(fā)揮更大的作用，很多學(xué)者開始探索免疫治療聯(lián)合其他傳統(tǒng)治療方法的新策略，以期進(jìn)一步增大獲益人群、延長(zhǎng)患者生存期[14-15]。

化療是腫瘤治療的重要手段之一，細(xì)胞毒性化療藥物能夠改變腫瘤微環(huán)境的免疫抑制情況。環(huán)磷酰胺能夠耗竭抑制性地調(diào)節(jié)T細(xì)胞，使用該藥能夠提高免疫反應(yīng)。此外，其他一些化療藥物，如5-氟尿嘧啶、吉西他濱、紫杉類藥物能夠降低骨髓來源的抑制性細(xì)胞的數(shù)量。阿霉素是臨床上常用的化療藥物，有研究顯示阿霉素聯(lián)合抗PD-1和CTLA-4 抗體可以增強(qiáng)抗腫瘤效果[16]。目前已經(jīng)開始進(jìn)行免疫治療聯(lián)合化療或雙免疫治療聯(lián)合治療肺癌的臨床研究，初步結(jié)果顯示聯(lián)合組有更好的治療效果，高級(jí)別不良反應(yīng)事件雖然增加，但可以控制，并且未出現(xiàn)治療相關(guān)死亡事件[17]。因此，化療聯(lián)合PD-L1抑制劑有可能存在協(xié)同抗腫瘤作用。腫瘤熱療是通過物理方法將組織加熱治療腫瘤，現(xiàn)已成為繼手術(shù)、放療、化療、免疫治療、靶向治療之后的又一類治療手段。腫瘤熱療是泛指用加熱來治療腫瘤的一類治療方法。在治療晚期肺癌患者時(shí)，熱化療聯(lián)合白細(xì)胞介素2可以很好地控制胸腔積液[18]。體外高頻熱療配合體內(nèi)γ刀和化療聯(lián)合治療晚期肺癌顯示出了更好的療效[19]。聯(lián)合應(yīng)用熱療與化療即熱化療，可以提高腫瘤區(qū)域的藥物濃度，同時(shí)降低正常組織的毒性作用，是為增效減毒。同時(shí)熱療可以使大量腫瘤抗原暴露，激活機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)T細(xì)胞殺傷活性[20-21]?；谶@些理論以及實(shí)踐基礎(chǔ)，本研究合理聯(lián)合3種治療手段，探究對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，其聯(lián)合抗腫瘤的具體機(jī)制如下：①PD-L1抑制劑阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)通路可以逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫微環(huán)境，恢復(fù)T細(xì)胞的抗腫瘤活性，從而增強(qiáng)內(nèi)源性抗腫瘤免疫效應(yīng)；②化療是晚期腫瘤治療基石，可直接有效降低瘤負(fù)荷，通過腫瘤壞死暴露新抗原，還可以上調(diào)PD-L1，從而可以聯(lián)合PD-L1單抗的免疫治療；③熱療直接殺死腫瘤的同時(shí)也可暴露腫瘤抗原；④熱療可以使腫瘤局部升溫，增加化療藥物的局部富集。本研究結(jié)果顯示，與單一方法治療相比，三者聯(lián)合抑制腫瘤細(xì)胞增殖的能力最強(qiáng)。提示3種方法聯(lián)合治療膠質(zhì)瘤可能成為神經(jīng)膠質(zhì)瘤新的聯(lián)合治療模式。

目前認(rèn)為PD-L1高表達(dá)與使用PD-1/PD-L1患者的臨床獲益呈正相關(guān)。Berghoff等[22]對(duì)135例神經(jīng)膠質(zhì)瘤的標(biāo)本檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，原發(fā)膠質(zhì)瘤的PD-L1表達(dá)率達(dá)88%，繼發(fā)膠質(zhì)瘤的PD-L1表達(dá)率達(dá)72%，膠質(zhì)瘤的PD-L1表達(dá)率比其他腫瘤高。本研究對(duì)處理前后的腫瘤細(xì)胞PD-L1的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示阿霉素可以提高PD-L1的表達(dá)，阿霉素聯(lián)合熱療更明顯提高PD-L1的表達(dá)。因此，阿霉素可能通過上調(diào)PD-L1的表達(dá)增敏PD-L1抗體抗腫瘤作用。

綜上所述，阿霉素化療聯(lián)合熱療、PD-L1抗體免疫治療可以協(xié)同抗腫瘤細(xì)胞增殖，為膠質(zhì)瘤的治療提供新的思路。但本研究仍存在不足之處，如細(xì)胞株種類少、機(jī)制探究不夠深入。未來，尚需要大量的基礎(chǔ)研究和臨床研究對(duì)其效果加以證實(shí)。

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(本文編輯：許卓文)

Effectsofadriamycincombinedwiththermotherapyandimmunotherapyongliomacells

ZHANGHai-feng1，ZHENGShi-ya2，OUYANGBin1,YANGDeng-yuan1,LIUWen-qing3，TIANJi-hui3*

(1.DepartmentofSurgery,NanjingCenterHospital,JiangsuProvince,Nanjing210000,China; 2.DpeartmentofOncology,MedicalSchoolofSoutheastUniversity，Nanjing210000,China; 3.DepartmentofNeurosurgery,GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China)

ObjectiveTo observe the effect of adriamycin combined with thermotherapy and anti-programmed cell death ligand-1(PD-L1) antibodies on cell proliferation in U251 glioma cells, and to explore the expression of PD-L1 of U251 glioma cells after being treated with adriamycin and/or thermotherapy.MethodsIC50 of adriamycin for U251 cells was determined by CCK-8 assay. The U251 cells were divided into several groups according to different treatments, then the viability of cells were measured by CCK-8 assay. The expression of PD-L1 on the surface of U251 cells was determined by flow cytometry after treated with adriamycin and/or thermotherapy.ResultsAdriamycin combined with thermotherapy and anti-PD-L1 antibodies could inhibit glioma cells growth obviously compared with other groups. Adriamycin combined with thermotherapy could up-regulate the expression of PD-L1.ConclusionAdriamycin combined with thermotherapy and anti-PD-L1 antibodies is a promising treatment regime for glioma and our research provides theoretical basis for the combination of adriamycin, thermotherapy and immunotherapy in glioma treatment.

glioma;immunotherapy;thermotherapy；adriamycin

R730.264

A

1007-3205(2017)10-1144-04

2017-01-03；

2017-02-04

張海峰(1988-)，男，山東泰安人，江蘇省南京市中心醫(yī)院住院醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事膠質(zhì)瘤診治研究。

*通訊作者。E-mail:nxtjh1968@163.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.10.007