□ 梁文文 本刊記者

河豚毒素的新國標與檢測

□ 梁文文 本刊記者

講座導師簡介：

倫麗麗，江蘇美正生物科技有限公司（以下簡稱“美正生物”）運營總監(jiān),全面負責采購、生產、質量控制、產品評價、技術支持、倉管物流等部門的工作。曾參與多項新產品研發(fā)及評價，申報多項國家專利，發(fā)表論文1篇。組建了膠體金產品/ELISA試劑盒/化學方法試劑/儀器設備生產團隊、質量控制團隊以及特色技術服務團隊，為美正生物產品的銷售提供全方位技術保障，形成了美正生物的特色技術服務模式，在美正生物的快速發(fā)展及品牌形象的樹立中起到了關鍵作用。

在中國古代人們便對河豚毒素的毒性有了深刻認識。晉人左思《三都賦·吳都賦》便有“王鮪鯸鮐”之句，其注曰：“鯸鮐魚狀，如蝌蚪，大者尺余，腹下白，背上青黑，有黃紋，性有毒?！鄙蚶ㄔ凇秹粝P談》中說：“吳人嗜河豚魚，有遇毒者，往往殺人，可為深戒?！奔幢闳绱耍与嗟孽r美仍使人趨之若鶩，所以長久以來就有“拼死吃河豚”的說法。隨著科學技術的進步，人類可以運用檢測手段來避免河豚毒素造成的傷害，而如何檢測河豚毒素是防止人們中毒的重中之重。檢測技術的改進，使得檢測標準也有了變化。在由《食品安全導刊》、食安中國網共同舉辦的線上專題研討會“食安大講堂”中，美正生物運營總監(jiān)倫麗麗圍繞“河豚毒素檢測技術”進行了詳細的闡述。

什么是河豚毒素？

河豚毒素是一種通俗的說法，其學名為河鲀毒素（TTX），是鲀魚類（俗稱河豚魚）及其它生物體內含有的一種生物堿，也是自然界中所發(fā)現(xiàn)的毒性最大的神經毒素之一，曾一度被認為是自然界中毒性最強的非蛋白類毒素。TTX的毒性比氰化物高1250多倍，0.5mg即可致人喪命。TTX對腸道有局部刺激作用，吸收后會迅速作用于人的神經末梢及神經中樞，并可高選擇性和高親和性地阻斷神經興奮膜上的鈉離子通道，阻礙神經傳導，從而引起神經麻痹甚至死亡。

TTX是起源于生物體本身還是其寄生物尚有爭議，因為河鲀毒素及類似物不僅存在于各種鲀科魚類中，還廣泛分布于各種高等、低等生物中。其他含有河鲀毒素的生物有一個共同點，即其體內含有多種能分泌毒素及其類似物的細菌，這些生物體內毒素的積累和分布因季節(jié)和部位不同而存在差異。

解讀新國標

GB 5009.206-2016《食品安全國家標準 水產品中河豚毒素的測定》于2016年12月23日發(fā)布，2017年6月23日實施，新標準規(guī)定了水產品中河豚毒素的4種測定方法。第一法為小鼠生物法，適用于河豚魚肌肉、肝臟、皮膚和性腺組織中河豚毒素的測定。與舊有國標SNT 1569.2-2013《出口河豚魚中河豚毒素檢測方法 第2部分：小鼠生物法》相比，新國標樣本的適用性更強，可用于檢測河豚魚的性腺組織。第二法為液相色譜串聯(lián)質譜法，適用于河豚魚肌肉、肝臟、皮膚和性腺組織中河豚毒素的測定。原標準中液相色譜串聯(lián)質譜法是一種確認方法，而新國標中將此單獨作為檢測方法。第三法是液相熒光法，適用于河豚魚、織紋螺、蝦、牡蠣、花蛤和魷魚中河豚毒素的測定。以免疫親和層析柱代替C18固相萃取柱進行提取凈化，這兩種方法代替了原有國標GB/T 23217-2008《水產品中河豚毒素的測定 液相色譜-熒光檢測法》。第四法是酶聯(lián)免疫吸附法，適用于河豚魚肝臟、皮膚和性腺組織中河豚毒素的測定，本法代替了GB/T 5009.206-2007《鮮河豚魚中河豚毒素的測定》，原有國標采用直接酶聯(lián)免疫吸附法，而新版國標采用的是間接酶聯(lián)免疫吸附法。

河豚毒素的檢測技術

雖然新國標中規(guī)定了4種方法，但在實驗室檢測或市場監(jiān)督檢測時適用程度仍有不同，倫麗麗向聽眾介紹了3種適用性較強的方法—液相色譜串聯(lián)質譜法、酶聯(lián)免疫試劑盒法及膠體金快速檢測法。

液相色譜串聯(lián)質譜法：此方法的關鍵是前處理，首先稱取2g樣品，加入10mL 1%乙酸-甲醇溶液，渦旋振蕩3min，然后放入40℃水浴中超聲提取15min，待冷卻至室溫后，于6000r/min的離心機中離心5min，從離心管中取7mL上清液加入28mL PBS溶液進行稀釋，用適量的1N氫氧化鈉溶液調整pH值至7左右。然后用玻璃微纖維濾紙過濾，除去雜質后移取其中10mL濾液，采用親和免疫層析柱經過梯度洗脫的方式對濾液進行凈化，使用免疫親和層析柱時應注意上樣液為中性環(huán)境（pH值7～8），上樣時液滴流速控制在1～2滴/秒，洗脫液流速控制在1滴/秒。洗脫時建議加入2mL洗脫液，靜置浸泡2min后再開始洗脫；當洗脫液超過柱容量時，因檢測數(shù)據(jù)偏低待測物質將不能被有效捕獲，可加大稀釋倍數(shù)后再通過免疫親和柱進行富集。進行色譜分析時，色譜柱一般采用規(guī)格為2.1×50mm，1.7μm的Amide柱，其流動相A為含0.1%（體積分數(shù)）甲酸的乙酸銨（5moL/L）溶液，流動相B為乙腈，流速控制在0.3mL/min，進樣體積為10μL。以上為色譜分析流程，色譜分析過后再進行質譜分析，即完成此方法的全部流程。

酶聯(lián)免疫試劑盒法：酶聯(lián)免疫競爭法包括直接競爭法和間接競爭法。競爭法的原理為樣本中的抗原和一定量的固相抗原競爭結合一定量的抗體，而后與酶標二抗反應，待測樣本中抗原越多，與固相抗原結合的抗體及酶標二抗越少，顯色越淺；反之，待測樣本中抗原越少，顯色越深。酶聯(lián)試劑盒測定河豚毒素的含量分為兩個部分，一是樣品的測定，二是標準曲線的制作，兩部分檢測步驟相同。取2g樣本，加入4mL提取液，提取5min，在4000rpm下離心10min。取上清液進行檢測。檢測步驟為加入標準品/樣本50μL/孔到對應的微孔中，再加入酶標物50μL/孔，然后再加入抗試劑50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置于25℃避光環(huán)境中反應30min。揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，用洗滌工作液250μL/孔，充分洗滌4～5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用新槍頭戳破）。加入底物液A液50μL/孔，再加底物液B液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應15min使之顯色。最后加入終止液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內讀完數(shù)據(jù)），測定每孔OD值。

使用美正生物的酶聯(lián)免疫試劑盒制作的標準曲線線性相關系數(shù)可達0.99以上，最低檢出限可達4μg/kg，檢測范圍為4～324ppb。

免疫親和柱

膠體金快速檢測法：此法與酶聯(lián)免疫試劑盒法均為實驗室快速檢測方法。具體操作步驟為取3g樣本，加入2mL試劑A，劇烈震蕩5min，在4000rpm下離心5min，取1mL上清液加入10μL試劑B，混勻。取100μL混合液進行點卡檢測，5min后即可對結果進行判讀。消線法的檢出限200μg/kg，比色法的檢出限35μg/kg，此方法具有簡單、快速、準確和無污染等優(yōu)點。

美正生物

美正生物坐落于江蘇省無錫市高新開發(fā)區(qū)，是一家專注于食品安全快速檢測產品研發(fā)、生產、銷售和服務的高科技創(chuàng)新企業(yè)。同時，美正生物為食藥監(jiān)系統(tǒng)、農業(yè)系統(tǒng)、畜牧系統(tǒng)、漁業(yè)系統(tǒng)、食品企業(yè)等提供專業(yè)的檢測產品、先進的技術支持和高效的整體解決方案。美正生物始終堅持用最專業(yè)的產品、最優(yōu)秀的團隊和最完善的服務，服務于用戶；始終堅持“試劑領先”的核心戰(zhàn)略，堅持設備為實際檢測服務的理念，為政府和企業(yè)提供全方位的食品安全檢測技術和整體解決方案。