彭偉, 黎江華, 劉玉杰, 吳純潔, 蔣淼，廖博，蘇軒藝

浙貝母花脂肪油成分和生物活性研究

彭偉, 黎江華, 劉玉杰, 吳純潔, 蔣淼，廖博，蘇軒藝

目的：研究浙貝母花脂肪油（CFD）的化學(xué)成分和生物活性。方法：采用氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）對CFD化學(xué)成分進行分析。采用DPPH自由基清除實驗評價CFD的抗氧化活性；采用小鼠醋酸扭體實驗對CFD鎮(zhèn)痛活性進行研究。結(jié)果：實驗結(jié)果表明CFD中主要為不飽和脂肪酸（46.96%）、飽和脂肪酸（16.83 %）：(9Z, 12Z, 15Z)-octadeca-9,12,15-trienoic acid (26.55 %)、Linoleic acid (20.41 %)、Palmitic acid (16.43 %)。抗氧化實驗結(jié)果表明CFD有較強的DPPH自由基清除能力，其半數(shù)清除率(EC50)為4.57 mg/mL；醋酸扭體實驗結(jié)果表明，和對照組小鼠相比，CFD灌胃（100 mg/kg和200mg．kg-1）不僅能顯著降低小鼠扭體次數(shù)(p＜ 0.05,p＜ 0.01)，還能延長小鼠扭體潛伏時間(p＜ 0.05,p＜ 0.01)。結(jié)論：浙貝母花脂肪油含有豐富的不飽和脂肪酸，并且具有潛在的抗氧化和鎮(zhèn)痛活性。

Fritillaria thunbergiiMiq；貝母花；脂肪油；不飽和脂肪酸；抗氧化；鎮(zhèn)痛

浙貝母為百合科（Liliaceae）貝母屬植物浙貝母Fritillaria thunbergiiMiq. 的干燥鱗莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，具有化痰、止咳和平喘等多種功效；收載于歷版中國藥典，用于治療痰熱咳嗽，咯痰帶血、瘡瘍腫毒[1]等。目前，國內(nèi)外對于浙貝母鱗莖部分化學(xué)成分和藥理活性的研究報道很多，但是對于其莖葉花等地上部分研究報道較少。Kawasaki等曾經(jīng)對浙貝母地上莖葉進行了化學(xué)成分研究，僅從中分離得到浙貝甲素、浙貝乙素等幾個生物堿[2]；國內(nèi)學(xué)者嚴銘銘等，從中分離得到丁香脂素、2，5-二甲基苯醌等幾個化合物[3]。然而，對于浙貝母地上部分脂肪油類成分的化學(xué)成分和生物活性研究，尚未有系統(tǒng)研究報道。

1 實驗方法和材料

1.1 實驗動物

ICR小鼠，體重18～22g，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供；動物飼養(yǎng)在室溫21±1℃、12小時晝夜正常交替的環(huán)境下，可自由攝取食物和水。每只實驗動物在實驗中只用一次。動物實驗程序均得到第二軍醫(yī)大學(xué)動物管理與倫理委員會同意。

1.2 藥材和脂肪油的制備

浙貝母花藥材采自浙江省磐安縣，經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)秦路平教授鑒定為百合科貝母屬植物浙貝母F.thunbergii 的花。取浙貝母花自然干燥后粉碎，用70 %乙醇回流提取，回收溶劑后得到總提物（TE），總提取物與等量的水混懸后用乙酸乙酯萃取得到乙酸乙提取物。將乙酸乙酯部位經(jīng)硅膠柱色譜，進行洗脫，收集以石油醚-乙酸乙酯（30∶1-15∶1）洗脫下來的脂肪族流分，合并蒸干，即為浙貝母花脂肪油（CFD）。

1.3 GC/MS分析

采用美國Thermo Focus DSQ 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對CFD進行成分分析。色譜柱為：TR-5 (30 m ×0.25 mm × 0. 25 μm) 色譜柱。

具體GC/MS條件如下：

色譜條件：進樣口溫度220 ℃；起始溫度70℃，以10 ℃/ min升至220 ℃，保持5 min；以5 ℃/min 升至280 ℃，保持10 min ；載氣：He； 流速：1mL/min；進樣方式：分流比 10：1，進樣量：1μL。

質(zhì)譜條件: 電離方式EI ：電離能量70 eV ；離子源溫度：250 ℃；傳輸線溫度：250℃；掃描范圍：30-700amu。結(jié)果與質(zhì)譜標準庫（NIST）進行比對，分析CFD中主要化學(xué)成分。

1.4 DPPH自由基清除率實驗

將CFD用DMSO稀釋得到濃度為20、16、12、8、4、2和1 mg/mL的一系列樣品溶液。取一塊96孔板，加入新鮮配制的DPPH (0.4 mg/mL)，100 μL/孔，待篩樣品100 μL /孔，空白孔加DMSO溶液100 μL /孔，充分混勻，樣品在孔內(nèi)濃度為：10、8、6、4、2、1和0.5 mg/mL。封板后室溫下避光靜置30分鐘，酶標儀上測定吸光度值，波長540 nm。樣品對DPPH清除率按下式計算： DPPH? 清除率 (%) = (AB) / A × 100%，A：空白對照組化學(xué)發(fā)光強度值，B：加樣品組化學(xué)發(fā)光強度值，最后計算出半數(shù)清除率EC50。

1.5 小鼠醋酸扭體實驗

將ICR小鼠按體重隨機分組，雌雄各半，每組10只。分為空白對照、陽性對照（吲哚美辛）、CFD組（50，100和200 mg/kg）。造模前1h灌胃給藥，0.2 mL/10g。灌胃后1h造模，腹腔注射濃度為0.7%的醋酸溶液，0.1 mL/10g。記錄15分鐘內(nèi)小鼠的扭體次數(shù)和扭體潛伏期。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有實驗數(shù)據(jù)均表示為x± SD，組間差異采用雙尾Student's t-test進行檢驗，p＜ 0.05 被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CFD化學(xué)成分分析

如圖1和表1所示，共有24個成分從貝母花脂肪油中被鑒定，代表了90.46 %的CFD組成。根據(jù)GC-MS結(jié)果，CFD中主要成分為(9Z, 12Z, 15Z)-octadeca-9,12,15-trienoic acid (26.55 %)、linoleic acid (20.41%)、Palmitic acid (16.43 %)、nonacosane (9.33%)、(Z, Z, Z)-9,12,15-octadecatrienoic acid和methyl ester(2.44%)。對CFD中化學(xué)成分進行分類，結(jié)果見表2，可知CFD含大量的不飽和脂肪酸類和飽和脂肪酸類成分，分別占脂肪油中比例為46.96%和16.83%。

圖1 浙貝母花脂肪油GC–MS 總離子流圖

表1 CFD化學(xué)成分分析.

8-m e t h y l- h e p t a d e c a n e 2 4.7 0 0.2 6 m o n o e t h y l h e x y l p h t h a l a t e 2 5.5 1 1.9 3 T e t r a t r i a c o n t a n e 2 8.2 1 0.4 4 1-H e n e i c o s y l f o r m a t e 2 8.3 3 0.5 7 m e t h y l o c t a d e c a n o i c a c i d 2 8.8 3 0.1 3 1 0-m e t h y l n o n a d e c a n e 2 9.8 0 0.3 3 E i c o s a n e 3 0.7 3 0.4 5 N o n a c o s a n e 3 1.3 2 9.3 3 9-H e x a c o s e n e 3 1.4 7 0.8 2 T o t a l i d e n t i f i e d 9 0.4 6

表2 Compositions of the CFD from fl owers ofF. thunbergii.

2.2 DPPH自由基清除能力實驗結(jié)果

貝母花脂肪油（CFD）DPPH自由基清除實驗結(jié)果見圖3，本次研究表明 CFD具有較強的DPPH自由基清除能力。在0.5～10 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，可見明顯的濃度依賴關(guān)系，經(jīng)過統(tǒng)計分析后可知，CFD對DPPH自由基的半數(shù)清除率EC50為4.57 mg/mL。以上結(jié)果提示，CFD具有潛在的抗氧化和抗自由基作用。

圖2 DPPH自由基清除能力實驗結(jié)果 實驗數(shù)據(jù)表示為SD (n = 4)

圖3 CFD對醋酸致痛小鼠扭體扭體次數(shù)(A)和 潛伏期(B)的影響. 實驗數(shù)據(jù)表示為SD (n = 10)，*p ＜ 0.05; **p ＜ 0.01 vs. Control.

2.3 貝母花脂肪油對醋酸致痛小鼠扭體次數(shù)和潛伏期的影響

如圖3所示，與對照組小鼠相比，灌胃給予CFD（100, 200 mg/kg）能顯著減少小鼠在醋酸致痛后的扭體次數(shù)（p＜ 0.05,p＜ 0.01）并能顯著延長小鼠扭體的潛伏期（p＜ 0.05,p＜ 0.01）。 以上實驗表明，浙貝母花脂肪油具有潛在的鎮(zhèn)痛作用。

3 討論

不飽和脂肪酸具有廣泛的生物活性，包括抗氧化、抗腫瘤、降壓、降脂以及提高免疫力等，人體攝入足量的脂肪酸有益于保持健康[4,5]。本次研究表明浙貝母花脂肪油中含有大量的不飽和脂肪酸（46.96%）如 (9Z, 12Z, 15Z)-octadeca-9,12,15-trienoic acid （28.55 %）和linoleic acid（18.41 %）；因此，浙貝母花脂肪油有益于人體健康。人體不斷的生化反應(yīng)會帶來活性氧（ROS）自由基的產(chǎn)生；在正常的情況下，產(chǎn)生的自由基和人體自身的自由基清除能力是處于動態(tài)平衡的，不會造成人體損傷。然而，當(dāng)人體自身清除能力降低時，ROS會大量積聚在體內(nèi)而引起細胞和組織損傷，造成人體衰老、慢性心臟疾患甚至癌癥[6,7]。近年來，DPPH自由基清除實驗被廣泛用于評價藥物的自由基清除能力和抗氧化能力[7,8]。DPPH自由基是一種穩(wěn)定的長壽命自由基，溶于有機溶劑呈紫色，在517nm左右有強吸收，有自由基清除劑存在時，DPPH自由基的孤電子被配對，使其顏色變淺，在最大吸收波長處的吸光度變小。因此，可通過在此波長處吸光度的測定來評價抗氧化劑的抗氧化活性，其吸光值愈低，表示試樣清除DPPH自由基的能力愈強。本次實驗表明，浙貝母花脂肪油具有一定的自由基清除能力，其EC50值為4.57 mg/mL。小鼠醋酸扭體實驗是常見的鎮(zhèn)痛藥物篩選模型，能模擬典型的炎癥性疼痛且具備高靈敏性[9,10]。本次實驗也結(jié)果證明了貝母花脂肪油具備一定的鎮(zhèn)痛作用，能抑制醋酸引起的小鼠扭體次數(shù)和延長扭體潛伏期。

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（責(zé)任編輯：胡慧玲）

Chemical constituents and bioactivities of the fatty acids of fl owers of Fritillaria thunbergii Miq./

PENG Wei, LI Jiang-Hua, LIU Yu-Jie, WU Chun-Jie, JIANG Miao, LIAO Bo, SU Xuan-Yi//(School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137,Sichuan)

Objective:To investigate chemical constituents and bioactivities of fatty acids from the fl owers ofFritillaria thunbergiiMiq. (CFD).Method:GC-MS was used to analyze compositions of CFD. DPPH radical scavenging assay was used to evaluate its antioxidant properties, and the acetic acid-induced abdominal writhing test in mice was performed to investigate its antinociceptive effects.Result:The results revealed that main components of CFD were (9Z, 12Z, 15Z)-octadeca-9,12,15-trienoic acid (26.55 %), linoleic acid (20.41 %), Palmitic acid (16.43 %), indicating that CFD contained plenty of unsaturated fatty acid(46.96%) and saturated fatty acids (16.83 %). In addition, results also demonstrated that CFD possessed signi fi cant DPPH radical scavenging activity (EC50= 4.57 mg/mL). Furthermore, CFD (100 and 200 mg．kg-1) can not only significantly decreased the number of writhing episodes induced by acetic acid (p ＜ 0.05, p ＜ 0.01), but also increased the latencies of the writhing (p ＜ 0.05,p ＜ 0.01).Conclusion:CFD possess signi fi cant anti-oxidant and antinociceptive effects, and unsaturated fatty acid is the main constituent of CFD.

Fritillaria thunbergiiMiq； fl owers；fatty acids；unsaturated fatty acid；antioxidant；antinociceptive

R 282

A

1674-926X(2017)03-006-03

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標準化教育部重點實驗室 四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點實驗室省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137

彭偉，男，博士研究生在讀，從事中藥炮制及新制劑研究 Email:pengwei002@126.com

蔣淼（1982-），女，講師，主要從事中藥基礎(chǔ)理論及應(yīng)用研究

Tel:028-61800231 Email:jiangmiaocc@163.com

2016-12-20