蔣樹新， 劉華良 ， 馬永建*， 阮麗萍

(1.東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇南京 210009； 2.江蘇省疾病預(yù)防控制中心，江蘇南京 210009)

近年來，隨著食品工業(yè)的迅速發(fā)展，各種防腐劑被廣泛使用。對(duì)羥基苯甲酸酯與傳統(tǒng)的苯甲酸、山梨酸防腐劑相比，具有低毒、高效、作用強(qiáng)、抑菌范圍廣、防腐效果不易隨pH值變化而變化的優(yōu)點(diǎn)[1]。有研究表明，對(duì)羥基苯甲酸酯具有雌激素活性[2 - 3]，長(zhǎng)期攝入會(huì)影響人體內(nèi)分泌功能，甚至可能是乳房癌和男性不育的誘因[4 - 6]。因此，我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB 2760-2014)對(duì)食品中對(duì)羥基苯甲酸酯類防腐劑的添加規(guī)定了限量[7]。

目前，對(duì)食品中對(duì)羥基苯甲酸酯類的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法[8 - 9]、氣相色譜法[10 - 11]、氣相色譜-質(zhì)譜法[12 - 13]、薄層色譜法[14 - 15]、毛細(xì)管電泳法[16]。但這些測(cè)定方法的樣品前處理多為離線前處理，操作復(fù)雜，溶劑消耗量大，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)可同時(shí)測(cè)定對(duì)羥基苯甲酸乙酯和丙酯，但該方法樣品前處理需乙腈提取三次，洗滌數(shù)次，耗時(shí)費(fèi)力且產(chǎn)生大量廢液[17]。本研究建立了碳酸飲料中對(duì)羥基苯甲酸乙酯和丙酯的在線分析方法，具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，簡(jiǎn)化了分析步驟及有機(jī)溶劑的使用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

雙三元液相色譜系統(tǒng)(美國(guó)，Thermo Fisher 公司)，配備DGP-3600RS泵、WPS-3000自動(dòng)進(jìn)樣器、TCC-3X00(RS)柱溫箱(配有一個(gè)六通閥)、VWD-3X00(RS)檢測(cè)器和Chromeleon 7.0變色龍色譜管理軟件；Mili-Q超純水純化系統(tǒng)(美國(guó)，Milipore公司)；渦旋混合器(美國(guó)，Scientific Industries公司)；分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；超聲波清洗器(德國(guó)，Elma 公司)。

甲醇為色譜純(德國(guó)默克股份聯(lián)合公司)；乙酸銨為分析純(南京化學(xué)試劑有限公司)；水為超純水；對(duì)羥基苯甲酸乙酯(Ethyl-paraben)和對(duì)羥基苯甲酸丙酯(Propyl-paraben)標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.5%，德國(guó)Laboratories of Dr.Ehrenstorfer)。

1.2 樣品處理

稱取碳酸飲料樣品2.0 g(精確至0.01 g)，樣品需超聲振蕩去除CO2，用水稀釋定容至10 mL，混勻后過0.45 μm微孔濾膜，待測(cè)。

1.3 在線固相萃取和色譜分離條件

在線萃取柱為Acclaim 120 C18柱(10×4.6 mm，5 μm)，色譜柱分析為Agilent Extend-C18柱(250×4.6 mm，5 μm)；進(jìn)樣量為10 μL,柱溫25 ℃；右泵(Online-SPE pump)為凈化泵，采用水(溶劑A)和甲醇(溶劑B)梯度洗脫；左泵( Analytical pump)為分析泵，采用水(溶劑A)和甲醇(溶劑B)等度洗脫。分別于5 min 和5.6 min處切換六通閥。六通閥切換程序及分析流路洗脫程序見表1，具體切換通路見圖1和圖2。

表1 在線凈化與色譜分離的洗脫條件Table 1 Elution procedures of on-line SPE and chromatographic separation

圖1 萃取階段及分析階段閥切換通路Fig.1 Column switching system in extraction and analytical periods

圖2 轉(zhuǎn)移階段閥切換通路Fig.2 Column switching system in transfer period

2 結(jié)果與討論

2.1 在線固相萃取條件優(yōu)化

2.1.1在線萃取柱的選擇實(shí)驗(yàn)比較了Oasis WAX、Acclaim 120 C18兩種萃取柱的凈化效果。結(jié)果表明：目標(biāo)化合物經(jīng)過Oasis WAX柱萃取后再洗脫到分析柱進(jìn)行分離時(shí)無法基線分離、峰形矮胖和嚴(yán)重拖尾，改變色譜流動(dòng)相成分或改變流動(dòng)相中有機(jī)相比例均無法解決上述問題。Acclaim 120 C18柱具有極高的表面覆蓋率和極低的金屬含量，通過優(yōu)化上樣和凈化條件可去除大量雜質(zhì)，有效保留2種目標(biāo)化合物，并獲得良好分離度和峰形。因此，本研究選擇Acclaim 120 C18柱作為在線萃取柱。

2.1.2淋洗液和洗脫液的選擇比較了純水、體積比分別為10∶90、20∶80、30∶70、40∶60的甲醇-水作為淋洗液的除雜效果。結(jié)果表明：30%體積比的甲醇除雜效果最佳，且能保留目標(biāo)物；當(dāng)甲醇比例達(dá)到40%時(shí)，目標(biāo)物在上樣后不能被保留在萃取柱上。將色譜流動(dòng)相作為洗脫液可以簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟，縮短分析時(shí)間，本研究以乙腈-水(70∶30，V/V)作為洗脫溶液，可在短時(shí)間內(nèi)將目標(biāo)物洗脫。

2.2 分離條件優(yōu)化

2.2.1流動(dòng)相的選擇分別比較了甲醇-水、甲醇-乙酸銨、乙腈-水、乙腈-乙酸銨的分析效果。結(jié)果表明這四種流動(dòng)相均可以將目標(biāo)物分離并獲得良好峰形?？紤]到乙腈毒性較大，色譜級(jí)乙腈價(jià)格較高以及緩沖鹽對(duì)色譜柱和儀器有損傷，本研究選擇甲醇-水作為流動(dòng)相。研究還比較了流動(dòng)相中甲醇比例對(duì)分離效果的影響，結(jié)果表明甲醇∶水=70∶30(V/V)為流動(dòng)相時(shí)目標(biāo)物分離度和峰形最好。

2.2.2色譜柱的選擇比較了Agilent SB-C18柱、Agilent XDB-C18柱、迪馬C18柱、Agilent Extend-C18柱對(duì)目標(biāo)物的分離效果。在相同分離條件下，目標(biāo)物除在Agilent SB-C18柱上有明顯拖尾外，在其余三種色譜柱上均可以獲得良好分離度和峰形。本研究選擇柱壓較小的Agilent Extend-C18柱作為分離柱。

2.2.3柱溫和流速的選擇本研究對(duì)柱溫(25、30、35、40 ℃)和流速(0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min)對(duì)分離效果的影響進(jìn)行了考察。柱溫對(duì)目標(biāo)物分離度、保留值和峰形的影響不大，但柱溫達(dá)到40 ℃時(shí)，Acclaim 120 C18萃取柱對(duì)對(duì)羥基苯甲酸乙酯保留能力明顯減弱，對(duì)羥基苯甲酸乙酯和雜質(zhì)一起在1 min左右被從萃取柱洗脫，造成其響應(yīng)值明顯減低。選擇室溫25 ℃作為檢測(cè)柱溫。流速主要影響的是柱壓和保留值，為保護(hù)色譜柱和減少分析時(shí)間，選擇1 mL/min作為檢測(cè)流速。在已優(yōu)化的萃取條件、分離條件和檢測(cè)條件下，分別對(duì)兩種對(duì)羥基苯甲酸甲酯的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品進(jìn)行測(cè)定，所得圖譜見圖3和圖4。

圖3 對(duì)羥基苯甲酸酯標(biāo)準(zhǔn)混合溶液(5 μg/mL)色譜圖Fig.3 Chromatograms of the mixed standard solution of 2 parabens(5 μg/mL)

圖4 樣品的色譜圖(256 nm)Fig.4 Chromatogram of sample(256 nm)

2.3 方法的線性與定量限

用水配制系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，并按上述優(yōu)化后的條件進(jìn)行分析。結(jié)果表明，2種對(duì)羥基苯甲酸酯在0.5～400 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r2>0.9999。在空白樣品中添加一系列低濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)3倍信噪比計(jì)算檢測(cè)限，結(jié)果見表2。

表2 2種對(duì)羥基苯甲酸酯線性方程與相關(guān)系數(shù)Table 2 Linear equations and correlation coefficients(r2) of 2 parabens

2.4 方法的回收率和精密度

稱取適量碳酸飲料空白樣品進(jìn)行低、中、高3個(gè)水平加標(biāo)(中水平加標(biāo)量為GB 2760-2014[7]規(guī)定的最大限量值)，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果見表3。

表3 回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of recovery and precision test

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

從南京市鼓樓區(qū)的超市購(gòu)買碳酸飲料樣品共10份，采用本方法進(jìn)行分析檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

3 結(jié)論

本研究建立了在線固相萃取-高效液相色譜檢測(cè)碳酸飲料中2種對(duì)羥基苯甲酸酯的分析方法。碳酸飲料樣品經(jīng)稀釋過濾后可直接上樣，無需其他前處理步驟。通過優(yōu)化在線萃取條件和分離條件，可以實(shí)現(xiàn)2種對(duì)羥基苯甲酸酯的有效分離，并且可以獲得較為理想的準(zhǔn)確度和精密度。方法具有操作簡(jiǎn)單、快速簡(jiǎn)便、節(jié)省大量時(shí)間、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，能夠滿足碳酸飲料中對(duì)羥基苯甲酸酯的定量分析要求，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。