楊海芬， 王 璇， 王亞坤， 于 青， 卞 偉*

(1.山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，山西太原 030001； 2.山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山西太原 030001；)

近年來(lái)，熒光碳點(diǎn)作為繼碳納米管和石墨烯之后出現(xiàn)的新型碳納米材料，受到科研工作者的青睞。碳點(diǎn)與傳統(tǒng)量子點(diǎn)相比，具有激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)可調(diào)、量子產(chǎn)率高、制備成本低、綠色環(huán)保、良好的水溶性和生物相容性等優(yōu)越特性，且在光催化、生物標(biāo)記、藥物檢測(cè)、細(xì)胞成像、重金屬離子的檢測(cè)等諸多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[1 - 4]。研究發(fā)現(xiàn)，用其他雜原子摻雜后得到的摻雜碳點(diǎn)具有穩(wěn)定的光學(xué)性質(zhì)、高的量子產(chǎn)率和顯著的催化性能[5 - 6]。如：Hou等[7]用檸檬酸和雙氰胺為原料合成了量子產(chǎn)率為73.2%的氮摻雜碳點(diǎn)，以它為 “on-off-on”開關(guān)型熒光探針來(lái)檢測(cè)Fe2+和去鐵蛋白； Zhang等[8]通過(guò)一步水熱法制備的熒光性能良好的水溶性氮摻雜碳點(diǎn)檢測(cè)痕量Hg2+；Jahan等[9]把合成的具有很強(qiáng)熒光的硼和氮摻雜碳點(diǎn)用于光敏劑和蘇丹紅的檢測(cè)。

槲皮素(Quercetin)是一種廣泛存在于植物界的多羥基黃酮類化合物，它具有多種生物學(xué)活性及很高的藥用價(jià)值，如抗氧化、抗菌抗病毒、抗炎抗過(guò)敏、預(yù)防心血管疾病、抑制惡性腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移等[10 - 11]。近年來(lái)，槲皮素對(duì)于延緩衰老和抗癌防癌的作用成為一個(gè)非常熱門的課題，然而人體內(nèi)槲皮素過(guò)量時(shí)會(huì)引起頭痛和腎損傷等疾病。因此，探索槲皮素的含量測(cè)定方法十分重要。目前槲皮素的測(cè)定方法有高效液相色譜法[12]、毛細(xì)管電泳法[13]、薄層掃描法[14]、熒光光譜法[15]等。熒光光譜法與其他幾種方法相比，具有高靈敏度、高效率、操作簡(jiǎn)單和成本低等的優(yōu)點(diǎn)，因而引起了研究人員的更多關(guān)注。

本文以硼酸、尿素和檸檬酸為原料，用微波法合成了硼氮共摻雜碳點(diǎn)(BNCDs)。基于槲皮素對(duì)該摻雜碳點(diǎn)的熒光猝滅作用，建立了一種檢測(cè)槲皮素的新方法。同時(shí)，初步探討了槲皮素與該摻雜碳點(diǎn)相互作用的反應(yīng)機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

JEM-1011型透射電子顯微鏡(日本，JEOL)；Paragon 1000型紅外光譜儀(美國(guó)，Perkin-Elmer公司)；TU-1900型雙光束紫外-可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；F-4500型熒光分光光度計(jì)(日本，日立公司)；FB124型電子分析天平(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；pHSJ-3F型酸度計(jì)(上海壘固儀器有限公司)。

檸檬酸(上海阿拉丁試劑有限公司)；H3BO3( 上海阿拉丁試劑有限公司)；尿素(上海阿拉丁試劑有限公司)；槲皮素(上海阿拉丁試劑有限公司)；NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·2H2O、Na3PO4·12H2O(分析純，天津博迪化工廠)；無(wú)水乙醇(分析純，天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心)；其余試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 硼氮共摻雜碳點(diǎn)(BNCDs)的制備

取1.0 g H3BO4、1.093 g檸檬酸和1.0 g尿素，溶于20 mL去離子水中，過(guò)濾，濾液在微波(700 W)加熱4 min得到棕色固體。待固體冷卻到室溫，加20 mL去離子水溶解并過(guò)濾，收集濾液，室溫下放置3 d使其蒸干，得深綠色固體。向固體中加入適量乙醇洗滌三次，再加適量去離子水使其溶解。把所得溶液用透析膜(MWCO 500 Da)透析3 d，得到BNCDs溶液，于4 ℃條件貯存，備用。

1.3 檢測(cè)方法

在5 mL比色管中，依次加入BNCDs儲(chǔ)備液、磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=7.0)和不同體積的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻。室溫下反應(yīng)幾分鐘后，以360 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)定體系的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)0和F分別表示加入槲皮素前后該BNCDs的熒光強(qiáng)度，計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度ΔF=F0/F。儀器激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 BNCDs的表征

BNCDs的結(jié)構(gòu)通過(guò)透射電子顯微鏡(TEM)、X-射線光電子能譜(XPS)、傅里葉變換紅外(FT-IR)光譜進(jìn)行表征。TEM圖表明合成的BNCDs形狀近似球形，分散均勻且無(wú)聚集現(xiàn)象，粒徑約在4.2 nm左右(圖1)。圖2為BNCDs的紅外光譜圖，在3 100～3 600 cm-1處的寬峰為N-H和O-H的伸縮振動(dòng)峰；1 645 cm-1處為C=O的伸縮振動(dòng)峰；B-O和B-C的伸縮振動(dòng)峰分別在1 408 cm-1和1 156 cm-1；在1 342 和1 080 cm-1出現(xiàn)的是B-N的特征振動(dòng)峰；在1 051 cm-1是B-O-C的彎曲振動(dòng)峰； B-N-B的彎曲振動(dòng)峰在758 cm-1處可以觀察到。

圖1 BNCDs的透射電鏡(TEM)圖Fig.1 TEM image of BNCDs

圖2 BNCDs的紅外(IR)光譜圖Fig.2 IR spectrum of BNCDs

圖3為BNCDs的XPS圖譜，可以觀察到合成的BNCDs主要由C、N、O和B元素組成，比例分別為40.84%、27.93%、27.46%和3.77%。說(shuō)明成功的將B、N元素?fù)诫s到碳點(diǎn)表面，且XPS結(jié)果與IR光譜測(cè)定結(jié)果相吻合。

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.2.1pH的選擇實(shí)驗(yàn)考察了體系酸度對(duì)BNCDs以及BNCDs-槲皮素體系熒光強(qiáng)度的影響，結(jié)果如圖4所示。可以看出在不同pH值的PBS中，BNCDs的熒光強(qiáng)度的變化以及槲皮素對(duì)BNCDs的熒光強(qiáng)度猝滅作用不同。當(dāng)pH在5.0～11.0的范圍，BNCDs的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，在pH=6.0時(shí)，BNCDs的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大。在加入槲皮素后，ΔF(ΔF=F0-F)在pH=7.0時(shí)，槲皮素對(duì)BNCDs熒光強(qiáng)度的猝滅作用最強(qiáng)。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇在pH=7.0的PBS中進(jìn)行。

2.2.2BNCDs濃度的影響在pH=7.0的實(shí)驗(yàn)條件下，考察了BNCDs濃度對(duì)BNCDs-槲皮素體系熒光強(qiáng)度的影響。實(shí)驗(yàn)中得出，當(dāng)BNCDs的濃度逐漸增大時(shí)，BNCDs熒光探針對(duì)槲皮素的靈敏度呈升高的趨勢(shì)，且在BNCDs的濃度為2.0×10-6mg/L時(shí)對(duì)槲皮素測(cè)定的靈敏度達(dá)到最高，繼續(xù)增加BNCDs的濃度，對(duì)槲皮素測(cè)定的靈敏度反而降低。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇BNCDs的濃度為2.0×10-6mg/L。

圖3 BNCDs的X-射線光電子能譜(XPS)圖 Fig.3 XPS of BNCDs

圖4 pH對(duì)BNCDs以及BNCDs-槲皮素體系熒光強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of pH on fluorescence intensity ) 2.0 μmol/L BNCDs without quercetin；) BNCDs with 10.0 μmol/L quercetin.

圖5 槲皮素濃度對(duì)BNCDs熒光強(qiáng)度影響(插圖為BNCDs熒光強(qiáng)度變化與槲皮素濃度的線性關(guān)系)Fig.5 Effect of quercetin concentration on the fluorescence spectrum of BNCDs(Inset:displays the Lineweaver-Burk plot for the BNCDs and quercetin concentration) top to bottom: concentrations of quercetin:0.0,0.5,1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,12.0,14.0,18.0,20.0,24.0,28.0,30.0,32.0,34.0 μmol/L.

2.2.3反應(yīng)時(shí)間的影響本實(shí)驗(yàn)研究了在pH=7.0，BNCDs濃度為2.0×10-6mg/L的條件下，探討了反應(yīng)時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。我們發(fā)現(xiàn)BNCDs的熒光強(qiáng)度在加入槲皮素后的30 s急劇下降，4 min后摻雜碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定，說(shuō)明反應(yīng)基本完成，因此實(shí)驗(yàn)中反應(yīng)時(shí)間選取為4 min。

2.3 槲皮素對(duì)摻雜碳點(diǎn)熒光光譜的影響

在pH=7.0，BNCDs的濃度為2.0×10-6mg/L的實(shí)驗(yàn)條件下，不同濃度的槲皮素對(duì)BNCDs熒光強(qiáng)度的影響如圖5。由圖可見，隨著槲皮素濃度的逐漸增大，BNCDs的熒光強(qiáng)度逐漸降低。槲皮素濃度在0.0～34.0 μmol/L的范圍內(nèi)與BNCDs的熒光強(qiáng)度變化之間符合Stern-Volmer方程，呈良好的線性關(guān)系，圖5中的插入圖所示的線性方程為:F0/F=3.67×104c+0.965，相關(guān)系數(shù)(r)為0.994。該方法檢出限為47.5 nmol/L。重復(fù)測(cè)量11次的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.324%。

2.4 干擾實(shí)驗(yàn)

在最優(yōu)條件下研究了常見金屬陽(yáng)離子、葡萄糖以及氨基酸對(duì)槲皮素測(cè)定的干擾，結(jié)果見表1。由表中數(shù)據(jù)可知，常見金屬陽(yáng)離子、葡萄糖以及氨基酸對(duì)測(cè)定的干擾較小，由此說(shuō)明該檢測(cè)方法選擇性較好。

表1 共存物質(zhì)對(duì)BNCDs-槲皮素體系的影響Table 1 Effect of coexisting substance on BNCDs and quercetin

(續(xù)表1)

InterferentsConcentrationof interferent(μmol/L)Change of fluorescence intensity(%)InterferentsConcentrationof interferent(μmol/L)Change of fluorescence intensity(%)Al3+251.25Serine503.15Co2+25-1.37Histidine50-2.29Cd2+251.03Cysteine503.45Li+251.56Glucose501.43Mn2+251.63Methionine503.17

pH=7.0 PBS；[BNCDs]=2.0×10-6mg/L；[quercetin]=2 μmol/L.

2.5 機(jī)理探討

熒光猝滅過(guò)程通常分為靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅兩種。動(dòng)態(tài)猝滅的效率受熒光物質(zhì)激發(fā)態(tài)壽命和猝滅劑濃度的影響，不會(huì)改變熒光物質(zhì)的吸收光譜，并且動(dòng)態(tài)猝滅的過(guò)程是碰撞過(guò)程，與擴(kuò)散有關(guān)，因此溫度升高時(shí)分子運(yùn)動(dòng)加速，使分子的擴(kuò)散系數(shù)增大，猝滅常數(shù)增大[16]。靜態(tài)猝滅是猝滅劑與熒光物質(zhì)的基態(tài)分子發(fā)生配合反應(yīng)，所以熒光物質(zhì)的吸收光譜會(huì)發(fā)生變化，且溫度升高，配合物的穩(wěn)定度會(huì)下降，猝滅常數(shù)減小[17]。因此可以通過(guò)吸收光譜和溫度對(duì)猝滅常數(shù)的影響來(lái)初步推斷熒光猝滅的類型。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BNCDs溶液中加入不同濃度的槲皮素(4.0、8.0、12.0、16.0 μmol/L)后，BNCDs的紫外吸收光譜隨著槲皮素濃度的增加而升高，初步判斷槲皮素與摻雜碳點(diǎn)的基態(tài)分子之間形成配合物。圖5表明，槲皮素的濃度與該摻雜碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度的變化之間符合Stern-Volmer方程，表2中數(shù)據(jù)顯示摻雜碳點(diǎn)的熒光猝滅常數(shù)隨著溫度的升高而減小。綜上所述，我們初步推斷槲皮素對(duì)摻雜碳點(diǎn)的熒光猝滅主要為靜態(tài)猝滅。

表2 不同溫度下Stern-Volmer方程的參數(shù)Table 2 Parameters of Stern-Volmer plots of BNCDs and quercetin

2.6 實(shí)際樣品分析

尿樣取自健康人群。檢測(cè)前將樣品離心分離，測(cè)定時(shí)取上清液用去離子水稀釋1 000倍即可。將所建立的分析方法用于健康人尿液中槲皮素的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果(表3)表明在人體尿液中槲皮素的回收率在98.7%～101.4%之間。因此該方法可用于實(shí)際樣品中槲皮素含量的測(cè)定。

表3 實(shí)際樣品中槲皮素的測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of various real samples

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)成功合成了水溶性的BNCDs，基于槲皮素對(duì)該摻雜碳點(diǎn)的熒光猝滅現(xiàn)象建立了一種測(cè)定槲皮素含量的熒光分析方法。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下槲皮素濃度在0.0～34.0 μmol/L范圍與摻雜碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度變化呈良好的線性關(guān)系，檢出限為47.5 nmol/L。方法操作簡(jiǎn)單、選擇性好，一些常見金屬陽(yáng)離子、葡萄糖以及氨基酸對(duì)槲皮素含量測(cè)定的干擾很小，回收率實(shí)驗(yàn)表明本方法可用于人體尿液中槲皮素含量的測(cè)定。