畢 暢， 遲絲雨， 李 貞

(1.生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430072)

汞污染是一個(gè)嚴(yán)重的全球性問(wèn)題，人類活動(dòng)如礦石開(kāi)采、垃圾焚燒、石油燃燒和化工生產(chǎn)等是造成無(wú)機(jī)汞過(guò)量排放的主要原因[1]。被釋放出的單質(zhì)汞蒸氣通過(guò)大氣擴(kuò)散至各個(gè)地區(qū)，最終氧化為Hg2+，在植物、頂層土壤和水體中累積。部分土壤中的Hg2+會(huì)被土壤、水體甚至魚類中的原核生物吸收，將無(wú)機(jī)汞轉(zhuǎn)化為有機(jī)汞，在食物鏈中不斷累積，對(duì)動(dòng)植物的生命健康造成威脅[2]。

傳統(tǒng)Hg2+定量檢測(cè)手段一般包括原子吸收光譜法[3]、原子熒光光譜法[4]和氣相色譜法[5]。這類方法均要求復(fù)雜的儀器和繁瑣的樣品處理過(guò)程，不利于對(duì)樣品的快速和及時(shí)檢測(cè)。紙基檢測(cè)裝置(PADs)具有造價(jià)低廉、方便攜帶和容易操作的特點(diǎn)，因此該檢測(cè)裝置非常適合實(shí)地、定點(diǎn)快速檢測(cè)樣品[6]。上轉(zhuǎn)換納米材料(UCNPs)具有近紅外光激發(fā)，反斯托克斯位移熒光的特點(diǎn)，可以解決紙基內(nèi)部熒光劑等物質(zhì)產(chǎn)生的背景干擾問(wèn)題[7]。將UCNPs作為能量供體應(yīng)用于紙基檢測(cè)裝置，利用Hg2+可以使DNA的T堿基發(fā)生錯(cuò)配的性質(zhì)[8]，改變熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)過(guò)程中的供受體距離，這是一種快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法。

目前，已經(jīng)有一系列利用較強(qiáng)的T-Hg2+-T作用力檢測(cè)Hg2+工作的報(bào)道[9 - 11]。本文利用Hg2+誘導(dǎo)的T堿基錯(cuò)配，設(shè)計(jì)Hg2+適配體為識(shí)別分子，以金納米粒子(AuNPs)為能量受體,構(gòu)建上轉(zhuǎn)換熒光共振能量轉(zhuǎn)移(UC-FRET)紙基側(cè)流檢測(cè)模型。利用AuNPs在檢測(cè)區(qū)的富集信號(hào)和相機(jī)收集的熒光信號(hào)，分別實(shí)現(xiàn)對(duì)Hg2+高靈敏的定性、定量分析，完成對(duì)樣品中Hg2+的實(shí)地、裸眼可視化檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

LOS-BLD-0980-1.3 980 nm半導(dǎo)體近紅外激光器(中國(guó)海特光電有限責(zé)任公司)；RF-5301PC熒光分光光度計(jì)(日本，島津公司)；Zeiss SIGMA FESEM掃描電子顯微鏡(德國(guó)，Carl Zeiss 公司)；UV-2550紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本，島津公司)；Legend Micro 17R高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)，Thermo Scientific 公司)；Sartorius cn140硝化纖維(NC)膜、DB-6卡式底板、NJ-Y1樣品墊、H5015吸收墊(中國(guó)杰一生物技術(shù)有限公司)。

Y2O3、Er2O3、Yb2O3(高純?cè)噭?，上海?guó)藥集團(tuán))；十八烯(分析純，上海阿拉丁工業(yè)公司)；一縮二乙二醇(分析純，上海國(guó)藥集團(tuán))；聚丙烯酸(優(yōu)級(jí)純，Sigma-Aldrich)；HAuCl4(分析純，上海國(guó)藥集團(tuán))；三(2-羧乙基)膦(TCEP)(生化純，薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司)；Hg2+適配體、Hg2+適配體互補(bǔ)鏈、延長(zhǎng)序列互補(bǔ)鏈(生化純，生工生物工程股份有限公司)；鏈霉親和素(生化純，北京百靈威科技股份有限公司)。

1.2 夾心結(jié)構(gòu)上轉(zhuǎn)換納米材料(SWUCNPs)的合成和修飾

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道方法[12 - 13]合成PAA修飾的夾心結(jié)構(gòu)UCNPs(SWUCNPs):NaYF4∶Yb@NaYF4∶Yb,Er@NaYF4∶Yb。

1.3 AuNPs的合成與標(biāo)記

以三檸檬酸鈉為配體，合成AuNPs[14]。將50 mL 1 mmol/L HAuCl4加熱至120 ℃回流，迅速注入5 mL 38.8 mmol/L檸檬酸三鈉，待溶液逐漸變?yōu)檠t色后，回流15 min。冷卻至室溫后，用0.22 μm無(wú)菌過(guò)濾器將溶液過(guò)濾，在4 ℃下儲(chǔ)存。將231 μL 20 nmol/L TCEP加入至100 μmol/L 46.2 μL的M1溶液中(Tris-HCl緩沖溶液,pH=7.4)。避光、室溫條件下孵化1 h。將混合溶液注入到10 mL AuNPs溶液中，避光室溫?cái)嚢?6 h。向混合物中緩慢滴加2 mol/L NaCl 溶液，直至其濃度為0.05 mol/L。之后，繼續(xù)避光攪拌24 h。在4 ℃、12 000 r/min條件下冷凍離心20 min。收集沉淀，并利用10 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.4)洗滌沉淀2次。最后將收集到的M1-AuNPs分散在5 mL 10 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.4)中。

1.4 UC-AuNPs側(cè)流模型試紙條的構(gòu)建

將樣品墊、NC膜、吸水墊三部分依次粘貼于PVC墊板上，每部分與前一部分重疊2 mm。試紙條寬度為0.5 cm,總長(zhǎng)6 cm:樣品墊1.5 cm，NC膜 2.5 cm，吸水墊2 cm。再其上劃定檢測(cè)區(qū)(T)和參比區(qū)(C)，兩者區(qū)域直徑均為3 mm,兩者相隔1 cm。

利用親和素-生物素反應(yīng)[15]，將單鏈DNA固定于檢測(cè)區(qū)(T)和參比區(qū)(C)。為固定目標(biāo)物檢測(cè)適配體(M2)和延長(zhǎng)序列互補(bǔ)鏈(C1)，將5 μL 1 mg/mL 鏈霉親和素溶液(10 mmol/L 磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=7.4)與35 μL 5 μmol/L生物素修飾DNA混合，避光條件下室溫反應(yīng)2 h后，6 000 r/min條件下離心20 min，將沉淀物分散在40 μL 10 mmol/L PBS(pH=7.4)中，在4 ℃下避光保存。在T區(qū)、C區(qū)分別固定經(jīng)過(guò)生物反應(yīng)后的5 μL M2和1 μL C1。在兩區(qū)內(nèi)各滴加1 μL 1.6 mg/mL SWUCNP和1%BSA溶液。最后，試紙條在37 ℃下烘干3 h，至表面完全干燥后，在4 ℃下儲(chǔ)存。

1.5 UC-FRET側(cè)流檢測(cè)試紙條在緩沖體系中檢測(cè)Hg2+的應(yīng)用

利用pH=7.4的10 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液(含100 mmol/L NaCl、1.75 mmol/L Mg2+、0.1%BSA和8%SDS)，配制一系列Hg2+標(biāo)準(zhǔn)溶液(0、0.1、0.5、1、5、10、50、100、1 000 nmol/L)。將15 μL標(biāo)記了M1的AuNPs提前負(fù)載在樣品墊上，靜置1 min。將40 μL待測(cè)溶液加在樣品墊上，使其緩慢流過(guò)T區(qū)、C區(qū)。待檢測(cè)樣品完全流經(jīng)整個(gè)試紙條后，用30 μL配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的緩沖溶液洗滌試紙條兩次。觀察洗滌后的AuNPs在T區(qū)、C區(qū)富集程度，可判斷Hg2+的存在，大致判斷其濃度范圍。將其放入烘箱，于37 ℃烘干30 min。待其表面完全干燥后，在暗室內(nèi)，使用980 nm 激光激發(fā)T、C區(qū)熒光。使用相機(jī)記錄熒光情況，并用Photoshop軟件，讀取RGB綠色通道內(nèi)的熒光值，判斷樣品中Hg2+的含量。

考察該UC-FRET LFAs的選擇性時(shí)，使用干擾物(Ca2+、Mg2+、Pb2+、Ni2+、Cu2+和Mn2+溶液)代替Hg2+為樣品溶液，操作步驟同上。

2 結(jié)果與討論

2.1 UC-AuNPs側(cè)流模型構(gòu)建原理

UCNPs-AuNPs適配體側(cè)流試紙條的檢測(cè)原理如圖1。利用Hg2+可以導(dǎo)致T堿基錯(cuò)配的性質(zhì)，設(shè)計(jì)兩條T堿基豐富的單鏈DNA作為Hg2+適配體M1、M2。M1除含T堿基豐富鏈，還附加一段延長(zhǎng)序列且5′端用巰基修飾，與AuNPs偶聯(lián)，作為Hg2+識(shí)別部分。M2為只含T堿基的單鏈DNA，作為Hg2+適配體互補(bǔ)鏈，與UCNPs負(fù)載于檢測(cè)區(qū)(T)。M1鏈上的延長(zhǎng)序列互補(bǔ)鏈(C1)與UCNPs負(fù)載于C區(qū)，作為信號(hào)參考。在Hg2+存在條件下，AuNPs-M1與T區(qū)的M2配對(duì)，AuNPs富集于T區(qū)，形成信號(hào)，可利用比色法評(píng)估其濃度；同時(shí)，該富集行為拉近AuNPs與UCNPs距離，使FRET得以發(fā)生，由此猝滅UCNPs的熒光，通過(guò)熒光猝滅情況可判斷Hg2+濃度。

圖1 UCNPs-AuNPs適配體側(cè)流試紙條的檢測(cè)原理圖Fig.1 Schematic illustration of the UCNPs-AuNPs aptamer lateral flow sensor.M1:Hg2+ aptamer with extended sequence(5′-SH-TTTTTTTTTTTCTGTCGGATGAG-3′);M2:Complementary strand for Hg2+ aptamer(5′-Biotin-TTTTTTTTTT-3′);C1:Complementary strand for extended sequence(5′-Biotin-CTCATCCGACAGC-3′)

2.2 SWUCNPs與AuNPs的表征

SWUCNPs利用層層種子介導(dǎo)方式進(jìn)行合成。通過(guò)透射電鏡圖(圖2)可以證明，經(jīng)過(guò)層層組裝后，UCNPs的晶像并未發(fā)生改變；每層的粒徑大小比較均一。

圖2 SWUCNPs的透射電鏡(TEM)圖。a.NaYF4內(nèi)核；b.NaYF4@NaYF4∶Yb,Er核-內(nèi)殼結(jié)構(gòu)；c.NaYF4@NaYF4∶Yb,Er@NaYF4夾心結(jié)構(gòu)Fig.2 TEM images of a.NaYF4；b.NaYF4@NaYF4∶Yb,Er；c.NaYF4@NaYF4∶Yb,Er@NaYF4

依據(jù)檸檬酸還原法，制備粒徑在10～20 nm的AuNPs。根據(jù)圖3，利用文獻(xiàn)報(bào)道方法[16]計(jì)算,AuNPs的粒徑為15 nm,濃度為6.93 nmol/L。AuNPs與M1的偶聯(lián)通過(guò)Au-S鍵固定。根據(jù)圖3(a)可見(jiàn)：AuNPs與M1偶聯(lián)后，在520 nm處的等離子共振吸收峰有輕微紅移，證明M1已成功修飾于AuNPs的表面。

圖3 (a)AuNPs與AuNPs-M1的紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖；(b)UCNPs的熒光光譜圖Fig.3 (a)UV-Vis absorption spectra of AuNPs and AuNPs-M1；(b)Fluorescence spectrum of UCNPs

2.3 UC-AuNPs側(cè)流模型檢測(cè)緩沖體系中的Hg2+

在樣品墊上負(fù)載15 μL AuNPs-M1溶液,靜置1 min，再負(fù)載50 μL Hg2+標(biāo)準(zhǔn)溶液。利用Photoshop的RGB格式提取綠光強(qiáng)度，可計(jì)算熒光的猝滅效率:(F0-F)/F0(F0：不加樣品時(shí)，區(qū)域內(nèi)的熒光強(qiáng)度；F：加入樣品后，區(qū)域內(nèi)的熒光強(qiáng)度)。

如圖4(a)，樣品濃度在0.1～100 nmol/L范圍內(nèi)，Hg2+濃度的對(duì)數(shù)與T區(qū)熒光猝滅效率存在線性關(guān)系。檢出限可達(dá)到0.1 nmol/L。該檢出限低于目前文獻(xiàn)報(bào)道的Hg2+側(cè)流檢測(cè)試紙條。在該濃度下，T區(qū)的熒光猝滅效率達(dá)到29.6%。這種對(duì)低濃度目標(biāo)物的靈敏相應(yīng)，可能來(lái)自于利用SWUCNPs構(gòu)建的FRET體系。SWUCNPs的發(fā)光中心均集中于夾心結(jié)構(gòu)的中間層，與能量受體的距離較近，因此FRET效率很高。C區(qū)(如圖4(b))的熒光猝滅效率受Hg2+影響較小，在23.5%～37.8%之間。利用AuNPs在T區(qū)的富集而產(chǎn)生的顏色變化，可以利用比色法，粗略判斷Hg2+濃度。如圖4(c)所示，隨Hg2+的濃度增加，T區(qū)的AuNPs顏色明顯變深。

圖4 不同Hg2+濃度下檢測(cè)區(qū)(a)的猝滅效率以及參比區(qū)(b)和AuNPs在檢測(cè)區(qū)、參比區(qū)的富集情況(c)Fig.4 The quenching efficiencyin of testing area(a) and reference area(b) and gathering of AuNPs in testing area and reference area (c) at different concentration of Hg2+

圖5 SWUCNPs-AuNPs側(cè)流檢測(cè)試紙條的選擇性考察Fig.5 The selectivity of SWUCNPs-AuNPs lateral flow sensor

為了考察該試紙條對(duì)Hg2+的選擇性，本實(shí)驗(yàn)選擇水體中可能存在的其它金屬離子(Ca2+、Mg2+、Ni2+、Pb2+、Mn2+、Cu2+)與Hg2+進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)。如圖5所示，只有樣品中含有Hg2+時(shí)，T區(qū)才存在明顯的熒光猝滅，干擾物對(duì)檢測(cè)所產(chǎn)生的影響很小。因此該試紙條針對(duì)樣品中常見(jiàn)的金屬離子具有良好選擇性。Hg2+所用濃度為1 μmol/L，其余離子濃度均為10 μmol/L。

2.4 SWUCNPs-AuNPs側(cè)流試紙條檢測(cè)自來(lái)水中Hg2+

為考察SWUCNPs-AuNPs試紙條的檢測(cè)能力，我們將該試紙條應(yīng)用在實(shí)驗(yàn)室自來(lái)水中的Hg2+濃度檢測(cè)上。由于自來(lái)水中的部分雜質(zhì)可能對(duì)試紙條表面造成非特異性吸附，我們將自來(lái)水樣品用10 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液(含100 mmol/L NaCl、1.75 mmol/L Mg2+、0.1%BSA和8%SSC)將樣品稀釋至原濃度的0.6倍。測(cè)得自來(lái)水中的Hg2+濃度為0.14 nmol/L，同時(shí)我們利用標(biāo)準(zhǔn)加入法考察結(jié)果的可靠性，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 UC-FRET側(cè)流檢測(cè)試紙條確定自來(lái)水中Hg2+濃度Table 1 Detection of Hg2+ Concentration in tap water using SWUCNPs-AuNPs based lateral strips

2.5 結(jié)果討論

現(xiàn)已報(bào)道的利用DNA適配體構(gòu)建Hg2+固相熒光方法檢測(cè)的FRET模型，對(duì)于目標(biāo)物的檢出限為2.8 nmol/L[17]。本文采用了兩類納米粒子上轉(zhuǎn)換熒光材料和金納米粒子作為能量供受體，提高FRET體系相應(yīng)靈敏度，將其檢出限降低至0.1 nmol/L。但由于納米粒子之間的能量轉(zhuǎn)移效率有限，最大只可達(dá)到60%，相較文獻(xiàn)報(bào)道[18 - 19]，UCNPs熒光猝滅效率較低，該模型線性范圍較窄(0.1～100 nmol/L)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將通過(guò)調(diào)節(jié)能量受體金納米粒子的尺寸以及上轉(zhuǎn)換熒光材料的核殼結(jié)構(gòu)方面，提高FRET效率，獲得更大的目標(biāo)物相應(yīng)線性范圍。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以AuNPs為能量受體，構(gòu)建了以UCNPs為能量供體的UC-FRET側(cè)流檢測(cè)模型。將該模型應(yīng)用于Hg2+的檢測(cè)，證實(shí)了該側(cè)流模型的可行性和SWUCNPs-AuNPs對(duì)目標(biāo)物的高靈敏響應(yīng)。該模型對(duì)Hg2+的響應(yīng)具有較好的選擇性，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)物的可視化檢測(cè)。在實(shí)地檢測(cè)中，可以利用比色法快速半定量判斷水樣中Hg2+濃度；經(jīng)過(guò)烘干處理后，可利用檢測(cè)區(qū)熒光變化情況可準(zhǔn)確判斷Hg2+濃度。