張鎮(zhèn)松, 郭琳娜, 鄧玉林*, 張慶華*

(1.中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心,北京 100085;2.北京理工大學(xué)生命學(xué)院,北京100081)

帕金森病(Parkinson’s Disease，PD)又稱震顫麻痹，它是一種僅次于阿爾茨海默病的第二大慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其致病機(jī)制目前尚未完全明確。兒茶酚異喹啉類物質(zhì)(Catecholamine Isoquinolines，CAIQs)是外源性神經(jīng)毒素MPTP[1]的結(jié)構(gòu)類似物，能通過多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入多巴胺能神經(jīng)元，導(dǎo)致神經(jīng)元特異性死亡，產(chǎn)生帕金森病癥狀[2]。其中，1-甲基-6,7-二羥基-1,2,3,4-四氫異喹啉(Salsolinol,Sal)及其吡啶環(huán)的N位甲基化產(chǎn)物6,7-二羥基-1,2-二甲基-1,2,3,4 -四氫異喹啉(N-methyl-Sal,NMSal)作為腦內(nèi)自身合成[3]的內(nèi)源性神經(jīng)毒素CAIQs，對神經(jīng)元細(xì)胞的毒性作用最顯著，與PD的發(fā)病密切相關(guān)[4]。α-Synuclein蛋白是PD病理特征路易小體(Lewy Bodies，LBs)的主要組成成分。α-Synuclein 編碼基因第4號外顯子錯義突變(G209A，Ala53Thr，簡稱A53T)被發(fā)現(xiàn)與家族遺傳性PD有關(guān)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，突變型以及過表達(dá)野生型α-Synuclein蛋白可引起蛋白在細(xì)胞內(nèi)聚集，形成毒性更強(qiáng)的不溶性纖維[6]，最終導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元的變性死亡。在穩(wěn)定表達(dá)α-Synuclein的PC12細(xì)胞中檢測發(fā)現(xiàn)Sal和NMSal的濃度都有升高，分別用Sal、NMSal誘導(dǎo)此穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞發(fā)現(xiàn)Sal和NMSal均可引起α-Synuclein蛋白聚集[7]。

圖1 Sal、NMSal和Isop的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of Sal,NMSal and Isop

本文建立了Sal和NMSal的高靈敏度、高選擇性的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)檢測方法，該方法采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)技術(shù)，以兒茶酚異喹啉結(jié)構(gòu)類似物異丙基腎上腺素(Isoproterenol，Isop)為內(nèi)標(biāo)，可提高復(fù)雜的生物樣品中CAIQs定量結(jié)果的可靠性。Sal、NMSal及Isop結(jié)構(gòu)式見圖1。能夠完成氣-質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)[8]、高效液相色譜-電化學(xué)檢測法(HPLC-ECD)[9]或高效液相色譜熒光檢測法(HPLC-FLD)[10]等其他常規(guī)檢測方法難以滿足的高靈敏度要求。

為闡明α-Synuclein蛋白過表達(dá)對體內(nèi)Sal、NMSal內(nèi)源性神經(jīng)毒素含量的影響，選用過表達(dá)人源野生型(WT)及突變型(A53T)α-Synuclein蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠為模型，該模型轉(zhuǎn)入人源α-Synuclein A53T型或WT型基因，促進(jìn)了小鼠紋狀體內(nèi)α-Synuclein蛋白的聚集，引起神經(jīng)系統(tǒng)變性[11]，使小鼠產(chǎn)生PD病狀，以模擬人類PD的發(fā)病過程。此模型以血小板源生長因子(Platelet-derived Growth Factor，PDGF)為啟動子，可調(diào)控α-Synuclein在小鼠的大腦皮層、海馬、下丘腦和小腦等神經(jīng)組織特異性表達(dá)，更好地模擬正常生理?xiàng)l件下α-Synuclein在腦內(nèi)的分布[12 - 13]，為研究人源α-Synuclein在活體中過表達(dá)對Sal、NMSal水平的影響提供基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑及實(shí)驗(yàn)動物

美國Agilent 1290高效液相色譜儀；美國Agilent 6460三重四級桿質(zhì)譜儀；意大利HANNA pH酸度計(jì)；美國Discovery?HS五氟苯基柱；北京科瑞AR2140電子天平；日本Hitachi CR21G2高速離心機(jī)。

Isop和N-Methyl-(R)-salsolinol hydrobromide購于美國Sigma公司；甲酸銨、NaH2PO4和Na2HPO4等均購于北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司；甲醇(色譜純)購自美國Fisher公司；甲酸(色譜純)購于北京Dikma公司；Sal由本實(shí)驗(yàn)室合成并純化；其他分析純化學(xué)試劑均購自北京化學(xué)試劑公司。超純水由美國Millipore公司純水系統(tǒng)制備。

C57BL/6J品系PDGF-h-α-Synuclein-WT、PDGF-h-α-Synuclein-A53T轉(zhuǎn)基因小鼠和正常小鼠購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。飼養(yǎng)條件：按小鼠類型、雌雄分籠培養(yǎng)；飼養(yǎng)密度≤5只/籠，溫度為18～21 ℃，濕度>40%，自然光照，自由進(jìn)食、進(jìn)水。

1.2 空白生物基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取5只正常小鼠鼠腦并稱重，然后按10∶1懸浮在組織裂解液(含0.4 mol/L HClO4、0.05%Vc、0.05% Na2EDTA和0.01%氨基脲，下同)中，用組織研磨器在冰浴中研磨破碎組織和細(xì)胞。將研磨后的懸濁液在17 000 g、4 ℃條件下離心30 min。棄去沉淀，上清液經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾，取出15 μL下層濾液進(jìn)行HPLC-MS/MS檢測。其余濾液用6 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至12，并在室溫中放置24 h，以除去內(nèi)源性Sal、NMSal等化合物。然后用甲酸調(diào)pH至4.0，以此作為空白生物基質(zhì)溶液，取出15 μL 進(jìn)行HPLC-MS/MS檢測。取1 mmol/L的Sal、NMSal和Isop標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，用空白生物基質(zhì)溶液配制成含6.25 nmol/L Sal、100 nmol/L NMSal和10 nmol/L Isop的標(biāo)準(zhǔn)混合工作母液，再用含10 nmol/L Isop的空白生物基質(zhì)溶液，以體積比1∶1的比例依次往下稀釋標(biāo)準(zhǔn)混合工作母液至Sal、NMSal濃度分別為1.53 pmol/L、24.4 pmol/L，共13個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液，內(nèi)標(biāo)物Isop的濃度均為10 nmol/L。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：Discovery?HS F5五氟苯基色譜柱(100×4.6 mm i.d.,5 μm)。流動相：A相：10 mmol/L甲酸銨緩沖溶液；B相：甲醇。梯度洗脫程序：0～5 min,25%B；5～15 min，25%～90%B；15～19 min，90%B；19～21 min，90%～25%B；21～26 min,25%B；柱溫：30 ℃；樣品溫度：4 ℃；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：15 μL。

質(zhì)譜條件：Agilent Jet Stream電噴霧離子源(ESI)，正離子模式；毛細(xì)管電壓：4 000 V；噴霧嘴電壓：0 V；噴霧器壓力：0.24 MPa；鞘氣溫度：325 ℃；鞘氣流速：11.0 mL/min；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流速：10.0 mL/min；碰撞池加速電壓：3 V；駐留時間：400 ms。

1.4 樣品回收率考察

取5只正常小鼠鼠腦并稱重，按10∶1懸浮在組織裂解液中，用組織研磨器在冰浴中按同樣的力度研磨15次破碎組織和細(xì)胞。將研磨后的懸濁液用6 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至12，并在室溫中靜置24 h，以除去內(nèi)源性Sal、NMSal等化合物。然后用甲酸調(diào)節(jié)pH值至4.0。取70 μL懸濁液分別加入10 μL低、中、高三個濃度(Sal：0.015、0.15、1.50 nmol/L；NMSal：0.4、4.0、40.0 nmol/L)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，20 μL組織裂解液以及10 μL 100 nmol/L Isop。混勻后于17 000 g、4 ℃離心30 min。棄置沉淀，取上清經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾收集下層濾液。每個濃度平行操作6次，共計(jì)18個樣品。每個樣品取15 μL進(jìn)行HPLC-MS/MS檢測。

1.5 轉(zhuǎn)基因小鼠腦中Sal、NMSal含量的檢測

將轉(zhuǎn)基因小鼠培養(yǎng)至12月齡后，用無水乙醚將小鼠深度麻醉，心臟灌流，待血液完全排出后斷頭取腦。取A53T、WT和正常的小鼠鼠腦各5只，按10∶1懸浮在含10 nmol/L Isop的組織裂解液中，然后用1.5 mL的組織研磨器在冰浴中按同樣的力度研磨15次破碎組織和細(xì)胞。破碎后的懸濁液在17 000 g、4 ℃ 條件下離心30 min。棄置沉淀，取上清經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾，濾液進(jìn)行HPLC-MS/MS檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相pH條件優(yōu)化

液相色譜流動相甲酸銨緩沖液的pH值不僅影響Sal、NMSal和Isop在溶液中的穩(wěn)定性(在堿性條件下極不穩(wěn)定)，還影響它們在五氟苯基柱中的保留時間和質(zhì)譜離子化過程中的離子化效率。配制pH值分別為3.0、3.5、4.0、4.5和5.0的10 mmol/L的一系列甲酸銨緩沖溶液，考察甲酸銨緩沖液pH值對NMSal的保留時間、峰面積和各化合物分離情況的影響。從圖2可以看出，隨著pH值的升高，NMSal峰面積及其與Isop的分離度RS先升高后降低，在pH=4.0時達(dá)到最大值，且此時NMSal與Sal、Isop均能達(dá)到完全分離(RS>1.5)。因此，確定最佳的pH條件為4.0。

2.2 MRM參數(shù)的優(yōu)化

先后以Q1全掃方式、子離子掃描方式分別對Sal、NMSal和Isop的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行一級質(zhì)譜全掃描，以排除干擾和兼顧高響應(yīng)值為原則確定Sal、NMSal以及Isop的MRM特征性母離子-子離子分別為180.1→117.1、194.1→145.1和212.1→107.0。先后以選擇離子掃描方式和MRM方式，分別對Sal、NMSal和Isop的碎裂電壓、碰撞能量參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如表1所示。通過質(zhì)譜、色譜條件優(yōu)化后，Sal、NMSal和內(nèi)標(biāo)Isop能達(dá)到完全分離，見圖3。

圖2 流動相pH值對NMSal的峰面積和分離度的影響Fig.2 Effect of pH of mobile phase on peak area and RS of NMSal

圖3 Sal、NMSal和Isop MRM色譜圖(疊加后)Fig.3 MRM overlapped chromatograms of Sal, NMSal and Isop 表1 Sal、NMSal和Isop的MRM參數(shù)優(yōu)化Table 1 Summary of MRM parameters for Sal,NMSal and Isop

CompoundsMRM transitions(m/z)Fragmentor(V)Collision energy(eV)SalNMSal180.1→117.1194.1→145.11051152418Isop212.1→107.08530

2.3 內(nèi)源性Sal、NMSal和Isop去除

按1.2所示方法對鼠腦組織提取液進(jìn)行強(qiáng)堿處理，處理前后分別通過HPLC-MS/MS檢測，考察內(nèi)源性Sal、NMSal去除效果。由圖4(a)可知，NaOH處理前鼠腦組織中含有微量Sal和NMSal，但檢測不到Isop的存在。經(jīng)過NaOH處理后，內(nèi)源性Sal、NMSal均在檢出限以下(圖4(b))，說明該方法可以有效排除內(nèi)源性Sal、NMSal對標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液和方法回收率的干擾。

圖4 NaOH處理前(a)和處理后(b)鼠腦組織提取液中的Sal、NMSal和Isop的MRM提取色譜圖Fig.4 MRM extracted chromatograms of Sal,NMSal and Isop in mice brain tissue extract before (a) and after (b) NaOH treatment

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1方法的線性范圍、檢出限和定量限為了盡可能模擬生物樣品的實(shí)際情況，提高定量結(jié)果的可靠性，采用生物背景基質(zhì)添加內(nèi)標(biāo)和目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)品配制標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。根據(jù)已優(yōu)化好的色譜、質(zhì)譜條件，對標(biāo)準(zhǔn)混合工作液進(jìn)行HPLC-MS/MS檢測，檢測數(shù)據(jù)經(jīng)過Agilent MassHunter Quantitative Analysis 定量分析軟件處理，分別以Sal、NMSal的濃度與內(nèi)標(biāo)Isop濃度的比值為橫坐標(biāo)(X)，Sal、NMSal的峰面積與Isop峰面積的比值為縱坐標(biāo)(Y)，由軟件自動擬合線性方程，結(jié)果如表2所示。

表2 NMSal和Sal線性方程、相關(guān)系數(shù)(r)、線性范圍、檢出限(LODs)及定量限(LQDs)Table 2 The linear equaltions,correlation coefficients(r),linear ranges,LODs and LOQs of NMSal and Sal

2.4.2方法的精密度和準(zhǔn)確度分別選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線中低、中、高三個濃度的質(zhì)量控制(QC)樣品(Sal：0.015、0.15、1.50 nmol/L；NMSal：0.4、4.0、40.0 nmol/L；Isop：均為10 nmol/L)進(jìn)行方法的準(zhǔn)確度和精密度考察。三個濃度QC樣品的日內(nèi)精密度重復(fù)5次進(jìn)樣測得，日間精密度連續(xù)3 d重復(fù)進(jìn)樣6次測得。結(jié)果顯示(表3)，該方法的重復(fù)性和準(zhǔn)確性均符合定量分析要求。

表3 HPLC-MS/MS測定Sal、NMSal的精密度和準(zhǔn)確度Table 3 The precision and accuracy of Sal and NMSal by HPLC-MS/MS

(a)：mean±SD,n=5；(b)：mean±SD,n=6(3 d).

2.4.3方法的回收率對Sal、NMSal在實(shí)際樣品中的回收率進(jìn)行考察，結(jié)果表明該方法Sal、NMSal回收率分別在86.5%～90.7%和81.0%～91.4%之間，如表4所示。說明前處理方法對樣品造成的損失少，重復(fù)性較為理想。

表4 NMSal和Sal樣品回收率Table 4 The recovery of NMSal and Sal

2.5 過表達(dá)α -Synuclein轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Sal、NMSal的含量檢測

圖5 A53T(a)和WT(b)轉(zhuǎn)基因小鼠腦中內(nèi)源性Sal、NMSal和Isop的MRM提取色譜圖Fig.5 MRM extracted chromatograms of Sal,NMSal and Isop in the brain of A53T (a) and WT (b) transgenic mice

圖6 A53T、WT和正常小鼠腦內(nèi)Sal、NMSal的含量比較Fig.6 Levels of Sal and NMSal in the brain of A53T,WT and control mice *:P<0.05 versus control group;**:P<0.01 versus control group;#:P<0.05 versus WT group;n=5.

按照上述建立的Sal、NMSal的HPLC-MS/MS檢測方法，對過表達(dá)α-Synuclein轉(zhuǎn)基因小鼠腦中內(nèi)源性Sal、NMSal的含量進(jìn)行檢測，相關(guān)結(jié)果見圖5、圖6。結(jié)果顯示A53T、WT轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Sal的含量與對照組相比均明顯升高(P<0.05，n=5)；A53T轉(zhuǎn)基因小鼠腦中NMSal濃度與WT轉(zhuǎn)基因小鼠相比顯著升高(P<0.05,n=5)，與對照組相比具有極顯著差異(P<0.01,n=5)；WT轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)NMSal濃度與對照組相比明顯升高(P<0.05,n=5)。該結(jié)果表明，過表達(dá)A53T、WTα-Synuclein會導(dǎo)致生物體內(nèi)更多內(nèi)源性神經(jīng)毒素Sal、NMSal的生成，而A53T突變型α-Synuclein與野生型相比更容易促進(jìn)寡聚體的形成，從而造成NMSal水平的升高，進(jìn)一步對神經(jīng)元細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。

3 結(jié)論

建立基于多反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)的Sal、NMSal高靈敏度、高選擇性、高重復(fù)性的HPLC-MS/MS定量檢測方法。運(yùn)用該方法對過表達(dá)人源突變型A53T和野生型α-Synuclein的轉(zhuǎn)基因小鼠腦中內(nèi)源性Sal、NMSal含量進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，過表達(dá)A53T、WTα-Synuclein蛋白會導(dǎo)致內(nèi)源性神經(jīng)毒素Sal、NMSal含量顯著升高。該結(jié)果對研究α-Synuclein的異常聚集與內(nèi)源性神經(jīng)毒素之間的關(guān)系、闡明帕金森病發(fā)病機(jī)制具有一定的參考意義。