張秋蘭, 逯 露, 李 璋, 倪永年*

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047; 2.南昌大學化學學院,江西南昌 330031)

圖1 呋喃唑酮的化學結構式Fig.1 The structure of furazolidone

硝基呋喃類藥物是人工合成的具有5-硝基呋喃基本結構的廣譜抗菌藥物,它對大多數(shù)革蘭氏陽性菌和陰性菌、某些真菌和原蟲均有作用,在養(yǎng)殖業(yè)中廣泛使用。目前此類藥物的副作用已引起人們的關注[1 - 2]，我國出口的魚、蝦、禽肉等時有被檢出含有硝基呋喃類藥物,特別是出口鰻魚多次被檢出硝基呋喃類藥物殘留,嚴重影響我國動物源性食品出口的信譽。在養(yǎng)殖業(yè)中常使用的硝基呋喃類藥物包括呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮[3 - 5]。其中，呋喃唑酮(圖1)主要用于水產養(yǎng)殖中疾病預防和治療，而通過食物鏈殘留在動物臟器中的硝基呋喃類藥物能進入人體而危害健康,故呋喃唑酮與蛋白質的作用機制值得進一步研究。

牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)是血漿中最為豐富的蛋白質,它能與進入血液中的大多數(shù)內源和外源性物質，如與藥物進行可逆的結合從而起到在體內轉運的作用[6]。藥物與BSA親和力的大小也影響到藥物在動物體內的分布、清除及通過改變血液組織或其中游離藥物濃度來影響藥效。因此,研究藥物與血清白蛋白的結合作用對理解藥物的作用機制具有重要意義[7 - 8]。本文在人體生理(pH=7.4)條件下，應用光譜法并結合原子力量微鏡研究了呋喃唑酮與牛血清白蛋白相互作用的機理，確定了該藥物對BSA的熒光猝滅機制以及對BSA構象的影響。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LS-55型熒光分光光度計(美國，PE公司);8453型紫外-可見分光光度計(美國，Agilent公司);ZC-10型智能型超級恒溫水槽(寧波天恒儀器廠);TENSOR 27型傅里葉紅外光譜儀(德國，布魯克公司);圓二色譜儀(法國,Bio-Logic公司);AJ-Ⅲ型原子力顯微鏡(上海愛建納米公司)。

呋喃唑酮(FZD)(純度98%，Sigma-Aldrich Chemical Co)儲備液:用二次水配成3.35×10-3mol·L-1的溶液;牛血清白蛋白(BSA)(純度99%，合肥博美生物科技有限公司)溶液:配成1.76×10-3mol·L-1和2.0×10-5mol·L-1兩種儲備液,置于冰箱中保存(1～4 ℃);Tris-HCl緩沖溶液：0.05 mol·L-1,pH=7.4。實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 實驗過程

在比色皿中加入3.0 mL pH=7.4的Tris-HCl 緩沖溶液,根據(jù)實驗需要分別加入適量的呋喃唑酮和BSA溶液。由于加入試劑的體積遠小于初始體積,因此可以忽略濃度稀釋效應。實驗1:固定BSA的濃度(6.67×10-8mol·L-1),然后加入不同量的呋喃唑酮，使最終濃度為0至21.33×10-8mol·L-1,間隔為2.67×10-8mol·L-1,放置5 min使平衡,分別在溫度298、302和306 K下測其熒光光譜。實驗2:固定BSA的濃度(6.67×10-6mol·L-1),逐步加入呋喃唑酮溶液,使[FZD]∶[BSA]為0至9,分別測定不同濃度比例時的紫外吸收光譜(298 K)。實驗3:分辨率為4 cm-1,取樣次數(shù)為60,在800～2 000 cm-1范圍內,以緩沖溶液做參比,分別掃描BSA和復合物FZD-BSA的紅外光譜。實驗4:在190～250 nm波長范圍內,分別測定BSA和復合物FZD-BSA的圓二色譜。實驗5:分別取6 μL前一天配制的實驗所需濃度的BSA和FZD-BSA樣品滴在云母片上,室溫放置24 h后，進行原子力顯微鏡測試。

2 結果與討論

圖2 由實驗1所得的呋喃唑酮與BSA作用的熒光光譜圖Fig.2 Emission spectra of BSA in the presence of FZD with various concentration (Experiments 1) cBSA=6.67×10-8 mol·L-1;cFZD=0,2.67,5.33,…,21.33×10-8 mol·L-1 (curves 1-9);Tris-HCl buffer,pH=7.4;excitation and emission slits were 10 nm;scanning rate was 1 000 nm·min-1.

2.1 FZD對BSA內源性熒光猝滅機理的研究

BSA有兩個具有內源熒光的色氨酸殘基[9]:Trp212在疏水性空腔的內部,而Trp134在分子的表面。BSA在紫外區(qū)的熒光主要來源于色氨酸殘基。當其他配體與BSA作用時,由于復合物的生成,使色氨酸的熒光發(fā)生變化[10];熒光的改變實際上是與發(fā)光過程相互競爭從而縮短發(fā)光分子激發(fā)態(tài)壽命的過程。固定BSA的濃度,并逐漸增大FZD的濃度(實驗1),BSA在350 nm處的熒光發(fā)射強度隨藥物的增加而有規(guī)律地下降(圖2),說明FZD與BSA發(fā)生了相互作用。

導致熒光猝滅有多種機制,主要有動態(tài)和靜態(tài)猝滅,一般可遵循Stern-Volmer方程予以區(qū)分[11]:

F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+KSV[Q]

(1)

式中,F0和F分別是不存在和存在猝滅劑時蛋白質的熒光強度,[Q]是猝滅劑的濃度,KSV是Stern-Volmer猝滅常數(shù),Kq為雙分子猝滅速率常數(shù),τ0為生物大分子熒光壽命(約為10-8s-1)。

分別作溫度298、302和306 K下,FZD對BSA熒光猝滅的Stern-Volmer擬合曲線(圖略),均具有良好線性關系,且隨著溫度的升高,藥物與BSA作用的KSV減小(表1),FZD對BSA猝滅速率常數(shù)分別為1.64、1.50和1.37×106L·mol-1。一般認為,各類猝滅劑與生物大分子的最大擴散碰撞猝滅速率常數(shù)為2×1010L·mol-1·s-1[11],顯然FZD對BSA猝滅過程的速率常數(shù)(1014L·mol-1·s-1)大于擴散控制的猝滅速率常數(shù)Kq,表明猝滅過程為生成復合物的靜態(tài)猝滅[12]。

表1 FZD與BSA反應的結合常數(shù)和熱力學參數(shù)Table 1 The binding constants and relative thermodynamic parameters of the FZD-BSA system

2.2 結合常數(shù)和結合位點數(shù)的測定

對于靜態(tài)猝滅過程,熒光強度與猝滅劑之間的關系可由熒光分子與猝滅劑的結合常數(shù)表達式-雙對數(shù)方程得到。由計算得到的Ka和n見表1,結合常數(shù)Ka的變化趨勢與KSV相同,都隨著溫度的升高而減小(由6.50×106L·mol-1減小到5.07×106L·mol-1),表明溫度的升高使生成的配合物的穩(wěn)定性下降。結合常數(shù)大于106L·mol-1,說明FZD與BSA有比較強的作用力;結合位點數(shù)接近1,說明FZD在BSA上有一獨立的結合位點[13]。

2.3 作用力類型的確定

有機小分子與生物大分子借助于疏水作用力、氫鍵、范德華力和靜電引力等作用形成復合物[14],不同分子與蛋白質的結合力類型是不同的。Ross等[15]總結了判斷生物大分子和小分子結合性質的熱力學規(guī)律。根據(jù)反應前后熱力學焓變和熵變的相對大小,可判斷小分子與大分子之間的主要作用力類型。熵變和焓變可根據(jù)van’t Hoff方程計算[15]。而在不同溫度下的吉布斯自由能(ΔG)可由下式得到:

ΔG=ΔH-TΔS

(2)

不同溫度下的結合常數(shù)計算得到的熱力學參數(shù)列于表1中。焓變(ΔH)小于零說明FZD與BSA形成復合物的反應為放熱反應,吉布斯自由能(ΔG)小于零表明結合過程是自發(fā)進行的。焓變ΔH(-16.22 kJ·mol-1)<0,熵變ΔS(-26.01 J·mol-1·K-1)<0,說明呋喃唑酮與BSA之間的作用力主要為氫鍵和范德華力。

2.4 紫外光譜研究呋喃唑酮與BSA的相互作用

圖3 Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.4)中BSA與不同濃度FZD的紫外吸收光譜圖Fig.3 The UV-Vis spectra of BSA and FZD with different concentration in Tris-HCl buffer(pH=7.4) cBSA=6.67×10-7 mol·L-1;curves(1-10):[FZD]∶[BSA]=0,1,2,3,…,10.

BSA在278 nm處的吸收峰是其肽鏈上的色氨酸和酪氨酸的苯雜環(huán)π-π*躍遷引起的。從圖3可知，隨著FZD濃度的增加，在278 nm處峰位置藍移且吸收強度逐漸增加,說明FZD與BSA發(fā)生了作用,誘導BSA分子鏈發(fā)生了類似降低pH值所出現(xiàn)的蛋白質肽鏈伸展現(xiàn)象[16],被包含在BSA內部的色氨酸和酪氨酸殘基的芳雜環(huán)疏水基團裸露出來,使吸收強度增加,同時疏水基團之間的疏水作用減弱;由于BSA與加入的FZD分子生成了新的共軛體系,形成新的π-π*躍遷,使吸收峰發(fā)生了位移。動態(tài)猝滅只影響熒光生色團的激發(fā)態(tài),不會改變紫外光譜峰。因此,通過BSA紫外吸收光譜的變化可確定基態(tài)復合物的形成，并證明熒光猝滅機理為靜態(tài)猝滅[17]。

圖4 FZD與BSA相互作用的紅外(IR)光譜圖Fig.4 IR spectra of BSA before and after binding with FZD(A);Curve-fitted amide Ⅰ region (1 700-1 600 nm) of free BSA (B) and its complex (C) cBSA=6.67×10-6 mol·L-1,[FZD]∶[BSA]=4,IR spectra were recorded with a resolution of 4 cm-1 and 60 scans (range:800～2 000 cm-1).The IR spectra of sample solutions collected were corrected by subtracting the spectrum of buffer.

2.5 呋喃唑酮對BSA構象的影響

2.5.1紅外光譜法研究FZD對BSA構象的影響為進一步確定藥物結合蛋白后對蛋白二級結構的影響,利用紅外光譜研究了FZD與BSA的相互作用[18]。由圖4A可以看出,FZD與BSA的作用使得酰胺Ⅰ帶由1 655 nm移至1 652 nm,酰胺Ⅱ帶由1 541 nm移至1 536 nm,表明FZD分子與蛋白質結合,改變了BSA的二級結構。應用去卷積和曲線擬合法對譜圖進行處理(圖4B和4C),計算出BSA酰胺Ⅰ帶的二級結構含量。當FZD與BSA的摩爾比為4時,BSA的α-螺旋和β-折疊含量由46.97%、11.74%分別減少至42.15%和9.87%;而β-折疊由15.91%增加至18.41%；β-轉角和無規(guī)則卷曲也有不同程度的增加。由此說明FZD可改變BSA的結構。

圖5 呋喃唑酮與BSA相互作用的圓二色譜圖Fig.5 The CD spectra of BSA before and after binding with FZD [BSA]=6.67×10-8 mol·L-1,[FZD]∶[BSA]=4,wavelength range:190-280 nm,scanning speed:1 nm·s-1.

2.5.2圓二色譜法研究FZD對BSA構象的影響不同二級結構的蛋白質產生的圓二色譜譜帶位置、吸收強弱不同,α-螺旋在208 nm和222 nm處有兩個負的特征肩峰譜帶,β-折疊在216 nm處有一負譜帶,β-轉角在206 nm附近處有一正譜帶,而無規(guī)則卷曲200 nm附近的負峰是其特征曲線[19]。由圖5可知,隨著呋喃唑酮的加入,負峰的強度明顯降低,說明BSA的α-螺旋結構含量降低。根據(jù)公式[20]可計算得到α-螺旋結構的含量從55.6%降低到51.2%。實驗結果與紅外研究基本一致,表明FZD與BSA結合后使蛋白部分伸展,降低了BSA的穩(wěn)定性。但是,BSA的圓二圖譜中的峰形和峰位并未明顯改變,表明BSA中的α-螺旋結構仍占主導地位。

2.5.3原子力顯微鏡(AFM)研究FZD對BSA構象的影響AFM具有比較好的信噪比、空間分辨率和靈活的探測環(huán)境,使其在單分子成像,和蛋白單分子結構與功能研究中得到廣泛應用。AFM可觀測到蛋白質分子的表面形貌,也能夠連續(xù)監(jiān)測生化反應的動力學過程[21]。與FZD結合后對比發(fā)現(xiàn),BSA分子直徑和厚度都增大,BSA的表面粗糙度(RMS)由1.65±0.21 nm增至14.23±0.32 nm(圖6),可能是BSA所處微環(huán)境和構象發(fā)生變化所致[22]。

圖6 BSA與呋喃唑酮相互作用前(A)和作用后(B)的原子力顯微鏡(AFM)圖Fig.6 AFM spectra of BSA before (A) and after (B) binding with FZD [BSA]=6.67×10-8 mol·L-1,[FZD]∶[BSA]=4,samples were prepared by depositing 6.0 μL on freshly cleaved mica plates (1.2×1.2 cm),dried 24 h and used for AFM with tapping mode.

3 結論

本文利用熒光、紫外、紅外光譜和圓二色譜法研究呋喃唑酮與牛血清白蛋白的相互作用。可知呋喃唑酮與BSA的相互作用過程屬于形成基態(tài)復合物的靜態(tài)猝滅;由熱力學公式計算得到焓變ΔH<0，熵變ΔS<0,說明呋喃唑酮與BSA之間的作用力主要為范德華力和氫鍵;而由雙對數(shù)方程得到結合常數(shù)大于106L·mol-1,說明呋喃唑酮在血液中的存在時間久,難以代謝,毒副作用強;各種光譜和AFM實驗說明呋喃唑酮的存在,不僅改變了BSA所處的微環(huán)境并使BSA的構象發(fā)生變化。