趙 琴， 許 靜， 胡藝凡， 馮鈺锜*

(1.武漢科技大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，職業(yè)危害識別與控制省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北武漢 430074；2.生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430072)

近幾十年來，多環(huán)芳烴(PAHs)污染已成為眾所周知的食品安全問題。在目前已發(fā)現(xiàn)的200多種PAHs中，苯并芘(BaP)由于其高毒性和強(qiáng)誘導(dǎo)突變性，成為被研究得最多的一種化合物[1 - 2]。我國規(guī)定，食用油中BaP的最大殘留限量值為10 ng/g。食用油脂中存在大量甘油三酯和其它物質(zhì)，每克油中BaP的含量低至納克級。此外由于BaP疏水性較強(qiáng)，其對油脂基質(zhì)具有很強(qiáng)親和力，因此要想準(zhǔn)確定量測定油脂中的BaP，其關(guān)鍵步驟是采用有效的樣品前處理方法對油脂基質(zhì)中的BaP進(jìn)行分離和純化[1 - 2]。

磁固相萃取(MSPE)采用磁性的或可磁化的材料作為吸附劑，將MSPE材料通過渦旋或振搖直接分散到樣品溶液中，這種分散的萃取模式可顯著增大樣品溶液與吸附劑的接觸面積，提高萃取率，并有益于目標(biāo)分析物的快速傳質(zhì)，從而縮短樣品前處理的時(shí)間[3 - 4]。因此，在MSPE中吸附劑材料的制備是關(guān)鍵。腐殖酸(HAs)是由動植物的殘肢經(jīng)微生物降解而產(chǎn)生的復(fù)雜混合物，已被證明含有烷基和芳環(huán)的骨架，并附有羧酸基、酚羥基、醌基、氨基等官能團(tuán)[5 - 6]。這些特殊的分子結(jié)構(gòu)使HAs易于與金屬離子、氧化物以及一些有毒的有機(jī)物發(fā)生螯合作用、電荷轉(zhuǎn)移作用、氫鍵相互作用、疏水作用以及π-π相互作用等[7 - 8]，使之在分離科學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。本文將HAs直接與Fe3O4磁性納米顆粒(MNPs)在研缽中混合研磨，在這個(gè)過程中，F(xiàn)e3O4包裹粘附在微小的HAs顆粒上，從而形成磁性腐殖酸復(fù)合物(MHAs)。將制得的MHAs用于MSPE食用油中BaP，通過與高效液相色譜-熒光檢測法(HPLC-FLD)聯(lián)用，建立了一種食用油中BaP的快速檢測方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及工作條件

LC-20A高效液相色譜儀(日本，島津公司)，包括兩臺LC-20AD高壓輸液泵、DGU-20A3脫氣機(jī)、RF-10AXL 熒光檢測器、SIL-20A自動進(jìn)樣器和CTO -20AC柱溫箱。色譜柱為武漢維泰克公司的HiSep C18色譜柱(150×4.6 mm i.d.,5 μm)，柱溫40 ℃；流動相為88%的乙腈水溶液，流速為1.0 mL/min；激發(fā)和發(fā)射波長分別為384 nm和406 nm，進(jìn)樣量為10 μL。樣品的紅外分析由AVTAR-360紅外光譜儀(Thermo Nicolet,Madison,USA)測得。

1.2 試劑

苯并芘(BaP，≥96.5%)購于Acros公司(比利時(shí))。BaP標(biāo)準(zhǔn)溶液：將一定量BaP用色譜純異丙醇溶解，配制成1 mg/mL儲備溶液，使用時(shí)用色譜純正己烷或異丙醇稀釋至所需濃度。所有標(biāo)準(zhǔn)溶液均在-20 ℃ 冰箱中避光保存(該條件下，BaP至少能穩(wěn)定保存3個(gè)月)。乙二醇、丙酮、乙二胺、FeCl3·6H2O、正己烷、NaAc均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。丙酮、異丙醇、正己烷均為色譜純，購于Mallinckrodt Baker股份有限公司(美國)。色譜純乙腈購于Tedia公司(美國)。三個(gè)不同批次的腐殖酸分別由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司和沈陽化學(xué)試劑股份有限公司提供，使用前將腐殖酸在60 ℃下用丙酮索氏提取48 h以去除雜質(zhì)。其他的試劑均直接使用，無需進(jìn)一步凈化。實(shí)驗(yàn)用水均為超純水(美國Waters 公司生產(chǎn)的 Milli-Q系統(tǒng)制備)。

1.3 油脂樣品的制備

調(diào)和油、花生油、橄欖油、亞麻油、茶籽油、椰子油、稻米油、玉米油、菜籽油、葵花籽油和大豆油，均購于武漢當(dāng)?shù)厥袌霾⒂谑覝叵卤芄赓A藏。樣品溶液為稀釋的加標(biāo)橄欖油溶液(0.1 g/mL)，其中BaP的加標(biāo)濃度為2 ng/mL。在1 g的橄欖油中分別加入0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100 ng的BaP，混合均勻后用正己烷稀釋至10 mL，用以考察線性、定量限和檢出限。

1.4 磁性腐殖酸(MHAs)的制備

首先采用溶劑熱還原法[9]制備單分散的介孔Fe3O4納米顆粒，主要過程如下：稱取15 g FeCl3·6H2O，置于1 L的玻璃燒杯中，加入300 mL乙二醇，磁子攪拌(或超聲輔助)使固體FeCl3·6H2O完全溶解于乙二醇。緩慢向上述溶液中加入45.0 g NaAc，再加入150 mL 1,2-乙二胺，強(qiáng)烈攪拌使形成澄清溶液。將該溶液轉(zhuǎn)入聚四氟乙烯反應(yīng)內(nèi)膽后，密封在不銹鋼反應(yīng)釜中。將反應(yīng)釜放入200 ℃烘箱中反應(yīng)10 h。反應(yīng)結(jié)束后，將生成的黑色沉淀(Fe3O4)在外加磁場下，用超純水反復(fù)清洗多次，直至倒出的上清液無色透明為止。將該產(chǎn)物60 ℃下真空干燥數(shù)小時(shí)，待用。分別稱取1.5 g的Fe3O4和1 g的 HAs于同一研缽中，將兩種材料混合均勻并充分磨碎。在這個(gè)過程中，F(xiàn)e3O4包裹并粘附在細(xì)小的HAs顆粒表面，由此HAs被賦予磁性，當(dāng)MHAs分散在溶劑中時(shí)，在外加磁場下可快速地從溶液中分離。

1.5 MSPE步驟

準(zhǔn)確稱取100 mg MHAs于15 mL玻璃萃取小瓶中，先用2 mL丙酮渦旋活化2 min。倒出丙酮后，加入10 mL稀釋的油樣溶液(0.1 g/mL)。將該混合物渦旋5 min以形成均勻的分散溶液，在該過程中，目標(biāo)物BaP通過π-π相互作用保留在萃取材料上，而油脂基質(zhì)則在溶液中。在外加磁場作用下，吸附了BaP的MHAs被收集在萃取小瓶底部，移出上清液，加入2 mL異丙醇渦旋清洗30 s，以去除吸附在材料表面和瓶壁的殘余油脂。棄去清洗液后，加入3 mL丙酮渦旋解吸2 min。在外加磁場下，解吸液與MHAs快速分離，并被轉(zhuǎn)移至塑料離心管中，40 ℃氮吹至干。將殘?jiān)?00 μL異丙醇重新溶解定容，取10 μL進(jìn)行HPLC-FLD分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 材料的紅外光譜表征

紅外光譜表征結(jié)果如圖1所示，MHAs與HAs的紅外譜圖中出現(xiàn)的2 923 cm-1和2 848 cm-1為飽和烴C-H鍵的伸縮振動吸收峰；出現(xiàn)的1 708 cm-1為C=O鍵伸縮振動吸收峰，結(jié)合在3 440 cm-1處強(qiáng)吸收的寬峰，說明了羧酸基團(tuán)的存在；出現(xiàn)在1 620 cm-1處的強(qiáng)吸收寬峰為芳環(huán)骨架的伸縮振動吸收峰；從900 cm-1到1 400 cm-1處的一系列吸收峰為烷烴和芳烴的C-H彎曲振動吸收峰。從圖中可明顯看出MHAs與HAs的特征峰基本相對應(yīng)，說明本文提出的混合研磨的制備方法對HAs的性質(zhì)沒有明顯影響，可最大程度的保留其吸附位點(diǎn)。

2.2 活化作用的影響

在本實(shí)驗(yàn)中，MHAs在萃取前首先經(jīng)丙酮渦旋活化2 min。為了考察活化對萃取效率的影響，我們進(jìn)行了平行對照實(shí)驗(yàn)，即一組MHAs經(jīng)活化后，再萃取油樣中的BaP；另一組MHAs不經(jīng)活化，直接用于萃取BaP，如圖2所示。從圖中我們可以明顯看出未經(jīng)活化的MHAs幾乎喪失了萃取BaP的能力。這可能歸因于HAs特殊的結(jié)構(gòu)特征：HAs表面含有大量的極性基團(tuán)如羥基、氨基、羧基等，這些極性的親水基團(tuán)阻礙了疏水的油樣溶液進(jìn)入材料內(nèi)部，導(dǎo)致目標(biāo)物BaP無法通過π-π相互作用保留在MHAs的芳香內(nèi)穴。然而，經(jīng)極性溶劑活化后，殘留的溶劑液膜可以幫助BaP滲透到吸附劑內(nèi)部，從而提高萃取效率。在本實(shí)驗(yàn)中，毒性相對較低的丙酮被選作活化劑，它不但起到激活吸附劑的作用，還可進(jìn)一步去除吸附在MHAs上的雜質(zhì)。

圖1 Fe3O4磁性納米顆粒(a)、磁性腐殖酸(b) 和腐殖酸(c)的紅外(IR)光譜圖Fig.1 IR spectra of MNPs(a),MHAs(b) and HAs(c)

圖2 丙酮活化對萃取效率的影響Fig.2 The effect of activation with acetone before MSPE

2.3 MSPE條件的優(yōu)化

本文將商品化HAs通過與MNPs共混研磨，制備成MHAs用于MSPE食用油中BaP，優(yōu)化了一系列可能影響MSPE萃取性能的參數(shù)。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中以將加標(biāo)的稀釋油樣(2 ng/mL)作為基質(zhì)，每個(gè)條件均平行進(jìn)行三組實(shí)驗(yàn)。

2.3.1吸附劑的用量為了保證足夠的萃取回收率，我們將吸附劑的用量從25 mg逐漸增加至125 mg。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3(a)所示：當(dāng)吸附劑用量從25 mg增加至100 mg時(shí)，回收率明顯提高，繼續(xù)增加吸附劑的用量，回收率沒有明顯變化。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，將吸附劑用量固定在100 mg。

圖3 吸附劑用量(a)、解吸溶劑體積(b)、萃取時(shí)間(c)和解吸時(shí)間(d)對回收率的影響Fig.3 The Effect of amont of sorbent(a),volume of desorption solvent(b),extraction time(c) and desorption time(d) on the extraction efficiency The oil sample solutions with BaP spiked at 2 ng/mL were prepared by diluting 1 g edible oil to 10 mL with n-hexane.

2.3.2解吸液的體積解吸液的體積直接影響解吸效率。在本實(shí)驗(yàn)中，毒性相對較低的丙酮被選作解吸液，其可有效地將吸附在MHAs上的BaP洗脫下來。為了考察丙酮體積對回收率影響，我們分別采用不同體積的丙酮作為解吸液(0.5、1、2、3、5、8 mL)。結(jié)果(圖3(b))表明3 mL的丙酮足夠?qū)HAs上吸附的BaP完全洗脫。由于目標(biāo)分析物BaP在解吸溶液中濃度較低，因此在進(jìn)樣前將解吸液在溫和氮?dú)饬飨抡舭l(fā)至近干，然后用100 μL異丙醇重新溶解，這樣可以有效提高檢測靈敏度。

2.3.3萃取和解吸時(shí)間在本實(shí)驗(yàn)中，萃取和解吸時(shí)間的考察范圍均為1～10 min。結(jié)果表明，當(dāng)萃取時(shí)間從1 min增至5 min時(shí)，萃取效率提高，但繼續(xù)增加渦旋時(shí)間對回收率沒有明顯影響(圖3(c))，因此萃取時(shí)間定為5 min。此外，當(dāng)解吸時(shí)間從1 min增加到10 min時(shí)，未觀察到回收率有明顯變化(圖3(d))，因此解吸時(shí)間設(shè)為2 min。本實(shí)驗(yàn)中，快速的萃取和解吸過程歸功于MSPE分散的處理模式，其有效增大了樣品溶液和吸附劑之間的接觸面積，促進(jìn)了目標(biāo)分析物的傳質(zhì)，使得萃取和解吸平衡可在短時(shí)間內(nèi)到達(dá)。

2.4 方法學(xué)考察

在上述優(yōu)化的條件下，考察了線性、檢出限(LOD)、定量限(LOQ)、精密度以及加標(biāo)回收率以驗(yàn)證該方法在實(shí)際應(yīng)用中的可行性。以低溫初榨的橄欖油為樣品基質(zhì)，添加不同濃度的BaP(每個(gè)濃度平行三組實(shí)驗(yàn))，以得到的平均峰面積對樣品濃度進(jìn)行線性回歸，得到線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明目標(biāo)物BaP在0.1～100 ng/g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R為0.999。以信噪比為3計(jì)算得BaP的檢出限0.04 ng/g；以信噪比為10計(jì)算得定量限為0.13 ng/g。線性回歸、檢出限和定量限數(shù)據(jù)列于表1。

表1 方法線性范圍、線性參數(shù)、檢出限及定量限Table 1 The linear range,regression data,limit of detection(LOD),limit of quantification(LOQ) for the determination of BaP in oil samples

我們在橄欖油中分別添加低(1 ng/g)、中(5 ng/g)和高(10 ng/g)三個(gè)濃度的目標(biāo)分析物。在1 d內(nèi)單獨(dú)配制5組平行樣品并進(jìn)行萃取，計(jì)算得日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)；以連續(xù)3 d，每天配制3組平行樣品并進(jìn)行萃取測定，計(jì)算得日間RSD。結(jié)果表明日內(nèi)和日間RSDs分別小于3.5% 和15.8%，說明所建立的方法重現(xiàn)性良好，見表2。

表2 苯并芘日內(nèi)日間精密度Table 2 Precisions for the determination of BaP at three different concentrations in oil samples

2.5 實(shí)際樣品中的應(yīng)用

為了考察我們建立的方法的普適性，將該方法應(yīng)用到多種常見的食用油中進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果如表3所示，所有食用油中均含有一定量的BaP，濃度從0.17 ng/g至8.16 ng/g。7種食用油中檢測到的BaP的色譜圖見圖4。對12種油樣的加標(biāo)回收率為74.2%～120.6%，RSD<11.0%。說明發(fā)展的方法具有良好的普適性，可用于多種食用油中BaP的檢測。

表3 常見食用油中苯并芘的檢測結(jié)果(n=3)Table 3 Concentrations,recoveries and precisions of BaP in several real samples(n=3)

Note:The concentrations of the spiked BaP were 5 ng/g.

3 結(jié)論

制備了MHAs復(fù)合材料，并將其作為MSPE的萃取劑用于快速分離和富集食用油脂中的BaP。該制備過程簡單，不涉及任何化學(xué)反應(yīng)步驟，避免了有機(jī)溶劑的使用，綠色環(huán)保。結(jié)合HPLC-FLD分析，建立了食用油中BaP 的檢測方法，該方法簡單，高通量，低消耗。在優(yōu)化的條件下，該方法檢出限為0.04 ng/g，低于大多數(shù)已報(bào)道的檢測方法，并且準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性良好。另外，MHAs在樣品前處理中展現(xiàn)出應(yīng)用潛力，其獨(dú)特而直接的制備方法可擴(kuò)展至其它磁性材料的制備。