徐湛寧，李福貴，陳 杰，蔣霞云，鄒曙明

(上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306)

草魚(yú)鰓組織蛋白雙向電泳技術(shù)的建立及優(yōu)化

徐湛寧，李福貴，陳 杰，蔣霞云，鄒曙明

(上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306)

為建立并優(yōu)化草魚(yú)鰓蛋白質(zhì)組雙向電泳的技術(shù)體系，實(shí)驗(yàn)將草魚(yú)鰓經(jīng)裂解處理后，通過(guò)固相pH梯度膠條進(jìn)行一向等電聚焦和SDS聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳進(jìn)行蛋白分離，對(duì)不同的裂解液配方、蛋白純化方法、IPG膠條的分離范圍、上樣量和染色方法等進(jìn)行了探索和優(yōu)化，并應(yīng)用lmage Master 2D Platinum 7.0軟件對(duì)電泳圖譜進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：采用裂解液中添加DTT來(lái)取代Tris和TBP、選擇分離范圍為pH4-7的IPG膠條和150 μg的主動(dòng)水化上樣，電泳結(jié)束后對(duì)凝膠進(jìn)行硝酸銀染色，獲得了覆蓋范圍廣、低背景、高分辨率、適合差異蛋白分析的雙向電泳參考圖譜。

草魚(yú)(Ctenopharyngodonidella)；鰓蛋白質(zhì)；雙向電泳；蛋白質(zhì)組學(xué)

Abstract：In order to establish and optimize the two-dimensional electrophoresis(2-DE) system for proteomic analysis on the gill of Grass carp (Ctenopharyngodonidella)，protein samples of grass carp gill were separated by lysis.Immobilized pH gradient(IPG) strips was used to perform isoelectric focusing electrophoresis(the first dimension),and sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE) served as the protein separation.By optimizing different lysate formulations and protein purification methods，different immobilized pH gradients(IPG) gel strips，as well as varied loading amount and staining methods were investigated.The proteins were successfully isolated from grass carp gill and were separated by 2-DE.Image Master 2D Platinum 7.0 analysis software was applied to analyze the 2-DE images.The results showed that the quality of 2-DE profiles was significantly improved by replacing Tris and TBP with DTT in lysis buffer，loading 150 μg samples on the pH 4-7 immobilized pH gradients (IPG) strips，and staining with silver nitrite.In consequence，Compared with other methods the 2D-gels profiles with wider pH molecular weight range，lower background noise，higher resolution and more applicable for variant analysis were obtained by using this method consequently.

Keywords：Ctenopharyngodonidella;gill protein;two-dimensional electrophoresis;proteomics

蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)是對(duì)生物蛋白組(Proteome)的分析與檢測(cè)，即對(duì)蛋白質(zhì)的數(shù)量、性質(zhì)、功能、蛋白質(zhì)之間相互作用及其與疾病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系的研究，已成為當(dāng)前生命科學(xué)研究的熱門(mén)領(lǐng)域[1,2]。蛋白質(zhì)組分析主要通過(guò)蛋白質(zhì)混合物的分離和質(zhì)譜分析(Massspectrometry)兩步程序完成。

雙向電泳技術(shù)(Two-dimensional electrophoresis，2-DE)作為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心技術(shù)之一，是以蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子大小的不同作為標(biāo)準(zhǔn)，將蛋白質(zhì)從混合物中分離出來(lái)[3]，具有較高的分辨率和靈敏度的特點(diǎn)，目前已成為檢測(cè)和分析復(fù)雜蛋白質(zhì)組分的一種有效方法[1]。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)研究已逐漸延伸到食品科學(xué)及水產(chǎn)科學(xué)方面，但仍處于起步階段[4-8]。已有關(guān)于西施舌(Coelomactraantiquate)鰓[9]、草魚(yú)(Ctenopharyngodonidella)腎臟[10]、青鳉(Oryziaslatipes)肝臟[11]、中國(guó)明對(duì)蝦(Fenneropenaeuschinensis)肌肉[12]、尼羅羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus)肌肉[13]、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)表皮[14]等進(jìn)行蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)體系建立的研究。對(duì)于草魚(yú)鰓蛋白質(zhì)雙向電泳體系的建立尚未見(jiàn)報(bào)道。

草魚(yú)(Ctenopharyngodonidella)屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)草魚(yú)屬(Ctenopharyngodon)，具有快速生長(zhǎng)，個(gè)體大，肉質(zhì)肥嫩鮮美，肌間刺少等優(yōu)點(diǎn)[15]，是我國(guó)主要的淡水魚(yú)養(yǎng)殖種類(lèi)之一。不同物種，不同組織的雙向電泳體系所使用的條件存在較大差異[16]，本實(shí)驗(yàn)以草魚(yú)為實(shí)驗(yàn)材料，為探究草魚(yú)鰓蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)體系的最佳條件，通過(guò)對(duì)不同裂解液配方、蛋白純化方法、IPG膠條的分離范圍、上樣量和染色方法等條件進(jìn)行探索，優(yōu)化雙向電泳體系的關(guān)鍵步驟，建立了草魚(yú)鰓雙向電泳參考圖譜。目前有研究表明草魚(yú)鰓在抗呼腸孤病毒免疫方面起著重要的作用[17]，并且當(dāng)下缺乏鰓對(duì)低氧反應(yīng)的分子機(jī)制了解，建立的雙向電泳參考圖譜可為后續(xù)抗病毒和低氧脅迫下草魚(yú)鰓蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供技術(shù)支持，也為其它魚(yú)類(lèi)的鰓蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用草魚(yú)取自上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部團(tuán)頭魴遺傳育種中心。實(shí)驗(yàn)前將體重(20±2)g的草魚(yú)置室內(nèi)養(yǎng)殖缸中充氣暫養(yǎng)3 d，水溫21 ℃，使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)養(yǎng)殖環(huán)境。在冰上快速取出鰓組織放入RNase free EP管中，液氮速凍并置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與儀器

IPG干膠條、IPG Buffer，2D Clean-up試劑盒購(gòu)自美國(guó)GE公司；二硫蘇糖醇(DTT)、CHAPS、乙二胺四乙酸(EDTA)、四甲基乙二胺(TEMED)、甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉(SDS)、瓊脂糖、尿素、硫脲、丙烯酰胺、碘乙酰胺、過(guò)硫酸銨、甘氨酸，Bradford蛋白定量試劑盒購(gòu)于上海生工生物工程有限公司。其他試劑均使用分析純?cè)噭?/p>

Milli-Q Sythesis超純水系統(tǒng)(上海瑞楓生物科技有限公司)；Smart Spec TM Plus分光光度計(jì)(美國(guó)Bio-Rad公司)；5180R臺(tái)式高速大容量離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；AUY220型電子分析天平(日本島津公司)；Ettan IPG-phor II型等電聚焦電泳儀、Ettan DALT six垂直電泳系統(tǒng)(美國(guó)GE公司)；超聲波破碎儀(上海比朗儀器制造有限公司)及 Bio-6000掃描儀(上海中晶科技有限公司)。

1.3 草魚(yú)鰓組織蛋白的提取與純化

取草魚(yú)鰓250 mg，用研缽加液氮研磨成粉末狀，將粉末分別加入1 mL含蛋白酶抑制劑的裂解液中，震蕩搖勻后于冰上裂解10 min，再加入2%(v/v)IPG buffer和40 mmol/L DTT或10 mmol/L Tris、2 mmol/L TBP，震蕩搖勻于冰上裂解10 min。裂解結(jié)束后于低溫(4 ℃)離心機(jī)12 000 r/min，30 min取中上層澄清液，作為提取的草魚(yú)鰓組織蛋白樣品。其中裂解液試驗(yàn)了兩種配方，配方Ⅰ：1 mL裂解液(7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%(w/v)CHAPS、2%(v/v)IPG buffer、10 mmol/L Tris、2 mmol/L TBP)加三種蛋白酶抑制劑各5 μL(蛋白酶、磷酸酶、PMSF)；配方Ⅱ：1 mL裂解液(7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%(w/v)CHAPS、2%(v/v)IPG buffer、40 mmol/L DTT)加三種蛋白酶抑制劑各5 μL(蛋白酶、磷酸酶、PMSF)。

蛋白質(zhì)的純化方法設(shè)2組對(duì)照，A：丙酮沉淀法，取200 μL上清液，加入4倍體積丙酮溶液(-20 ℃預(yù)冷1 h)，混勻，-20 ℃沉淀過(guò)夜。4 ℃離心(12 000 r/min，30 min)去上清，獲得蛋白沉淀，用水化液冰上重新溶解蛋白，將其溶于1 mL加入0.28%(m/v)DTT和0.5%(v/v)IPG buffer緩沖液的硫脲水化緩沖液中，冰浴放置30 min，每隔10 min震蕩30 s，4 ℃離心(12 000 r/min，10 min)，取上清液備用。B：2D Clean-up試劑盒法，將A中同體積上清液按照說(shuō)明書(shū)操作，所得上清液備用。采用Bradford蛋白定量法，直接上樣或分裝后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 第一向等電聚焦電泳

參照Ettan IPG-phor II型等電聚焦系統(tǒng)使用指南進(jìn)行。將IPG干膠條從-20 ℃冰箱取出于室溫放置30 min，IPG膠條分別使用pH3-10和pH4-7兩種分離范圍，膠條長(zhǎng)度均為24 cm。取草魚(yú)鰓蛋白樣品，按照比例與水化上樣緩沖液(7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%(m/v) CHAPS、2%(v/v)IPG、40 mmol/L DTT)混勻，將高壓滅菌后干燥的濾紙小片置膠條槽兩極，搭建除鹽橋，從負(fù)極至正極方向線性加入樣品，膠條膠面朝下，覆蓋于樣品液上，膠條表面加入1.5 mL礦物油防止樣品水化過(guò)程中蒸發(fā)。等電聚焦電泳儀設(shè)置程序：溫度：17 ℃；最大電流：50 μA；膠條數(shù)：3 gel；等電聚焦程序見(jiàn)表1。

表1 等電聚焦電泳程序Tab.1 The electrophoresis parameter ofisoelectric focusing

1.5 膠條的平衡

等電聚焦程序結(jié)束后，將膠條放入含有SDS平衡緩沖液Ⅰ(6 mol/L尿素、75 mmol/L Tris-HCl pH8.8、29.3%(v/v)甘油、2%(w/v)SDS、1%溴酚藍(lán)儲(chǔ)備液、1%DTT)的平衡管內(nèi)，將其平放固定于脫色搖床上平衡14～15 min，一次平衡結(jié)束后，取出膠條于超純水沖洗膠條表面后放入含有平衡緩沖液Ⅱ(6 mol/L尿素、75 mmol/L Tris-HCl pH8.8、29.3%(v/v)甘油、2%(w/v)SDS、1%溴酚藍(lán)儲(chǔ)備液、2.5%碘乙酰胺)的平衡管中，進(jìn)行第二次平衡14～15 min。

1.6 SDS-PAGE垂直凝膠電泳(二向)

將平衡好的IPG膠條在1×電泳緩沖液中浸泡3 s，然后用鑷子把膠條轉(zhuǎn)移至凝膠上，用薄塑料板輕壓膠條使其充分接觸聚丙烯酰胺凝膠，加入含有溴酚藍(lán)的低熔點(diǎn)瓊脂糖密封液，保證膠條與凝膠之間沒(méi)有氣泡與縫隙，采用12.5%的均勻SDS-PAGE電泳分離膠進(jìn)行二向電泳，電泳參數(shù)為起始功率2 W/gel，45 min后升至17 W/gel，直至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部結(jié)束，運(yùn)行溫度設(shè)置為15 ℃。

1.7 染色

電泳結(jié)束后，從玻璃板中取出凝膠并對(duì)其進(jìn)行正負(fù)極標(biāo)記后，染色。

1.7.1 考馬斯亮藍(lán)G-250染色(每塊凝膠需250 mL)

①固定液(10%乙酸、40%乙醇)中固定至少30 min；②放入染色液(8%硫酸銨，0.8%磷酸，20%甲醇，0.08%考馬斯藍(lán)G-250)過(guò)夜；③用水不斷沖洗凝膠進(jìn)行脫色。

1.7.2 硝酸銀銀染(每塊凝膠需250 mL)

①固定(40%甲醇，10%乙酸)中固定30 min以上或者過(guò)夜；②水洗5 min；③30%乙醇洗2×20 min；④水洗6×5 min；⑤0.02%硫代硫酸鈉洗1 min；⑥水洗3×20 s；⑦染色液(0.2% AgNO3，0.02%甲醛)潤(rùn)洗去除殘留的硫代硫酸鈉，再加入足量染色液反應(yīng)20 min；⑧水洗3×20 s；⑨顯影液(3%Na2CO3，0.05%甲醛，0.000 5%Na2S2O3)潤(rùn)洗去除殘留的染色液后顯色；⑩終止(5%醋酸)5 min；水洗20 s將膠保存在蒸餾水中。

1.8 圖象掃描與軟件分析

用Bio-6000透射掃描儀(上海中晶科技有限公司)對(duì)凝膠進(jìn)行圖像掃描，掃描參數(shù)：分辨率：300 dpi，掃描模式為灰階、透射掃描。保存為T(mén)IF格式。用Image Master 2D Plattinum 7.0軟件(美國(guó)GE公司)對(duì)掃描圖像(每個(gè)樣品3次重復(fù))進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 不同裂解液配方和蛋白純化方法的2-DE圖譜

不同的裂解液配方對(duì)蛋白質(zhì)的溶解和提取效果存在顯著差異，為避免不必要的蛋白質(zhì)損失，減少人為修飾對(duì)蛋白質(zhì)的影響，降低樣品的離子強(qiáng)度，蛋白質(zhì)樣本的制備程序須通過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)才能摸索到最優(yōu)條件[18]。本實(shí)驗(yàn)采用2種不同的裂解液配方對(duì)蛋白的提取效果進(jìn)行了比較(如圖1)，蛋白純化方式均為丙酮沉淀法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：采用DTT取代Tris和TBP的裂解液Ⅱ的蛋白得率和條帶清晰度高于裂解液Ⅰ，可促進(jìn)蛋白的溶解。

有效的蛋白純化方法可以顯著提高雙向電泳圖譜的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)使用上述優(yōu)化所得的裂解液配方Ⅱ，對(duì)丙酮沉淀法和2D clean-up試劑盒法二種純化方式對(duì)雙向電泳圖譜的影響進(jìn)行比較。從圖2-a中可以看出，丙酮法純化蛋白質(zhì)所得的雙向電泳圖譜在偏中性區(qū)域內(nèi)存在一定的蛋白質(zhì)丟失且橫條紋稍多，蛋白點(diǎn)較少。利用Image Master 2D Platinum軟件分析圖像可獲得286個(gè)蛋白點(diǎn)。2D clean-up試劑盒法純化蛋白質(zhì)所得的雙向電泳圖譜上(圖2-b)蛋白點(diǎn)覆蓋范圍廣且分辨率高，在酸性端和中性端的蛋白點(diǎn)數(shù)量均有所增加，利用軟件分析獲得了418個(gè)蛋白點(diǎn)，相比于丙酮法增加了132個(gè)蛋白點(diǎn)，蛋白點(diǎn)分離明顯且恢復(fù)量較大。

(a)裂解液Ⅰ；(b)裂解液Ⅱ

(a)丙酮沉淀法；(b)2D clean-up試劑盒法

2.2 IPG膠條分離范圍的選擇

一向等電聚焦是根據(jù)被分離蛋白質(zhì)組分間的等電點(diǎn)差異來(lái)進(jìn)行，不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)以預(yù)制IPG膠條為載體遷移到其等電點(diǎn)(pI)的pH處。本研究采用最常用的pH 3～10和pH 4～7的IPG膠條(24 cm)對(duì)分離效果進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示(圖3)使用pH 3～10的膠條圖譜(圖3-a)分離效果不佳，在堿性區(qū)域蛋白點(diǎn)分布較少且水平拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，清晰可見(jiàn)的蛋白點(diǎn)不多；采用pH 4～7的IPG膠條圖譜(圖3-b)中蛋白點(diǎn)分布于整塊凝膠且清晰，橫條紋較少，蛋白質(zhì)被有效分離。

2.3 不同上樣量的優(yōu)化

在一向等電聚焦中的蛋白樣品上樣量是影響雙向電泳圖譜結(jié)果的重要因素。本實(shí)驗(yàn)比較了100、150、200 μg三種不同上樣量以獲得進(jìn)行雙向電泳的最佳上樣量，得到的雙向電泳圖譜如圖4(a)(b)(c)所示。結(jié)果顯示，當(dāng)上樣量為100 μg時(shí)，圖譜(圖4-a)上可以獲得清晰的蛋白點(diǎn)，拖尾現(xiàn)象不明顯，但蛋白點(diǎn)總體偏少。而上樣量為150 μg時(shí)，圖譜(圖4-b)上獲得的蛋白點(diǎn)多且清晰，邊界分明，橫條紋較少；上樣量為200 μg時(shí)，圖譜(圖4-c)上獲得的蛋白點(diǎn)多，但部分區(qū)域的蛋白點(diǎn)橫條紋較多，在酸性端和堿性端模糊不清，蛋白點(diǎn)分離效果不佳。

(a)pH3-10；(b)pH4-7

圖3 不同pH的IPG膠條所得的2-DE圖譜
Fig.3 The 2-DE map of different pH IPG strips

(a)100 μg;(b)150 μg;(c)200 μg

2.4 不同染色方法的影響

不同的雙向電泳凝膠染色方法對(duì)電泳圖譜分辨率有著很大的影響，圖譜分辨率的高低往往會(huì)干預(yù)后續(xù)蛋白點(diǎn)的分析與鑒定。本實(shí)驗(yàn)采用硝酸銀染色法(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“銀染”)和考馬斯亮藍(lán)G-250染色法(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“考染”)比較分析其對(duì)雙向電泳圖譜結(jié)果的影響。結(jié)果如圖5所示，考染圖譜(圖5-a)橫條紋較多，堿性端蛋白點(diǎn)較少，部分區(qū)域蛋白點(diǎn)沒(méi)有被清晰分離或顯色。多數(shù)低豐度蛋白點(diǎn)沒(méi)有被清晰分離或顯色；銀染圖譜(圖5-b)蛋白點(diǎn)較多且比較清晰，蛋白點(diǎn)與凝膠背景的對(duì)比性較高，能較完整地表明全蛋白信息。

(a)考染；(b)銀染

3 討論

建立一套有效的、可重復(fù)的樣品制備方法是雙向電泳成功的關(guān)鍵因素，也是獲得高質(zhì)量電泳參考圖譜的必要因素[18-19]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)向裂解液配方中添加DTT來(lái)取代Tris和TBP，獲得了蛋白得率和條帶清晰度高的圖譜。DTT作為還原劑可以裂解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的二硫鍵，使待分析的樣本蛋白處于完全還原狀態(tài)，使變性的蛋白質(zhì)完全伸展促進(jìn)溶解。在其他的裂解液固定成分中，尿素、硫脲、CHAPS、IPG buffer和三種蛋白酶抑制劑也起到很重要的作用，尿素和硫脲聯(lián)用打開(kāi)了蛋白的三維結(jié)構(gòu)，顯著增強(qiáng)裂解液的溶解能力；雙性離子去垢劑CHAPS可溶解膜蛋白，從而解除蛋白之間的相互作用，降低樣品的離子強(qiáng)度[14]。微量的IPG buffer加入有助于減少蛋白聚合的機(jī)率，增強(qiáng)蛋白質(zhì)基質(zhì)間的疏水作用，從而有助于蛋白充分溶解；蛋白酶、磷酸酶、PMSF為蛋白酶抑制劑，可抑制多種蛋白酶活性，防止蛋白質(zhì)降解，保持蛋白的完整性。

蛋白質(zhì)經(jīng)裂解液裂解后，若樣品未經(jīng)純化，其中的非蛋白質(zhì)類(lèi)雜質(zhì)會(huì)影響等電聚焦過(guò)程，使電壓無(wú)法升到最高值導(dǎo)致聚焦不完全，為防止蛋白樣品丟失，減少雜質(zhì)(如鹽、去污劑、核酸、脂類(lèi)等)殘留污染對(duì)等電聚焦過(guò)程的影響[20]，進(jìn)而獲得蛋白點(diǎn)清晰、分辨率高的雙向電泳參考圖譜，本實(shí)驗(yàn)對(duì)比分析了丙酮沉淀法和2D clean-up試劑盒法兩種蛋白純化方式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)丙酮沉淀法純化后的蛋白點(diǎn)數(shù)明顯減少，這與丙酮沉淀導(dǎo)致大量的蛋白質(zhì)丟失有關(guān)，且丙酮與試管具有一定的親和性，可能也會(huì)影響到本實(shí)驗(yàn)結(jié)果；而使用2D clean-up試劑盒純化后的蛋白點(diǎn)數(shù)明顯增加且分辨率高，這得益于其本身利用獨(dú)特的沉淀劑和輔助沉淀劑，能有效定量沉淀樣本蛋白質(zhì)，并將干擾物質(zhì)留在溶液中減少污染殘留，與其他純化方法比較，蛋白沉淀容易復(fù)溶，蛋白恢復(fù)量大，操作簡(jiǎn)單。據(jù)國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，Popovabutler等[21]對(duì)白紋伊蚊的刷狀緣膜囊泡蛋白的研究和Laz等[22]對(duì)小鼠肝臟蛋白的研究中，均采用2D clean-up試劑盒純化蛋白樣品，并獲得了高質(zhì)量的雙向電泳圖譜。

不同生物所含蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)也各不相同，選擇合適分離范圍的IPG膠條是有效分離蛋白質(zhì)的必要因素[23]。若IPG膠條的分離范圍選擇不合適，則會(huì)導(dǎo)致蛋白大量集中在某一區(qū)域而不易被分離，從而影響圖譜質(zhì)量。研究表明，生物中大多數(shù)蛋白的等電點(diǎn)介于pH4-8之間，使用pH3-10分離范圍的膠條適于顯示樣品中大部分的蛋白質(zhì)，但在電泳圖譜中間偏酸性端區(qū)域內(nèi)會(huì)有大量的蛋白點(diǎn)聚集，兩端的蛋白點(diǎn)偏少，使得中間蛋白點(diǎn)的分辨率較低[22]，這樣往往導(dǎo)致遺失具有重要生物功能的低豐度蛋白質(zhì)，相較于窄pH范圍的膠條雖然蛋白覆蓋率沒(méi)有寬膠條的廣，但可以得到相對(duì)分辨率高的蛋白質(zhì)點(diǎn)[24]。申欣等[9]對(duì)西施舌鰓蛋白和薛寶貴等[14]對(duì)大菱鲆表皮蛋白的研究中，均采用pH4-7的IPG膠條，所得的雙向電泳圖譜蛋白點(diǎn)清晰并且覆蓋范圍廣，最終分析得到的生物信息也比較完整。結(jié)合本研究的結(jié)果，應(yīng)進(jìn)一步使用窄pH值范圍膠條，以期能獲得草魚(yú)鰓蛋白最優(yōu)的雙向電泳圖譜。

蛋白樣品上樣量能較大程度上影響雙向電泳圖譜蛋白點(diǎn)數(shù)和質(zhì)量，是獲得樣本完整生物學(xué)信息的關(guān)鍵因素[25]。在蛋白上樣量較低情況下往往會(huì)檢測(cè)不到部分低豐度蛋白從而使蛋白點(diǎn)總體偏少，無(wú)法體現(xiàn)雙向電泳圖譜上的蛋白點(diǎn)完整性。在蛋白上樣量較高情況下雖有利于檢測(cè)到低豐度蛋白質(zhì)；但上樣量過(guò)多又會(huì)導(dǎo)致部分區(qū)域高豐度蛋白聚集或沉降，使得有些蛋白質(zhì)點(diǎn)分離效果不明顯，并且隨著上樣量的增加造成鹽離子濃度偏大，從而影響等電聚焦的過(guò)程，造成橫條紋和拖尾現(xiàn)象的出現(xiàn)[26]。因此需要找出最合適的蛋白樣品上樣量。本實(shí)驗(yàn)中蛋白樣品上樣量為150 μg時(shí)雙向電泳圖譜效果最佳，雖然蛋白點(diǎn)數(shù)與200 μg上樣量相比時(shí)較少，但蛋白點(diǎn)更加清晰且避免了高豐度蛋白的影響，更適合于雙向電泳圖譜的分析。劉志遠(yuǎn)等[12]在中國(guó)明對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)肌肉組織蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)體系的建立實(shí)驗(yàn)中采用17 cm，pH4-7的IPG膠條對(duì)三個(gè)不同的上樣量100 μg、120 μg、150 μg條件下的電泳情況進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)較高上樣量會(huì)使部分蛋白堆積，過(guò)低上樣量使得部分低分度蛋白消失，因此選擇上樣量為120 μg的電泳圖譜較好。與本實(shí)驗(yàn)相比過(guò)程相似，但具體的上樣量不同可能與實(shí)驗(yàn)對(duì)象和采用的膠條大小不同有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)中所采用的是24 cm的IPG膠條。

銀染和考染是2種常用的凝膠染色方法，不同的染色方法靈敏度具有一定的差異，將很大程度上影響蛋白點(diǎn)的分析和檢測(cè)[27]。就本實(shí)驗(yàn)兩種方法對(duì)比而言：考馬斯亮藍(lán)G-250染色法存在靈敏度低、染色時(shí)間長(zhǎng)、上樣量較多等缺點(diǎn)，并且上樣量增加將導(dǎo)致高豐度蛋白聚集而引起大量橫條紋；銀染法具有操作時(shí)間短、靈敏度高、背景清晰、橫條紋較少等優(yōu)點(diǎn)，總體上銀染效果優(yōu)于考染。秦慧等[28]對(duì)幾種雙向電泳凝膠染色方法進(jìn)行了比較，指出銀染的靈敏度高于考染，但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)考染方法在蛋白點(diǎn)質(zhì)譜鑒定方面兼容性比銀染高，因此后續(xù)進(jìn)行蛋白質(zhì)點(diǎn)的分析時(shí)應(yīng)選用銀染法，而在進(jìn)行質(zhì)譜鑒定時(shí)應(yīng)選用考染法。

本實(shí)驗(yàn)建立的草魚(yú)鰓組織蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)體系，相較于申欣等[9]建立的西施舌鰓蛋白質(zhì)組的雙向電泳體系，同樣對(duì)鰓組織蛋白質(zhì)的提取過(guò)程中裂解液成分、IPG膠條的分離范圍、染色方法進(jìn)行了優(yōu)化。但本實(shí)驗(yàn)增加了蛋白裂解后的純化過(guò)程來(lái)減少雜質(zhì)，以此保證蛋白質(zhì)的充分制備和良好的等電聚焦過(guò)程，優(yōu)化后選擇了易復(fù)溶，恢復(fù)量大，操作簡(jiǎn)單的2D clean-up試劑盒法，并對(duì)上樣量進(jìn)行了優(yōu)化，合適的上樣量可以獲得更優(yōu)的圖譜效果。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立的草魚(yú)鰓組織蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)體系：通過(guò)有較強(qiáng)裂解能力的蛋白樣品制備液[7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4%(w/v) CHAPS，2%(v/v)IPG buffer、40 mmol/L DTT和0.5%(v/v) 蛋白酶、磷酸酶、PMSF抑制劑]，結(jié)合2D clean-up試劑盒法提取草魚(yú)鰓蛋白，使用24 cm pH 4～7的固相IPG膠條進(jìn)行一向等電聚焦，主動(dòng)水化上樣150 μg，電泳結(jié)束后采用銀染并掃描獲取凝膠圖譜。通過(guò)以上各步驟的優(yōu)化，基本建立了草魚(yú)鰓組織蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)體系，該體系能夠有效將草魚(yú)鰓蛋白質(zhì)充分分離，獲得覆蓋范圍廣和分辨率高的雙向電泳圖譜，為后續(xù)草魚(yú)在抗病毒和低氧脅迫下鰓組織蛋白質(zhì)差異化分析研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。

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Establishmentandoptimizationof2-DEtechniqueingillproteinofCtenopharyngodonidella

XU Zhan-ning，LI Fu-gui，CHEN Jie，JIANG Xia-yun，ZOU Shu-ming

(KeyLaboratoryofGeneticResourcesforFreshwaterAquacultureandFisheries，ShanghaiOceanUniversity，Shanghai201306，China)

2017-05-18；

2017-08-03

“十二五”國(guó)家863計(jì)劃主題項(xiàng)目(2011AA100403)；上海高校知識(shí)服務(wù)平臺(tái)(ZF1206)

徐湛寧(1993- )，男，碩士研究生，專(zhuān)業(yè)方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物遺傳育種。E-mail：653054759@qq.com

鄒曙明。E-mail:smzou@shou.edu.cn

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