黃先菊，陳 慧，李 梅，伊雪佳，余 友

(中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢 430074)

基因芯片技術(shù)研究黃秦艽對雪上一枝蒿急性心臟毒性的作用機(jī)制

黃先菊，陳 慧，李 梅，伊雪佳，余 友

(中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢 430074)

目的：利用芯片技術(shù)探討黃秦艽對雪上一枝蒿所致小鼠心臟急性毒性基因表達(dá)的影響及分子機(jī)制. 方法：25只雄性昆明小鼠隨機(jī)分為正常對照組、雪上一枝蒿氯仿部位組(CFA)和黃秦艽水提物組(WVBF)，通過表達(dá)譜對各組心臟差異表達(dá)基因進(jìn)行生物信息學(xué)研究. 結(jié)果：WVBF對CFA誘導(dǎo)的急性心臟毒性具有明顯的解毒效果，染毒組與正常組相比，差異基因的功能主要涉及機(jī)體內(nèi)物質(zhì)的異常代謝，WVBF主要通過干擾CFA引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)及線粒體功能紊亂過程，提高細(xì)胞存活率，使心肌恢復(fù)正常功能. 結(jié)論：黃秦艽可以通過多條信號通路緩解雪上一枝蒿所致的小鼠心肌毒性作用.

雪上一枝蒿；黃秦艽；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；線粒體功能紊亂；基因表達(dá)；基因芯片

AbstractAim: To investigate the effect and mechanism ofVeratrillaBailloniion the acute cardiac toxicity and on gene expression in mice treated withAconitumBrachypodumby using gene chip technique. Methods: 25 male mice were divided randomly into control group, chloroform fraction ofAconitumBrachypodumDiels (CFA) group and water extract ofVeratrillaBaillonii(WVBF) group. Take mice hearts to study the expressions of various genes for bioinformatics research. Results: The results showed that WVBF had a significant detoxification effect on CFA-induced acute cardiac toxicity. Gene Ontology (GO) analysis mainly related to abnormal metabolism of the body. Pathway analysis showed that WVBF modulated the process of endoplasmic reticulum stress and mitochondrial dysfunction induced by CFA, thus improve cell survival rates and restore normal function to myocardium. Conclusions: WVBF could attenuate CFA-induced cardiac damage in mice through multiple signaling pathways.

KeywordsAconitumBrachypodum;VeratrillaBaillonii; endoplasmic reticulum stress; mitochondrial dysfunction; gene expression; gene chip

毛茛科烏頭屬植物雪上一枝蒿(AconitumBrachypodum)常被臨床用于治療疼痛和炎癥相關(guān)的疾病[1]. 因?yàn)檫^量或?yàn)E用導(dǎo)致中毒事件經(jīng)常發(fā)生[1, 2]，現(xiàn)有的臨床解毒策略不能完全消除烏頭類植物的毒性[3]. 因此，尋求烏頭堿中毒的解決辦法具有重大的現(xiàn)實(shí)意義.

黃秦艽(VeratrillaBailloniiFranch)為龍膽科黃秦艽屬植物，長期以來被云南當(dāng)?shù)丶{西族和傈僳族用于治療發(fā)熱、炎癥、胃痙攣和附子中毒[4, 5]. 本課題組前期研究表明, 黃秦艽水提物(WVBF)可以在一定程度上減弱雪上一枝蒿氯仿部位(CFA)誘發(fā)的小鼠急性毒性[6]. 本文擬利用基因芯片技術(shù)，進(jìn)一步探討WVBF對CFA誘導(dǎo)的急性心肌毒性的分子機(jī)制和分子靶標(biāo).

1 儀器和材料

雪上一枝蒿及黃秦艽干燥塊根購自云南省大理市中藥材批發(fā)市場，經(jīng)藥學(xué)院劉新橋老師鑒定為正品. 其提取辦法見本實(shí)驗(yàn)室前期工作[6]. 實(shí)驗(yàn)所用昆明雄性小鼠由湖北省疾病預(yù)防控制中心提供.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)

選擇體重18～22 g雄性昆明小鼠共25只，隨機(jī)分為正常對照組，CFA組，WVBF低、中、高3個劑量組各5只. 25只小鼠禁食不禁水12 h，20只小鼠以灌胃給藥方式給予30 mg/kg CFA，其余5只給予等劑量無菌水，3 min及30 min后WVBF組分別給予10、 25和50 mg/kg WVBF，正常對照組及CFA給予10 mL/kg無菌水. 4 h以后從空白對照組，CFA和WVBF(50 mg/kg)每組隨機(jī)采集3只心臟置于液氮中保存. CFA及WVBF提取分離過程參照本課題組前期工作[6].

2.2 RNA制備及芯片雜交

RNA制備及芯片雜交由伯豪公司完成. 采用RNeasy mini kit (QIAGEN, Germany)進(jìn)行總RNA抽提，再進(jìn)行樣品RNA的放大和標(biāo)記，芯片的雜交及掃描，所得數(shù)據(jù)經(jīng)歸一化處理后，運(yùn)用GeneSpring software in version 12.6 (Agilent)進(jìn)行分析，組間差異基因的表達(dá)運(yùn)用fold change (FC>|2|) andt檢驗(yàn) (p<0.05)進(jìn)行初步篩選，層次聚類分析運(yùn)用聚類分析軟件，差異基因基因功能(GO)分析及通路(KEGG)分析用SBC分析系統(tǒng)(SAS, http://www.ebioservice.com).

2.3實(shí)時熒光定量驗(yàn)證

引物設(shè)計及合成由上海生工公司完成(表1). 采用SYBR Green方法對目標(biāo)基因進(jìn)行實(shí)時熒光定量 PCR 驗(yàn)證. 反應(yīng)條件: 95 ℃變性5 s，60 ℃退火40 s，95 ℃擴(kuò)增30s，共40個循環(huán). 以管家基因GAPDH為參照基因，檢測各組樣品中RyR2和SERCA2a基因的表達(dá)水平. 利用2-△△CT 相對定量法計算各基因水平.

表1 合成引物序列

3 結(jié)果

3.1基因芯片數(shù)據(jù)分析

3.1.1 黃秦艽對雪上一枝蒿所致心臟芯片的基因表達(dá)影響

韋恩圖顯示，CFA與正常組相比共有6693個基因表達(dá)量發(fā)生明顯變化，3505個上調(diào)，3188個下調(diào). WVBF與CFA組相比共有9859個基因發(fā)生明顯變化，4386個基因上調(diào)，5473基因下調(diào). WVBF與正常組相比，共有5510個基因發(fā)生明顯變化，1879個基因上調(diào)，3631個基因下調(diào). 在給予WVBF后，CFA 與正常組間共同基因僅有2162(1554+608)個，初步說明WVBF對CFA誘導(dǎo)的差異基因的表達(dá)具有反向調(diào)控作用.

采用KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行差異表達(dá)基因的通路富集結(jié)果顯示，CFA參與調(diào)控的通路有98條，WVBF有114條，組間差異基因共有72條. CFA對心臟的毒性主要使機(jī)體內(nèi)碳、糖、脂肪酸代謝異常，導(dǎo)致心臟主要供能物質(zhì)枯竭，細(xì)胞壞死. CFA打亂體內(nèi)的氧化磷酸化過程，蛋白的轉(zhuǎn)錄翻譯過程，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激、線粒體功能紊亂，引起細(xì)胞凋亡. 而WVBF可通過對富集基因的反向調(diào)控，使機(jī)體能量代謝恢復(fù)正常，減弱應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，提高心肌細(xì)胞存活率，修復(fù)CFA引起的心臟結(jié)構(gòu)和機(jī)能的損傷(圖1).

3.1.2 黃秦艽解雪上一枝蒿急性心臟毒性的基因功能分析

Gene Ontology(GO)分析[7]對分子功能、細(xì)胞組分和生物過程差異表達(dá)基因所涉及的生理過程如圖2所示. WVBF、CFA與空白對照組3組組間差異表達(dá)基因主要富集的生理進(jìn)程基本相同，但CFA組經(jīng)過WVBF的處理以后，與空白對照組相比，差異基因在主要的生理學(xué)進(jìn)程中富集數(shù)減少，重要性也明顯減弱，GO分析可初步說明WVBF對CFA所誘導(dǎo)的小鼠急性心臟毒性具有一定的解毒作用.

卡羅爾(1979)提出了經(jīng)典的企業(yè)社會責(zé)任金字塔模型(Pyramid of Corporate Social Responsibility)，他把企業(yè)社會責(zé)任看作是一個結(jié)構(gòu)成分，關(guān)系到企業(yè)與社會關(guān)系的四個不同層面，即“企業(yè)社會責(zé)任包含了在特定時期內(nèi)，社會對經(jīng)濟(jì)組織經(jīng)濟(jì)上的、法律上的、倫理上的和慈善上的期望”。在這里，簡單借鑒卡羅爾的模型對案例企業(yè)的社會責(zé)任行為進(jìn)行歸納。

p<0.05及FDR<0.05作為組間通路篩選的閾值, 縱坐標(biāo)代表組間差異基因富集通路的種類，橫坐標(biāo)代表通路富集數(shù)取負(fù)對數(shù)的值圖1 差異基因所涉及的信號通路分析 Fig. 1 Pathway analysis of differentially expressed genes

p<0.05，F(xiàn)DR<0.05作為組間篩選的閾值圖2 差異基因所涉及的生物學(xué)進(jìn)程Fig. 2 GO category based on biological process for differentially expressed genes

3.2實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果分析

實(shí)時熒光定量PCR 結(jié)果表明(圖3)，CFA可以上調(diào)RyR2，下調(diào)ERCA2a，具有潛在的促進(jìn)鈣離子通道作用，高、低劑量的WVBF可以反向調(diào)節(jié)上述基因的變化，與芯片分析結(jié)果一致.

#p<0.05 vs空白對照組， *p<0.05, **p<0.01 vs模型對照組圖3 黃秦艽對雪上一枝蒿所致RyR2和SERCA2a基因的表達(dá)水平影響Fig. 3 The influence of WVBF on CFA induced RyR2 and SERCA2a gene levels

4 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃秦艽可通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)減弱雪上一枝蒿毒性反應(yīng)，具體的作用機(jī)制如下.

4.1內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激啟動的細(xì)胞凋亡通路

(1)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡包括非折疊蛋白反應(yīng)和鈣離子起始信號[8]. 通路分析結(jié)果顯示，CFA可激活肌醇酶1α(Ire1α)UPR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路. 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號出現(xiàn)時，分子伴侶蛋白Bip與非折疊結(jié)合而使蛋白復(fù)合物解體，導(dǎo)致Ire1α蛋白感受分子激活，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.

(2)鈣離子信號. CFA可破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而激活PI3K-Akt信號通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡. 激活MAPK信號通路，引起由Caspase3介導(dǎo)的凋亡過程. 激活Wnt-Ca2+信號通路，下調(diào)CAMK Ⅱ，引起鈣超載，并進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞凋亡.

CFA導(dǎo)致的機(jī)體內(nèi)氧化磷酸化過程的異常以及大量的Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中釋放，使線粒體大量釋放細(xì)胞色素c及ROS，引起CASP級聯(lián)反應(yīng)、細(xì)胞凋亡. 由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的鈣超載又可與細(xì)胞色素C協(xié)同使Caspase激活和細(xì)胞凋亡. WVBF可干擾促凋亡信使鈣離子偶聯(lián)ERS，并拮抗由線粒體功能紊亂及Caspase活化引起的凋亡反應(yīng).

4.3心肌功能損傷

CFA可干擾鈣離子穩(wěn)態(tài)，影響心臟的收縮功能并引發(fā)了心率不齊等一些毒副作用，還可促進(jìn)促炎因子釋放參與動脈粥樣硬化的形成與發(fā)展. WVBF可反向調(diào)節(jié)調(diào)肌鈣蛋白、肌球蛋白T及肌動蛋白的表達(dá)，恢復(fù)心肌正常的機(jī)能，減少毒副作用的發(fā)生.

另外，雪上一枝蒿對炎癥反應(yīng)具有雙向調(diào)控作用，既可以通過ERS誘發(fā)炎癥反應(yīng)發(fā)生，也可同時通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展，二者主要通過活性氧分子和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放的鈣離子、激活核轉(zhuǎn)錄因子，在抗炎方面具有協(xié)同作用.

綜上所述，黃秦艽主要通過干擾CFA引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)及線粒體功能紊亂過程，提高細(xì)胞存活率，使心肌恢復(fù)正常功能，從而緩解雪上一枝蒿誘導(dǎo)的急性心臟毒性. 與此同時，二者可通過多條信號通路作用產(chǎn)生協(xié)同抗炎作用.

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EffectsofVeratrillaBailloniiExtractonCardiacGeneExpressionProfilesinResponsetoAconitumBrachypodum-inducedCardiacToxicityinMice

HuangXianju,ChenHui,LiMei,YiXuejia,YuYou

(College of Pharmacy, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China)

Q786; R966

A

1672-4321(2017)03-0031-04

2017-03-29

黃先菊(1972-)，女，教授，研究方向：民族藥藥理與毒理，E-mail：xianju@mail.scuec.edu.cn

國家自然科學(xué)基金資助項目(81374064)