付小瓊，楊保新，楊付新，劉逢舉，劉媛，蔡家濱，彭軍*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南安陽455000；2.河北省邯鄲市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河北邯鄲056001；3.山東省德州市德城區(qū)農(nóng)業(yè)局，山東德州253000）

利用SSR分子標(biāo)記構(gòu)建邯棉559、邯棉802和邯鄲885的指紋圖譜

付小瓊1，楊保新2，楊付新1，劉逢舉1，劉媛1，蔡家濱3，彭軍1*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南安陽455000；2.河北省邯鄲市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河北邯鄲056001；3.山東省德州市德城區(qū)農(nóng)業(yè)局，山東德州253000）

為了保護(hù)國(guó)審品種邯棉559、邯棉802和河北省審定品種邯鄲885的品種權(quán)，減少棉種企業(yè)的經(jīng)營(yíng)風(fēng)險(xiǎn)，保障棉農(nóng)種上優(yōu)質(zhì)的棉花品種，選擇了44對(duì)SSR核心引物構(gòu)建邯棉559、邯棉802和邯鄲885的指紋圖譜。利用指紋圖譜檢測(cè)品種的真實(shí)性和純度。這44對(duì)核心引物多態(tài)性好，鑒別能力強(qiáng)，廣適性好。

邯棉 559；邯棉 802；邯鄲 885；SSR；指紋圖譜；純度

近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，各種作物均采用了SSR分子標(biāo)記構(gòu)建了DNA的指紋圖譜，許多育種家保護(hù)意識(shí)增強(qiáng)，在品種審定后構(gòu)建了指紋圖譜[1-6]。為保護(hù)育種者的品種權(quán)，保證品種的真實(shí)性和純度，利用SSR分子標(biāo)記構(gòu)建棉花品種指紋圖譜，用于品種的真實(shí)性和純度鑒定。

1 材料和方法

1.1 材料

邯棉559、邯棉802和邯鄲885均由邯鄲市農(nóng)業(yè)科學(xué)院育成，3個(gè)品種的種子均由邯鄲市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。邯棉559于2008年通過國(guó)家審定，為中熟常規(guī)抗蟲品種；邯棉802于2006年通過國(guó)家審定，為中早熟常規(guī)抗蟲品種；邯鄲885于2006年通過河北省審定，為中熟常規(guī)抗蟲品種。這3個(gè)品種綜合性狀好，纖維品質(zhì)均較優(yōu)，符合當(dāng)前對(duì)棉花纖維品質(zhì)的要求。

1.2 方法

1.2.1 引物合成與試劑來源。SSR引物由上海生工合成，Taq酶、dNTPs等購(gòu)自安陽科睿生物科技有限公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2.2 棉花基因組DNA的提取。2017年3月3個(gè)品種各取50粒種子置于生長(zhǎng)箱（30℃）內(nèi)發(fā)芽，發(fā)芽后7 d用子葉提取DNA。單株取樣，每個(gè)品種隨機(jī)取樣24株，用MM 301研磨儀進(jìn)行冷凍研磨，用CTAB法提取DNA[1]。

1.2.3 SSR-PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：模板DNA 1 μL， Buffer（含 MgCl2）1 μL，dNTPs（10mmol·L－1）0.3 μL，正引物（10 μmol·L－1）0.5 μL，反引物（10 μmol·L－1）0.5 μL，Taq 酶 （2.5 U·μL－1） 0.2 μL，ddH2O 6.5μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3min；94 ℃變性 30 s、56 ℃退火 45 s、72 ℃延伸 45 s，共30個(gè)循環(huán)；94℃變性 1m in、56℃退火 45 s、72℃延伸2m in；擴(kuò)增產(chǎn)物于4℃保存。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳。擴(kuò)增產(chǎn)物采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。每孔上樣2 μL，220 V 電壓 1.5 h。 固定 10m in，滲透 12min，顯色5m in，倒入終止液，終止反應(yīng)[7]。

1.2.5 讀帶方法。每對(duì)引物在棉花品種中驗(yàn)證均具有多態(tài)性，絕大部分為3種帶型，為了直觀表示，作者一般將同一引物擴(kuò)增圖譜中依最小擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量大小來分類，當(dāng)最小產(chǎn)物的分子量相同時(shí)以次二的分子量分類，依次類推。低分子量譜帶的類型定義為1，高分子量譜帶的類型定義為2，雜合共顯帶類型定義為3（圖1）。本文中不涉及雜合共顯帶，各品種均為常規(guī)棉，個(gè)別引物的帶型較為復(fù)雜，有三種以上的譜帶，在此依低分子量到高分子量分別編為1、2和3。把相應(yīng)的圖譜類型轉(zhuǎn)換成類似身份證號(hào)為獨(dú)一無二的編碼（表1）。用編碼來區(qū)分品種的差異，與傳統(tǒng)的有帶讀1、無帶讀0不同，讀法簡(jiǎn)便、快速[3]。

圖1 引物NAU2026在3個(gè)不同棉花品種中的擴(kuò)增圖譜

2 結(jié)果與分析

2.1 引物選擇

從本單位經(jīng)過大量棉花品種驗(yàn)證的190對(duì)SSR核心引物中，篩選出44對(duì)擴(kuò)增穩(wěn)定、條帶清晰、多態(tài)性好的引物用于構(gòu)建邯棉559、邯棉802和邯鄲885的指紋圖譜（表2）。

2.2 邯棉559、邯棉802和邯鄲885純度檢測(cè)結(jié)果

利用多態(tài)性好的10對(duì)引物對(duì)3個(gè)品種做SSR標(biāo)記純度的檢測(cè)。有1對(duì)以上引物的圖譜不同于其他植株，視為雜株；一致的植株數(shù)占總檢測(cè)株數(shù)的百分率為SSR標(biāo)記純度。3個(gè)品種純度均較好（表3，圖 2）。邯棉 559中有 1株雜株（圖 2A，2B），邯棉802中有2株雜株 （圖2C，2D），邯鄲885無雜株（圖 2E，2F）。

表1 邯棉559、邯棉802和邯鄲885對(duì)應(yīng)的44對(duì)核心引物的圖譜編碼

圖2 3個(gè)棉花品種的純度檢測(cè)

表3 邯棉559、邯棉802和邯鄲885的SSR純度檢測(cè)結(jié)果

2.3 邯棉559、邯棉802和邯鄲885的指紋圖譜構(gòu)建

在純度檢測(cè)的基礎(chǔ)上，每個(gè)品種去除雜株后選擇有代表性的2個(gè)單株，利用44對(duì)核心引物構(gòu)建指紋圖譜，各品種對(duì)應(yīng)的部分引物的圖譜見圖3。

圖3 邯棉559、邯棉802和邯鄲885的SSR擴(kuò)增圖譜

在44對(duì)核心引物中（表1），有 9對(duì)引物的擴(kuò)增條帶在邯棉559、邯棉802和邯鄲885品種間沒有區(qū)別；有2對(duì)引物3個(gè)品種間各不相同，表明這3個(gè)品種的親本有差異，用這2對(duì)引物能夠有效區(qū)分這3個(gè)品種。邯棉559和邯鄲885有23對(duì)引物擴(kuò)增的圖譜相同，相似度較大，這與2個(gè)品種均是以邯109為親本有關(guān)。而邯棉559和邯棉802有7對(duì)引物譜帶相同，邯棉802與邯鄲885僅有3對(duì)引物譜帶相同，差異較大，這可能是育種的親本差異大，且邯棉802為中早熟品種，另2個(gè)品種為中熟品種，不同的選擇方向?qū)е缕贩N間基因差異大。

3 討論與結(jié)論

經(jīng)多年國(guó)家級(jí)和省級(jí)棉花區(qū)試品種的室內(nèi)測(cè)定和田間比對(duì)，SSR標(biāo)記純度相對(duì)于田間純度要求更為嚴(yán)格導(dǎo)致純度偏低，這是因?yàn)橛袇^(qū)別的DNA區(qū)域可能為非編碼區(qū)域，與表觀性狀無關(guān)；或者有區(qū)別的DNA區(qū)域與內(nèi)在性狀有關(guān)而與表觀性狀無關(guān)等[8-11]。但SSR標(biāo)記純度與田間純度高度正相關(guān)，SSR標(biāo)記純度較好的品種，大田純度均較好；SSR標(biāo)記純度差的品種，田間純度肯定差。

利用44對(duì)核心引物構(gòu)建了邯棉559、邯棉802和邯鄲885的指紋圖譜：一方面有利于育種者品種權(quán)的保護(hù)，有利于棉農(nóng)種上真正的優(yōu)質(zhì)棉，保障棉農(nóng)的利益；另一方面有利于棉種企業(yè)控制種子質(zhì)量，減小經(jīng)營(yíng)風(fēng)險(xiǎn)。此外，利用這44對(duì)核心引物鑒別其他品種的效果也非常好[3]，在國(guó)家棉花區(qū)試和河南、河北省棉花區(qū)試參試品種的純度鑒定中應(yīng)用；因此，可以說這是1組廣適性的引物，可以用于其他棉花品種的指紋圖譜構(gòu)建和純度鑒定。一般的做法，純度鑒定應(yīng)用10～15對(duì)多態(tài)性引物，單株取樣，在純度鑒定的基礎(chǔ)上去雜選擇代表性植株做品種的指紋圖譜。指紋圖譜引物應(yīng)用較多，一般應(yīng)用40～50對(duì)多態(tài)性引物。在構(gòu)建指紋圖譜后鑒定真實(shí)性時(shí)應(yīng)用一些該品種的特異性引物就行，減少了工作量。

品種指紋圖譜的構(gòu)建，不僅有利于品種權(quán)的保護(hù)，還有利于分析不同品種的親緣關(guān)系，利用圖譜的相似度大小選擇育種親本的配制，合理利用品種資源。

[1]付小瓊，楊付新.利用SSR分子標(biāo)記鑒定中棉所63的真實(shí)性和純度[J].中國(guó)棉花，2016，43(2)：17-20.

[2]付小瓊，楊付新，王秀玲.利用SSR標(biāo)記鑒定中棉所72雜交種的純度和真實(shí)性[C]//中國(guó)棉花學(xué)會(huì).中國(guó)棉花學(xué)會(huì)2010年年會(huì)論文匯編.安陽：中國(guó)棉花雜志社，2010：128-130.

[3]付小瓊.2011年黃河流域棉花區(qū)試對(duì)照種的SSR指紋圖譜[J].中國(guó)棉花，2011，38(12)：29-32.

[4]馬雄風(fēng)，楊代剛，周曉箭，等.中棉所53的SSR指紋圖譜構(gòu)建與純度檢測(cè)[J].中國(guó)棉花，2011，38(7)：14-17.

[5]符家平，藍(lán)家樣，陳全求，等.利用SSR標(biāo)記構(gòu)建雜交棉EK288 的指紋圖譜[J].中國(guó)棉花，2011，38(3)：8-10.

[6]匡猛，王延琴，周大云，等.棉花DUS測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)品種的SSR 指紋數(shù)據(jù)庫構(gòu)建[J].棉花學(xué)報(bào)，2015，27(1)：46-52.

[7]張軍，武耀廷，郭旺珍，等.棉花微衛(wèi)星標(biāo)記的PAGE/銀染快速檢測(cè)[J].棉花學(xué)報(bào)，2000，12(5)：267-269

[8]周大云，楊偉華，魏守軍，等.棉種純度和真實(shí)性3種鑒定方法簡(jiǎn)介[J].中國(guó)棉花，2015，42(8)：5-7.

[9]張小娟，陸徐忠，何團(tuán)結(jié)，等.利用SSR分子標(biāo)記進(jìn)行棉花品種鑒定的研究[J].棉花學(xué)報(bào)，2014，26(6)：483-491.

[10]劉國(guó)棟，王芙蓉，宮永超，等.棉花品種遺傳純度的SSR分子標(biāo)記鑒定技術(shù)研究[J].棉花學(xué)報(bào)，2013，25(5)：382-387.

[11]吳會(huì)芳，強(qiáng)學(xué)杰，牛銀亭.SSR標(biāo)記技術(shù)在我國(guó)棉花遺傳育種中的研究進(jìn)展[J].中國(guó)棉花，2011，38(7)：9-11.●

DNA-SSR Markers Finger Print of Cotton Varieties of Hanmian 559,Hanmian 802 and Handan 885

Fu Xiaoqiong,Yang Baoxin,Yang Fuxin,Liu Fengju,Liu Yuan,Cai Jiabin,Peng Jun*

S562.035

A

1000-632X（2017）09-0008-05

10.11963/1000-632X.fxqpj.20170913

中國(guó)棉花·利用SSR分子標(biāo)記構(gòu)建邯棉559、邯棉802和邯鄲885的指紋圖譜·2017，44（9）：8－12

2017-04-29

*通信作者：彭軍，jun_peng@126.com

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)基金（1610162016018）