翦秋麗, 蔣麗剛, 嚴(yán)江燕, 陳海敏

(1. 寧波大學(xué) 浙江省海洋生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 寧波 315211； 2. 珀萊雅化妝品股份有限公司, 杭州 310012)

紅藻糖苷抑制黑色素形成的作用研究

翦秋麗1, 蔣麗剛2, 嚴(yán)江燕1, 陳海敏1

(1. 寧波大學(xué) 浙江省海洋生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 寧波 315211； 2. 珀萊雅化妝品股份有限公司, 杭州 310012)

探索紅藻糖苷對(duì)生物體黑色素產(chǎn)生的抑制作用。利用黑素瘤細(xì)胞B16-F0評(píng)價(jià)紅藻糖苷對(duì)細(xì)胞合成黑色素的影響；從抑制酪氨酸酶酶活角度研究其抑制機(jī)理。研究顯示，紅藻糖苷對(duì)黑素瘤細(xì)胞無(wú)明顯細(xì)胞毒性，但呈濃度依賴性抑制細(xì)胞黑色素產(chǎn)生。紅藻糖苷對(duì)酪氨酸酶的單酚酶和二酚酶活性都有抑制作用，單酚酶的IC50為89 mmol/L；對(duì)二酚酶的抑制為可逆競(jìng)爭(zhēng)性抑制，Ki為16.44 mmol/L?？梢?jiàn)，紅藻糖苷具有抑制細(xì)胞生成黑色素的能力，其機(jī)理與抑制酪氨酸酶活性有關(guān)。

紅藻糖苷；黑色素；酪氨酸酶；抑制

AbstractTo study the inhibitory effect of floridoside in red algae on the generation of melanin, the B16-F0 melanoma cells were used to evaluate the ability of floridoside on the biosynthesis of melanin. The effect of floridoside on the activity of tyrosinase was also detected for investigating the mechanism. Results indicated that floridoside showed no obvious toxicity to B16-F0 melanoma cells, but suppressed melanogenesis with the concentration dependence manner. Floridoside was discovered to inhibit both the monophenolase and the o-diphenolase activities. It influenced the steady state of monophenolase activity and IC50was 89 mmol/L. The inhibition on o-diphenolase activity was in a concentration dependent manner, and 40 mmol/L floridoside reduced the steady state activity for 33.08%. The inhibition kinetics analyzed by Lineweaver-Burk plots showed that floridoside was a reversible competitive inhibitor, and the inhibition constant was determined to be 16.44 mmol/L for the free enzyme. In general, floridoside was potential to suppress the generation of melanin, and the mechanism was to inhibit the activity of tyrosinase, especially the activity of o-diphenolase.

Keywordsfloridoside; melanin; tyrosinase; inhibition

酪氨酸酶是一種存在于人體中的含銅多酚氧化酶，是黑色素合成中的關(guān)鍵酶[1]。酪氨酸酶的異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致人體色素的沉著，產(chǎn)生如黃褐斑、雀斑和老年斑等問(wèn)題，且與大腦中的神經(jīng)黑色素形成及帕金森病有關(guān)[2]。因此，酪氨酸酶抑制劑的開(kāi)發(fā)引起了廣泛重視。近年來(lái)報(bào)道的一些抑制劑，如熊果甙[3]、VC衍生物[4]、曲酸[5]和中藥萃取物[6]等已開(kāi)發(fā)成為化妝品添加劑。而隨著藥妝品市場(chǎng)的發(fā)展，海洋天然產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)更受關(guān)注。

紅藻糖苷(α-氧-甘油-α-D-半乳吡喃糖苷)是紅藻中主要的光合可溶物質(zhì)，在藻體內(nèi)是重要的滲透壓調(diào)節(jié)劑[7]，且紅藻糖苷還具有很多生物活性，如調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗氧化等[8-9]。但國(guó)內(nèi)外關(guān)于紅藻糖苷抑制黑色素形成的研究未見(jiàn)報(bào)道。因此，本文以B16-F0 黑素瘤細(xì)胞為模型，研究紅藻糖苷對(duì)B16-F0 合成黑色素的影響，并從酪氨酸酶抑制的角度研究其作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

紅藻糖苷，以壇紫菜為原料制備(自制)，制備及分析方法參考文獻(xiàn)[10]，純度≥95%。B16-F0黑素瘤細(xì)胞購(gòu)自CCTCC(武漢，中國(guó))；酪氨酸酶、L-3,4二羥基苯丙氨酸(L-DOPA)及L-酪氨酸等購(gòu)于Sigma公司。

1.2 黑色素細(xì)胞增殖抑制率測(cè)定

將B16-F0黑素瘤細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的MEM培養(yǎng)液中(37℃，5%CO2)。細(xì)胞毒測(cè)定采用四甲基偶氮唑藍(lán)比色法(MTT法)。黑素瘤細(xì)胞存活率(%)=(樣品平均吸光度值/空白組平均吸光度值)×100%。

1.3 黑色素抑制測(cè)定

將B16-F0細(xì)胞以105個(gè)/mL的密度接種于6孔板，培養(yǎng)12 h后加入不同濃度紅藻糖苷或0.3 mmol/L曲酸作為陽(yáng)性對(duì)照，3 d后，PBS洗滌，加入1 mL細(xì)胞裂解液，3000 r/min離心10 min后，棄上清，加含10% DMSO的1 mol/L NaOH溶液1 mL， 80℃溶解黑素顆粒，于475 nm下測(cè)吸光值[11]。

黑素合成抑制率(%)=[1-(樣品孔吸光度值/樣品孔細(xì)胞密度)/(空白孔吸光度值÷空白孔細(xì)胞密度)]×100%

1.4 酪氨酸單酚酶和雙酚酶活力測(cè)定

在含0.02 mol/L磷酸緩沖液(pH 6.8)的體系中加入不同濃度的紅藻糖苷，再加入底物，30℃保溫5 min后加入酪氨酸酶溶液，振蕩混勻，在30℃下測(cè)定475 nm的吸光值。單酚酶活力所用底物為2 mmol/L酪氨酸。二酚酶底物為1 mmol/LL-DOPA。檢測(cè)吸光值隨時(shí)間增長(zhǎng)曲線的斜率得到酶活力，消光系數(shù)為ε=3700(mol/L·cm)-1。酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)通過(guò)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖得到，包括表觀米氏常數(shù)(Km)和最大反應(yīng)速度(Vm)[12]。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果

2.1 紅藻糖苷對(duì)黑色素瘤細(xì)胞合成黑色素的能力影響

首先對(duì)紅藻糖苷的細(xì)胞毒性進(jìn)行了檢測(cè)，從結(jié)果看，紅藻糖苷在檢測(cè)濃度范圍內(nèi)對(duì)B16-F0黑素瘤細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性。如濃度為2.4 mmol/L時(shí)，存活率在97%以上；而當(dāng)濃度達(dá)到4 mmol/L時(shí)，存活率則有(103.30±3.85)%，見(jiàn)圖1。

隨后檢測(cè)了紅藻糖苷對(duì)B16-F0 細(xì)胞黑色素合成的抑制作用。圖2顯示，紅藻糖苷呈濃度依賴性地抑制黑色素合成，濃度達(dá)到0.8 mmol/L后黑色素產(chǎn)生明顯減少(P<0.05)，當(dāng)濃度為3.0 mmol/L時(shí)，抑制率為37.71%(P<0.01)。而0.3 mmol/L曲酸的抑制率為47.58%(P<0.01)。

圖1 紅藻糖苷對(duì)B16-F0 細(xì)胞的存活率的影響

圖2 紅藻糖苷對(duì)B16-F0 細(xì)胞內(nèi)黑色素生成的抑制

2.2 紅藻糖苷對(duì)酪氨酸酶單酚酶活力的影響

圖3-A中的曲線1為酪氨酸酶在不含紅藻糖苷時(shí)的單酚酶進(jìn)行曲線，開(kāi)始時(shí)的產(chǎn)物形成量呈緩慢上升趨勢(shì)，一定時(shí)間后則直線上升，反應(yīng)體系達(dá)到恒定的斜率，說(shuō)明反應(yīng)達(dá)到了穩(wěn)定態(tài)，而直線部分的斜率即為該酶的穩(wěn)態(tài)活力。隨著紅藻糖苷濃度的增大，酪氨酸酶的穩(wěn)態(tài)活力逐漸下降(圖3-B)，其IC50為89 mmol/L，100 mmol/L的紅藻糖苷使酶活力下降了57.15%。

圖3 紅藻糖苷對(duì)酪氨酸單酚酶進(jìn)程曲線的影響

A：反應(yīng)的進(jìn)程曲線(曲線1-6的紅藻糖苷濃度分別為0、20、40、60、80和100 mmol/L)；B：穩(wěn)態(tài)酶活力曲線

2.3 紅藻糖苷對(duì)酪氨酸酶二酚酶活力的影響

酪氨酸酶催化L-DOPA氧化的反應(yīng)曲線見(jiàn)圖4。加入紅藻糖苷后，直線的斜率呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明紅藻糖苷對(duì)酪氨酸酶的二酚酶活力具有抑制作用。隨抑制劑濃度增大，酶活力下降，40 mmol/L紅藻糖苷可以使酶的穩(wěn)態(tài)活力下降33.08%。

隨后，固定L-DOPA濃度為1.0 mmol/L，改變加入的酶量，研究紅藻糖苷對(duì)酶量與酶活力關(guān)系的效應(yīng)。圖5表明，直線斜率隨紅藻糖苷濃度的增大而下降，說(shuō)明紅藻糖苷對(duì)酪氨酸二酚酶的抑制作用是可逆的，紅藻糖苷能通過(guò)抑制酪氨酸酶活，而不是降低酶量來(lái)使催化效率下降。

圖4 紅藻糖苷對(duì)酪氨酸酶二酚酶活力的影響

圖5 紅藻糖苷對(duì)酪氨酸酶抑制機(jī)理的判斷

直線0～4分別代表濃度為0、2、4、6和8 mmol/L

2.4 紅藻糖苷對(duì)酪氨酸酶二酚酶的抑制類型及抑制常數(shù)的測(cè)定

進(jìn)一步研究了紅藻糖苷對(duì)酪氨酸酶二酚酶的抑制作用，通過(guò)固定酶濃度，改變底物L(fēng)-DOPA的濃度，來(lái)測(cè)定不同濃度紅藻糖苷對(duì)酶活力的影響，以Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖(圖6)，得到縱軸截距不變的一組直線，結(jié)果顯示，紅藻糖苷未改變酶促反應(yīng)的最大反應(yīng)速度(Vmax)，僅影響到米氏常數(shù)(Km)，發(fā)現(xiàn)Km隨紅藻糖苷濃度的增大而增大，表現(xiàn)出競(jìng)爭(zhēng)性抑制方式。以不同濃度紅藻糖苷下測(cè)到的Km對(duì)抑制濃度作圖(圖6內(nèi)插圖)，形成一條直線，從直線的斜率求得抑制常數(shù)為16.44 mmol/L。

圖6 紅藻糖苷對(duì)酪氨酸酶的抑制類型和抑制常數(shù)

直線0～4分別代表濃度為0、2、4、6和8 mmol/L

3 討論

在黑色素的生物合成中酪氨酸酶扮演了重要的角色[1]，通過(guò)對(duì)酪氨酸酶的抑制，可以減少黑色素產(chǎn)生，作為化妝品添加劑開(kāi)發(fā)，可以達(dá)到美白效果。目前已應(yīng)用于化妝品的酪氨酸酶抑制劑有VC衍生物、中藥提取液、曲酸等，這些物質(zhì)會(huì)存在不穩(wěn)定、皮膚刺激、易變質(zhì)等問(wèn)題。宋康康等[3]曾報(bào)道了一種天然葡萄糖苷——熊果苷，具有良好的酪氨酸酶抑制作用，目前已在日本被用于化妝品的美白添加劑；章思思等[13]也報(bào)道，氨基葡萄糖有良好的酪氨酸酶抑制作用。有報(bào)道指出，羥基類化合物對(duì)酪氨酸酶有抑制作用[1]，由于糖苷類物質(zhì)是多羥基化合物，說(shuō)明這類物質(zhì)很可能是繼酚類、芪類、黃酮等外的新型、低副作用的酪氨酸酶抑制劑結(jié)構(gòu)類型。

紅藻糖苷來(lái)源于海洋紅藻，含量非常高，在藻體中達(dá)到1.5%～8%，資源豐富[14]。有報(bào)道指出，紅藻糖苷還具有保水、保濕和抗氧化等多種功效[8-9]，法國(guó)LVMH集團(tuán)旗下嬌韻詩(shī)護(hù)膚品中的水潤(rùn)活肌保濕精華、紀(jì)梵希全新水漾活妍眼霜以及Thetsaio的珊瑚草柔敏抗氧化甘露等產(chǎn)品中都含有紅藻糖苷。而酪氨酸酶抑制效果的發(fā)現(xiàn)，將能為其在化妝品中的應(yīng)用增加新的功效。

本研究顯示，紅藻糖苷對(duì)B16-F0 黑素瘤細(xì)胞毒性不強(qiáng)，卻能有效抑制該細(xì)胞合成黑色素。從酶活抑制的效果來(lái)看，紅藻糖苷對(duì)酪氨酸酶的單酚和二酚酶活性都有作用，但并沒(méi)有明顯延長(zhǎng)單酚酶的遲滯時(shí)間，這與熊果苷、甲基水楊醛等物質(zhì)的抑制效果不同。但紅藻糖苷對(duì)酪氨酸雙酚酶的抑制效果卻強(qiáng)于單酚酶，并且表現(xiàn)出競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，說(shuō)明紅藻糖苷能夠作為底物類似物與酶活性中心競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，抑制酶活性，從而達(dá)到減少黑色素合成的目的。

綜上所述，紅藻糖苷能夠通過(guò)抑制酪氨酸酶活，特別是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制酪氨酸二酚酶活性，達(dá)到抑制細(xì)胞黑色素合成的作用。

[1]陳清西, 宋康康. 酪氨酸酶的研究進(jìn)展[J]. 廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2006, 45(5):731-737.

[2]XU Y, STOKES A H, FREEMAN W M, et al. Tyrosine mRNA is expressed in human substantia nigra [J]. Molecular Brain Research, 1997, 45(1): 159-162.

[3]宋康康, 邱 凌, 黃 璜,等. 熊果甙作為化妝品添加劑對(duì)酪氨酸酶抑制作用[J]. 廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2003, 42(6):791-794.

[4]王白強(qiáng), 曾曉軍. 酪氨酸酶活性的抑制研究及皮膚美白化妝品的研制[J]. 福建輕紡, 2002(7):1-6.

[5]黃 璜, 宋康康, 陳清西. 曲酸作為化妝品添加劑的增白作用機(jī)理研究[J]. 廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2003, 42(5):652-656.

[6]韓 強(qiáng), 林惠芬, 朱玲莉. 幾種中藥提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制[J]. 香料香精化妝品, 1998(4):22-24.

[7]KARSTEN U, RS S, EGGERT A, et al. Trehalose, digeneaside, and floridoside in the Florideophyceae (Rhodophyta)-a reevaluation of its chemotaxonomic value [J]. Phycologia, 2007, 46(46): 143-150.

[8]LI Y X, LI Y, LEE S H, et al. Inhibitors of oxidation and matrix metalloproteinases, floridoside, and D-isofloridoside from marine red algaLaurenciaundulata[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 58(1): 578-586.

[9]COURTOS A, SIMON-COLIN C, BOISSET C, et al. Floridoside extracted from the red algaMastocarpusstellatusis a potent activator of the classical complement pathway [J]. Marine Drugs, 2008, 6(3): 407-417.

[10]CHEN J, SONG D, LUO Q, et al. Determination of floridoside and isofloridoside in red algae by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry [J]. Analytical Letters, 2014, 47(14): 2307-2316.

[11]WALKER J R L, WILSON E L. Studies on the enzymic browning of apples. Inhibition of apple O-diphenol oxidase by phenolic acids [J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1975, 26(12): 1825-1831.

[12]QIU L, CHEN Q X, WANG Q, et al. Irreversibly inhibitory kinetics of 3,5-dihydroxyphenyl decanoate on mushroom (Agaricusbisporus) tyrosinase [J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2005, 13(22): 6206-6211.

[13]章思思, 劉必謙, 周湘池,等. 氨基葡萄糖對(duì)酪氨酸酶的抑制作用[J]. 生物學(xué)雜志, 2014, 31(4):99-102.

[14]紀(jì)明侯. 海藻化學(xué)(2版)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2004: 197-200.

Suppression of melanin formation by floridoside

JIAN Qiu-li1, JIANG Li-gang2, YAN Jiang-yan1, CHEN Hai-min1

(1. Key Laboratory of Marine Bioengineering of Zhejiang, Ningbo University, Ningbo 315211; 2. PROYA Companies, Hangzhou 310012, China)

R285

A

2095-1736(2017)05-0039-04

2016-09-26；

2016-11-14

國(guó)家海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201505033)；寧波市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2017C110026)

翦秋麗，碩士研究生，主要研究方向?yàn)楹Ｑ笊?，E-mail:1462746181@qq.com

陳海敏，研究員，主要研究方向?yàn)楹Ｑ笊铮珽-mail: chenhaimin@nbu.edu.cn

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.05.039