張 超 蕾， 張 素 芳， 劉 冰 南， 王 際 輝

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034；2.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所 生物技術(shù)部， 遼寧 大連 116023 )

圓紅冬孢酵母類(lèi)胡蘿卜素合成突變菌株的篩選

張 超 蕾1,2， 張 素 芳2， 劉 冰 南1， 王 際 輝1

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034；2.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所 生物技術(shù)部， 遼寧 大連 116023 )

利用等離子體誘變與亞硝基胍誘變的方法，構(gòu)建油脂合成缺陷型菌株或類(lèi)胡蘿卜素合成突變菌株。通過(guò)乙酰輔酶A流量的分配，驗(yàn)證油脂合成途徑是否為乙酰輔酶A節(jié)點(diǎn)處優(yōu)勢(shì)分支途徑。利用等離子體與亞硝基胍進(jìn)行復(fù)合誘變，等離子體誘變的致死率為95%，亞硝基胍誘變的致死率為90%時(shí)，篩選得到圓紅冬孢酵母顏色突變株XP-1、XO-3、XY-4和XR-2。突變株的油脂含量、脂肪酸的成分和類(lèi)胡蘿卜素的含量測(cè)定結(jié)果顯示，XP-1、XO-3、XY-4等3個(gè)菌株的類(lèi)胡蘿卜含量低于出發(fā)菌株NP11，類(lèi)胡蘿卜素的代謝途徑受到一定破壞，但類(lèi)胡蘿卜素的降低并沒(méi)有促進(jìn)油脂合成的增加。XR-2菌株的油脂含量下降，類(lèi)胡蘿卜素含量相應(yīng)升高，最高達(dá)到0.77 μg/g。結(jié)果表明，乙酰輔酶A是一個(gè)弱剛性節(jié)點(diǎn)，油脂合成途徑為此節(jié)點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)分支途徑，其產(chǎn)物的減少可有效增加類(lèi)胡蘿卜素合成的增加。

圓紅冬孢酵母；等離子誘變；亞硝基胍誘變；油脂；類(lèi)胡蘿卜素；弱剛性節(jié)點(diǎn)

Abstract: A mutant strain of oil synthesis, defective strain or carotenoid was constructed by mutagenesis of plasma and guanidine. It is determined that the pathway of lipid synthesis is the dominant branching pathway of acetyl coenzyme A node through the distribution of acetyl coenzyme A flux.Compound mutagenesis was carried out using plasma and nitroso guanidine. XP-1, XO-3, XY-4 and XR-2 mutants were screened out through ARTP and NTG mutagenesis with 95% and 90% lethal rate. The ability of producing lipid,composition of fatty acid and content of carotenoid determination results showed that the carotenoid contents of XP-1, XO-3, XY-4 and other three strains were lower than that in strain NP11, the metabolic pathway of carotenoids have been destroyed, but the decreasing of carotenoid could not promote the increasing of lipid synthesis. The carotenoid content increased with the decreasing of lipid content in strain XR-2, which could reached to 0.77 μg/g. The results indicated that acetyle-CoA is a weakly rigid node, and the pathway of lipid synthesis is the dominant branch of the pathway. The reduction of its products can increase the production of carotenoid synthesis.

Keywords:Rhodosporidiumtoruloides; plasma mutation; nitrosoguanidine mutation; lipid; carotenoid; weakly rigid node

0 引 言

在代謝工程中，把弱剛性節(jié)點(diǎn)處占主導(dǎo)地位的分支途徑稱為優(yōu)勢(shì)分支途徑，其他分支則稱為從屬分支[1-2]。阻斷從屬分支途徑，優(yōu)勢(shì)途徑的末端產(chǎn)物含量也常無(wú)顯著增加[3-4]。反之，如果要增加從屬分支途徑產(chǎn)物的產(chǎn)率，則必須通過(guò)弱化優(yōu)勢(shì)分支途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)。圓紅冬孢酵母中，乙酰輔酶A作為關(guān)鍵代謝節(jié)點(diǎn)，是油脂合成與萜類(lèi)化合物合成的共同前體[5-6]。在限氮的條件下，乙酰輔酶A更多的流向油脂合成的分支途徑，只有少部分流向類(lèi)胡蘿卜素合成途徑[7-8]。受限于遺傳操作，產(chǎn)油酵母中油脂合成途徑是否為乙酰輔酶A代謝節(jié)點(diǎn)處的優(yōu)勢(shì)分支途徑，萜類(lèi)合成途徑是否為從屬分支途徑，一直沒(méi)有確切定論。

由于類(lèi)胡蘿卜素含量變化會(huì)導(dǎo)致菌株顏色差異，本實(shí)驗(yàn)綜合利用等離子誘變與亞硝基胍兩種誘變方法[9-10]，對(duì)菌株進(jìn)行快速誘變，并高通量篩選顏色突變菌株，分析突變菌株的油脂含量、脂肪酸成分和類(lèi)胡蘿卜素含量，以期判斷油脂合成途徑是否為乙酰輔酶A節(jié)點(diǎn)處的優(yōu)勢(shì)分支途徑。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 體

圓紅冬孢酵母單倍體(Rhodosporidiumtoruloides)菌株 NP11，由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保藏在4 ℃ YEPD斜面。

1.1.2 培養(yǎng)基

YEPD培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母粉10；pH 6.0。

限氮培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 50，硫酸銨 0.1，酵母粉 0.75，KH2PO40.4，MgSO4·7H2O 1.5；pH 6.0。補(bǔ)加10 mL痕量元素溶液，每升痕量元素溶液包含：CaCl2·2H2O 4.0 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.55 g，ZnSO4·7H2O 0.10 g，MnSO4·H2O 0.076 g，18 mol/L H2SO4100 μL。

1.1.3 主要試劑

亞硝基胍(NTG)，Sigma公司；酵母粉、蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 方 法

1.2.1 亞硝基胍誘變與等離子體誘變

1.2.1.1 亞硝基胍誘變致死率曲線

取對(duì)數(shù)期時(shí)的圓紅冬孢酵母菌液4.5 mL，用無(wú)菌水洗滌2次。離心后加入pH 6的磷酸鉀緩沖溶液4.5 mL，取5 mg的NTG溶于少量的丙酮溶液中，加入磷酸鉀緩沖溶液至1 mL，配制成NTG溶液。取4.5 mL菌體加入0.5 mL的NTG，使NTG的終濃度為500 μg/mL，處理時(shí)間分別為15、30、45、60 min，用硫代硫酸鈉終止反應(yīng)，再用無(wú)菌水洗滌2遍后，稀釋涂于YEPD培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.1.2 等離子體誘變致死率曲線

采用無(wú)錫思清源生物科技生產(chǎn)的常壓室溫等離子體進(jìn)行誘變。誘變過(guò)程：用對(duì)數(shù)期的菌體進(jìn)行誘變。取10 μL菌懸液均勻涂于10 mm錠子上，進(jìn)行等離子體誘變。對(duì)誘變的儀器進(jìn)行參數(shù)設(shè)置。誘變的氣體主要為He，距離2 mm，功率115 W，體積流量12 L/min，時(shí)間分別為20、30、40、50、60、70、90 s。根據(jù)存活的菌體數(shù)目計(jì)算致死率曲線。

1.2.2 突變株的篩選

將NP11培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，先經(jīng)過(guò)亞硝基胍處理，再進(jìn)行等離子體誘變。將處理后的菌體在YEPD中培養(yǎng)6 h。將菌液適當(dāng)稀釋后涂于YEPD平板上，挑選出不同顏色的表型突變菌株。

1.2.3 細(xì)胞生物量測(cè)定

取30 mL菌液，6 000g離心收集細(xì)胞后用等體積蒸餾水洗滌2次，濕細(xì)胞于105 ℃烘至恒重，以g/L表示細(xì)胞生物量。

1.2.4 油脂抽提

將發(fā)酵14 d的菌液6 000g離心5 min，細(xì)胞用蒸餾水洗滌2次，用酸熱法提取[11]。按每克濕細(xì)胞加10 mL 4 mol/L HCl，于78 ℃水浴處理1.5 h，冷卻后，加入10 mL甲醇振蕩2 min。甲醇與氯仿按體積比1∶1加入10 mL氯仿，收集氯仿層，再加入10 mL氯仿振蕩2 min，6 000g離心5 min，收集氯仿層，合并氯仿液，加入等體積的0.1% NaCl溶液，無(wú)水Na2SO4過(guò)濾，用已知質(zhì)量的接收瓶收集氯仿層，再用氯仿沖洗3次，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸去氯仿，于105 ℃烘干2 h，冷卻后稱重。

1.2.5 殘?zhí)橇繙y(cè)定

采用山東省科學(xué)院生產(chǎn)的SBA-40B生物傳感分析儀進(jìn)行葡萄糖測(cè)定，檢測(cè)范圍在0～1.0 g/L。

1.2.6 脂肪酸組成分析

按文獻(xiàn)方法[12]對(duì)菌油脂肪酸進(jìn)行甲酯化，準(zhǔn)確稱取70 mg油脂，加入5% KOH/CH3OH溶液0.5 mL，70 ℃回流50 min。加入BF3的甲醇溶液0.7 mL，繼續(xù)回流10 min。冷卻后加入少量正己烷，再加入適量蒸餾水，使脂肪酸甲酯被萃取進(jìn)入正己烷層，正己烷層經(jīng)洗滌后作為氣相色譜的進(jìn)樣樣品。

用7890F氣相色譜儀對(duì)脂肪酸成分進(jìn)行分析，色譜條件：FFAP石英毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×0.4 μm)，進(jìn)樣量0.5 μL，進(jìn)樣器溫度250 ℃，檢測(cè)器(FID)溫度280 ℃，柱溫200 ℃。脂肪酸通過(guò)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)樣品定性，用面積歸一法確定相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)[13]。

1.2.7 類(lèi)胡蘿卜素的提取

測(cè)量菌體干重。測(cè)量細(xì)胞內(nèi)類(lèi)胡蘿卜素含量。取2 mL發(fā)酵液，加入3 mol/L鹽酸300 μL，沸水浴3 min，冰水浴3 min，8 000 r/min離心5 min，加入300 μL丙酮振蕩混勻，取上清液。該過(guò)程重復(fù)3次，至菌體顏色變白，收集上清。向丙酮溶液中加入500 μL石油醚和200 μL飽和食鹽水，振蕩混勻浸提。8 000 r/min離心5 min，小心轉(zhuǎn)移上清至2 mL離心管，在450 nm處測(cè)定吸光度[14]。采用下面的公式進(jìn)行計(jì)算：

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 亞硝基胍誘變與等離子誘變

2.1.1 亞硝基胍誘變致死率曲線

如圖2所示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)死亡率逐漸升高，當(dāng)NTG的誘變時(shí)間為60 min時(shí)，菌株的死亡率為100%。所以選擇45 min作為誘變時(shí)間，菌株的死亡率達(dá)到93%。

圖1 NTG誘變下的致死率曲線Fig.1 The death rate curve of NTG

2.1.2 等離子體誘變致死率曲線

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌液進(jìn)行等離子體誘變，分別誘變20、30、40、50、60、70、90 s。如圖3所示，對(duì)菌株誘變70 s，菌體的致死率達(dá)到95%；對(duì)菌株誘變90 s，菌體的致死率達(dá)到100%。

圖2 ARTP誘變下的致死率曲線Fig.2 The death rate curve of ARTP

2.2 菌株的篩選

按等離子體誘變的致死率95%和亞硝基胍誘變的致死率90%，分別進(jìn)行單一因素誘變時(shí)，均未能篩選到目標(biāo)菌株。等離子體與亞硝基胍復(fù)合誘變得到4株不同顏色的突變菌株，這4株菌株分別命名為XP-1、XR-2、XO-3、XY-4，顏色分別呈粉色、深紅色、橙黃色、黃色，結(jié)果如圖3所示。

圖3 NTG與ARTP誘變的變異菌株Fig.3 Mutants of NTG and ARTP

2.3 4株突變菌株油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

通過(guò)復(fù)合誘變所獲得的4株不同顏色的菌株，對(duì)4株表型變異的菌株與圓紅冬孢酵母單倍體發(fā)酵14 d后對(duì)其油脂和類(lèi)胡蘿卜素含量進(jìn)行提取測(cè)定，得到結(jié)果如表1所示。從表1中可以看出，菌體顏色變淺的XP-1、XO-3和XY-4等3株菌的類(lèi)胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為167.94、238.05、62.12 μg/g，都比出發(fā)菌株NP11低，但其油脂含量并沒(méi)有相應(yīng)提高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在50%以上。菌體顏色變深的XR-2菌株的油脂含量顯著降低，僅為0.28 g/g，其類(lèi)胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)相應(yīng)增加，達(dá)到0.77 μg/g。說(shuō)明油脂合成途徑產(chǎn)物的減少可顯著提高類(lèi)胡蘿卜素合成途徑的乙酰輔酶A流量，增加類(lèi)胡蘿卜素合成。結(jié)果表明，在限氮的條件下培養(yǎng)時(shí)，油脂合成途徑為乙酰輔酶A節(jié)點(diǎn)處的優(yōu)勢(shì)分支途徑，從屬分支類(lèi)胡蘿卜素合成通路的通量變化對(duì)油脂的含量無(wú)明顯影響。

表1 發(fā)酵后的殘?zhí)橇?、生物量、油脂含量和?lèi)胡蘿卜素含量

Tab.1 Contents of residual sugar, cell biomass, lipid and caroteniod measured after fermentation

菌株殘?zhí)橇?(g·L-1)生物量/(g·L-1)w(油脂)/(g·g-1)w(類(lèi)胡蘿卜素)/(μg·g-1)XP-12.1±0.39.2±0.50.54±0.1167.94±16.90XR-234.2±1.42.8±0.40.28±0.2770.09±22.73XO-31.3±0.97.2±0.20.51±0.3238.05±39.82XY-41.2±1.18.9±0.30.61±0.162.12±26.92NP111.2±0.48.9±0.80.57±0.1359.09±69.94

如圖4所示，限氮96 h時(shí)，油脂合成途徑為乙酰輔酶A節(jié)點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)分支。限氮培養(yǎng)時(shí)，與乙酰輔酶A合成有關(guān)的基因乙酰輔酶A合成酶(Acs1)與ATP-檸檬酸裂解酶(Acl1)上調(diào)，從而保證充足的乙酰輔酶A前體供應(yīng)；乙酰輔酶A下游代謝途徑中，與油脂合成有關(guān)的基因如乙酰輔酶A羧化酶(Acc1)上調(diào)，與萜類(lèi)化合物合成的有關(guān)基因Erg10下調(diào)，乙酰輔酶A主要流向油脂合成途徑[15]。

2.4 4株特殊表型菌株的脂肪酸成分

用氣相色譜分別對(duì)脂肪酸C14:0、C16:0、C16:1、C18:0、C18:1、C18:2、C18:3成分進(jìn)行分析，因XR-2積累油脂過(guò)少，不作分析。其他3株菌的脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)如表2所示。3株表型變異的菌株與NP11脂肪酸成分差異不大。主要積累C16:0、C18:1，XP-1可以積累C18:3。

圖4 乙酰輔酶A相關(guān)代謝支點(diǎn)相關(guān)蛋白的 表達(dá)調(diào)節(jié)Fig.4 Expression of acetyl-CoA-associated proteins

表2 GC分析3株特殊表型菌株和NP11的脂肪酸成分

Tab.2 Fatty acid compositions of three different phenotype strains and NP11 estimated by GC

菌株w/%C14:0C16:0C16:1C18:0C18:1C18:2C18:3XP-15.427.10.69.942.211.10.8XO-33.433.80.711.440.56.8—XY-45.040.50.89.534.56.3—NP112.131.20.98.439.29.2—注:“—”代表未檢測(cè)到。

2.5 4株表型變異菌株的SNP測(cè)序

單核苷酸多態(tài)性(SNP)主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，包括單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換、顛換等。XP-1進(jìn)行基因組重測(cè)序，參考R.toruloidesNP11基因組比對(duì)，并進(jìn)行SNP、分析和注釋，對(duì)所有突變蛋白進(jìn)行聚類(lèi)分析，重點(diǎn)關(guān)注油脂合成途徑和類(lèi)胡蘿卜合成途徑上的關(guān)鍵基因，結(jié)果如表3所示。結(jié)果顯示，非同義突變主要發(fā)生在反轉(zhuǎn)錄酶、轉(zhuǎn)錄因子與類(lèi)胡蘿卜素代謝途徑的相關(guān)的蛋白。但對(duì)顏色表型有貢獻(xiàn)的是XP-1的CRT1基因發(fā)生突變，310位堿基由C突變成T，使得相應(yīng)的蛋白質(zhì)序列104位氨基酸由His突變?yōu)門(mén)yr (CAC?TAC)如圖5所示。該關(guān)鍵位點(diǎn)突變導(dǎo)致CRT酶活下降，類(lèi)胡蘿卜素合成減少，從基因水平上驗(yàn)證了發(fā)酵結(jié)果。

表3 XP-1中反轉(zhuǎn)錄酶、轉(zhuǎn)錄因子與類(lèi)胡蘿卜素的途徑Tab.3 Reverse transcriptase, transcription factor and pathway of carotenoid in XP-1

圖5 XP-1突變的氨基酸Fig.5 Mutant amino acid of XP-1

3 結(jié) 論

經(jīng)過(guò)等離子誘變與亞硝基胍復(fù)合誘變篩選出來(lái)的色素變異菌株XP-1、XO-3、XY-4都可以積累50%以上的油脂，而類(lèi)胡蘿卜素的含量與NP11相比有所降低?？梢钥闯?，類(lèi)胡蘿卜素代謝途徑受到阻遏，并沒(méi)有對(duì)油脂的形成產(chǎn)生影響。在圓紅冬孢酵母中油脂的合成為優(yōu)勢(shì)途徑。所以類(lèi)胡蘿卜素的降低不會(huì)對(duì)油脂的形成構(gòu)成影響。所篩選出來(lái)的XR-2菌株，與NP11相比可以合成較多的類(lèi)胡蘿卜素，類(lèi)胡蘿卜素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為NP11的1.97倍，僅能合成28%的油脂。該菌株在限氮的條件下不能生成油脂，說(shuō)明油脂合成相關(guān)的代謝途徑被中斷，使乙酰輔酶A更多地流向萜類(lèi)化合物的生成途徑。也證明了只有減弱優(yōu)勢(shì)途徑，才能使乙酰輔酶A更多地流向從屬分支途徑。同時(shí)誘變沒(méi)有對(duì)脂肪酸的組成造成影響。本實(shí)驗(yàn)為紅酵母的類(lèi)胡蘿卜素合成和萜類(lèi)化合物生物合成代謝途徑重構(gòu)提供了理論支持，也為類(lèi)似的代謝節(jié)點(diǎn)調(diào)控研究提供了重要參考價(jià)值。

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ScreeningofcarotenoidsmutantsinRhodosporidiumtoruloides

ZHANG Chaolei1,2, ZHANG Sufang2, LIU Bingnan1, WANG Jihui1

( 1.School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China；2.Division of Biotechnology, Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Science, Dalian 116023, China )

TS201.3

A

1674-1404(2017)05-0318-05

2016-04-01.

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31370554)；遼寧省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014211003)；遼寧省教育廳創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(LT2014010)；大連市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014B11NC088).

張超蕾(1989-)，女，碩士研究生；通信作者：王際輝(1970-)，男，教授.

張超蕾,張素芳,劉冰南,王際輝.圓紅冬孢酵母類(lèi)胡蘿卜素合成突變菌株的篩選[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2017,36(5):318-322.

ZHANG Chaolei, ZHANG Sufang,LIU Bingnan, WANG Jihui. Screening of carotenoids mutants inRhodosporidiumtoruloides[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2017, 36(5): 318-322.