呂向立，吳鵬，朱艾嘉，倪志鑫，張敬懷，陳斌

國家海洋局南海環(huán)境監(jiān)測中心，廣州 510300

城市污水廠污泥傾倒對海洋生物的毒性研究

呂向立，吳鵬，朱艾嘉，倪志鑫，張敬懷，陳斌*

國家海洋局南海環(huán)境監(jiān)測中心，廣州 510300

以廣州市和佛山市的5個城市污水處理廠的污泥為實驗對象，選取費氏弧菌、蒙古裸腹溞、鹵蟲、裸項櫛鰕虎魚仔魚4種不同營養(yǎng)級的海洋生物為受試對象，結(jié)合化學分析方法，研究廣州區(qū)域周邊污水污泥浸出液的生物毒性效應。結(jié)果顯示各污水污泥浸出液的毒性均較大，且浸出液的Cu污染濃度較高；廣州市污水污泥對4種受試生物的毒性效應要高于佛山市。從污泥毒性對受試生物的選擇性方面分析，發(fā)現(xiàn)鹵蟲篩分能力強且靈敏度高，而費氏弧菌則相關性好且方法簡捷。研究結(jié)果為反映城市污泥的生物毒性強度和選擇合適毒性評價受試生物提供基礎數(shù)據(jù)。

污泥浸出液；重金屬；費氏弧菌；蒙古裸腹溞；鹵蟲；裸項櫛鰕虎魚；生物毒性

Received16 February 2017accepted5 May 2017

Abstract: Five municipal sewage sludge leachate from Guangzhou and Foshan was selected for exploring the biological toxicity effect on four marine organisms at different trophic levels, including Vibrio fischeri, Moina mongolica, Artemia franciscana, larval Ctenogobius gymnauchen. Results showed that the biological toxicity of the leachate was significant, in which higher Cu concentration was found. Furthermore, the toxicity effect on four marine organisms was higher in Guangzhou than Foshan. Artemia franciscana was sensitive to all the samples, and exhibited different LC50to different sludge leachate. EC50for Vibrio fischeri was highly correlated with LC50for Artemia franciscana and Moina mongolica, while its toxicity test approach was much simpler. The study can provide data sources for the biological toxicity evaluation of municipal sewage sludge and for selecting suitable marine organisms for this toxicity evaluation.

Keywords: sewage sludge leachate; heavy metal; Vibrio fischeri; Moina mongolica; Artemia franciscana; larval Ctenogobius gymnauchen; biological toxicity

污水污泥是指污水廠處理城市廢水后產(chǎn)生的固態(tài)廢棄物，據(jù)不完全統(tǒng)計，全國每年污泥產(chǎn)量達到2 200萬噸，其中有80%沒有得到妥善處理[1]。污水污泥中含有的大量重金屬、病毒和有機物污染物等，一旦進入環(huán)境后會對生態(tài)系統(tǒng)造成危害，并通過食物鏈影響人類健康[2-3]。污水污泥中的污染物質(zhì)組成復雜，存在復合污染效應，對污泥浸出液的化學分析僅能檢測到特定種類的污染物濃度，而以受試生物為基礎的生物毒性效應分析能較直觀全面反映出污泥浸出液的毒性。

國內(nèi)外許多學者對污水污泥的生物毒性做過研究，Gyung等[4]使用費氏弧菌和鹵蟲分別分析了不同來源的污水污泥的急性生物毒性和累積生物毒性，李娟英等[5]使用黑鯛和海洋藻類研究污水污泥浸出液對海洋生物的急性毒性作用和生長抑制作用，尹杰等[6]使用體外生物測試工具檢測了污水污泥的基線毒性和遺傳毒性水平，上述研究均表明污水污泥具有較強的生物毒性。同時有研究發(fā)現(xiàn)，重金屬的化學分析結(jié)合多種生物毒性方法可以達到更好的毒性評價效果[7]。

廣州和佛山作為珠三角經(jīng)濟圈的2個核心城市，生活污水排放量和污水廠污泥的產(chǎn)量在國內(nèi)處于前列。城市污水污泥的大量產(chǎn)生，已引起日益嚴峻的二次污染，成為城市污水處理行業(yè)的瓶頸[8]。目前，污水污泥的主要處置方式有填埋、堆肥、焚燒和海洋傾倒等，國內(nèi)外對于填埋、堆肥和焚燒中有毒污染物的遷移機制和潛在環(huán)境危害有較多研究[9-12]，而與海洋傾倒相關甚少。某些處置方法在實施過程中釋放的有毒物質(zhì)存在擴散到周圍的水環(huán)境和大氣環(huán)境的隱患，有毒物質(zhì)隨地表徑流進入水環(huán)境后，可對生態(tài)系統(tǒng)和食物鏈造成較大范圍的危害[13]。當前，國內(nèi)外關于采用多種海洋生物綜合評價污水污泥生物毒性的報導較少。本研究通過化學方法測定了污泥重金屬污染物含量，并以多種海洋生物為受試生物評價了廣州周邊污水污泥的毒性效應強度，對比分析4種海洋受試生物用于評價污水污泥的優(yōu)缺點，為污水污泥的海洋傾倒處置研究提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

1.1.1 污水污泥樣品

選取了廣州和佛山共5個污水處理廠出廠終端污泥作為測試樣品，不同污水處理廠的運行參數(shù)如表1所示。樣品采集后裝入聚乙烯袋避光密封保存，當天運回實驗室，置于-18 ℃保存并在2個月內(nèi)進行毒性測試。

1.1.2 海洋受試生物

發(fā)光細菌實驗使用費氏弧菌(NRRL-B-11177)凍干菌粉，購于美國哈希公司。

蒙古裸腹溞為實驗室自培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：水溫22 ℃～27 ℃、鹽度26～30、自然光照，并每日投喂一定數(shù)量的微藻。

表1 污水處理廠參數(shù)Table 1 Parameters of sewage treatment plants

注：A2/O為厭氧缺氧好氧法；UNITANK為一體化活性污泥法。

Note: A2/O stand for Anaerobic-anoxic-oxic process; UNITANK stand for united activated sludge process.

鹵蟲采用美國Advanced Hatchery Technology INC.公司的鹵蟲卵進行孵化后使用，培養(yǎng)條件為：水溫25 ℃，鹽度32～34，光強2 000 lux。

裸項櫛鰕虎魚仔魚為10日齡，購自廣東省實驗動物監(jiān)測所，培養(yǎng)條件為：水溫35 ℃～30 ℃、鹽度20～30、自然光照，并每日投喂鹵蟲無節(jié)幼體或輪蟲。

1.2 實驗方法

1.2.1 浸出液的制備

實驗前將污泥樣品解凍后烘干，將一定質(zhì)量的污泥(g)與人工海水(mL)(鹽度為30，pH為8.0)按1∶4質(zhì)量體積比進行混勻，然后以3 000 r·min-1攪拌30 min，靜置1 h，采用虹吸法取出上層液體，經(jīng)0.45 μm的濾膜過濾處理后即為儲備污泥浸出液[14]。

在每種受試生物實驗組中取儲備污泥浸出液經(jīng)2 mg·L-1的NaCl溶液稀釋得到5個等比濃度組(原液濃度的100%、50%、25%、12.5%、6.25%)并設置一個空白對照組(0%)，每個濃度組設置3個平行。

1.2.2 浸出液重金屬分析

浸出液中重金屬含量分析按照GB17378.4—2007 海洋監(jiān)測規(guī)范使用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)進行測定[15]。

1.2.3 受試生物的毒性測試

費氏弧菌在15 ℃恒溫條件下加入活化菌液并在LUMIStox 300發(fā)光細菌綜合毒性儀上測量反應前和反應30 min后的相對發(fā)光強度(RLU)[16]，實驗操作和EC50運算按照ISO 11348-3:2009標準進行[17]。

蒙古裸腹溞、鹵蟲和裸項櫛鰕虎魚仔魚3個受試生物實驗組中每個濃度組每個平行放入10個實驗生物個體，30 min內(nèi)完成分放。蒙古裸腹溞毒性實驗持續(xù)時間為72 h，鹵蟲和裸項櫛鰕虎魚仔魚為96 h，每24 h觀察記錄受試生物存活情況，并及時移除死亡個體。試驗結(jié)束時，記錄各燒杯中的存活個體數(shù)。實驗方法和數(shù)據(jù)處理參照GB/T 18420.2—2009標準[18]。

1.2.4 統(tǒng)計與分析

實驗數(shù)據(jù)相關性分析使用統(tǒng)計學軟件SPSS，相關性分析采用基于pearson相關系數(shù)的雙側(cè)顯著性檢驗。聚類分析選擇系統(tǒng)聚類中的組間聯(lián)結(jié)方法，量度標準為平方Euclidean距離。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 浸出液化學分析

通過對廣州周邊5個污水污泥樣品浸出液重金屬污染物濃度進行分析，結(jié)果顯示5個樣品的重金屬濃度有較大的差異。A1、A4和A5浸出液的重金屬濃度明顯高于A2和A3；在5個污水處理廠中，A5處理廠中的Cu濃度最高，而A4處理廠中Zn濃度最高，A1處理廠的Cu和Zn濃度都大幅高于A2和A3處理廠。綜合分析，5個污水污泥浸出液樣品的重金屬濃度為A5和A4最高，A1次之，A3和A2最低(表2)。對重金屬濃度進行的相關性分析表明，污水污泥中Cu和Cd達到顯著相關水平(P<0.01)(表3)，說明2個因子可能存在一定同源性。

有研究顯示上海周邊污水處理廠污泥浸出液的重金屬濃度以Zn最高，Cr和Cu次之[5]，而對廣州周邊5個污水廠污泥的分析表明浸出液中Cu的濃度最高。郭鵬然等[19]對廣州污泥浸出液重金屬的研究也顯示污泥具有高濃度Cu的特征。

表2 污泥浸出液重金屬濃度化學分析Table 2 Concentration of heavy metals in sludge leachates

將重金屬化學分析結(jié)果與歐盟EN12457.2-2002[20]和國標GB5085.3—2007[21]中有關危險廢棄物浸出液的參考限值作對比發(fā)現(xiàn)，只有A5處理廠污泥中Cu含量超過歐盟標準，其余重金屬含量均遠低于歐盟和我國危險廢棄物的相關標準，說明污水污泥的毒性尚未達到很嚴重的環(huán)境危害級別。

2.2 污水污泥浸出液生物毒性效應分析

4種不同營養(yǎng)級水平的海洋生物對污水污泥浸出液的毒性效應結(jié)果見圖1。費氏弧菌的半數(shù)效應濃度EC50值反映A5處理廠的污泥毒性最強(9.4%)，其次為A4和A3處理廠的污泥，而A1處理廠污泥毒性(25.7%)和A2處理廠(54.3%)相對較弱；蒙古裸腹溞的半致死濃度LC50值反映出A2處理廠的污泥毒性(55.2%)明顯低于A5、A4、A1和A3處理廠的污泥毒性(3.8%～7.7%)；鹵蟲的LC50值同樣反映出A2處理廠污泥毒性(25.6%)最低；5個處理廠污泥對裸項櫛鰕虎魚仔魚的LC50值都低于5.5%，反映出5個處理廠污泥的毒性都較強(圖1)。綜合分析4種受試生物的毒性效應發(fā)現(xiàn)，A3、A4和A5處理廠污泥浸出液的毒性相對高于A1和A2處理廠污泥，而A2處理廠污泥毒性最低，5個污水處理廠污泥的生物毒性強度基本表現(xiàn)為A5>A4>A3>A1>A2。將污水處理廠參數(shù)與綜合毒性結(jié)果作比對，發(fā)現(xiàn)毒性最高的A5污泥和最低的A2污泥分別對應污水處理廠的最高和最低污水日處理量。本研究結(jié)果表明生活污水處理廠污泥浸出液具有較強的生物毒性，這與國外一些學者利用發(fā)光細菌研究污水污泥毒性獲得的結(jié)果基本一致[22]。

圖1 受試生物LC50(EC50)對比Fig. 1 Comparison of LC50(EC50) values

表3 污泥浸出液重金屬濃度相關性系數(shù)矩陣(n=5)Table 3 Correlation coefficient matrix of heavy metal concentration in sewage leachates (n=5)

注：**為P<0.01。

Note: ** stands for P<0.01.

根據(jù)4種受試生物的LC50或EC50值的毒性效應，通過聚類分析圖發(fā)現(xiàn)5個污水處理廠的污泥毒性效應聚為明顯的3組，其中A3、A4和A5處理廠污泥毒性相近聚為一組，同時A1處理廠污泥毒性聚為單獨一組，而A2處理廠污泥毒性經(jīng)過第三次迭代后形成與前2組有著較大的組間距離的一組(圖2)。通過4種生物的毒性試驗結(jié)合聚類圖發(fā)現(xiàn)，在輸入源同為生活污水情況下，來源于廣州的A3、A4和A5污水處理廠在污水日處理量和污泥毒性方面都要很明顯高于佛山的A1和A2處理廠污泥。

將5個污水處理廠的污泥生物毒性檢測結(jié)果與相應污泥浸出液的重金屬含量分析結(jié)果作比對，發(fā)現(xiàn)A5、A4和A1處理廠污泥浸出液的重金屬濃度相對較高，與此同時該3個處理廠的污泥生物毒性也較強；而A2處理廠污泥的重金屬濃度最低，其污泥表現(xiàn)的生物毒性也最弱；另一方面，A3處理廠污泥浸出液表現(xiàn)的高生物毒性效應與重金屬濃度分析結(jié)果不一致，這表明該污泥可能受到其他有毒污染物質(zhì)(如有機污染物等)影響，或者與污染物之間存在協(xié)同效應，從而增強了污泥的綜合毒性[3]。

圖2 污泥浸出液急性毒性聚類分析Fig. 2 Cluster analysis on toxicity of sewage leachates

有研究顯示費氏弧菌、蒙古裸腹溞、鹵蟲和魚類仔魚對于Cu、Zn、Cr、Pb和Cd的LC50(EC50)區(qū)間分別為0.089～2.19 mg·L-1、0.614～19.1 mg·L-1、4.240～23.0 mg·L-1、0.181～117 mg·L-1和0.117～9.95 mg·L-1[23-30]， Cu、Zn和Cd對于受試生物的毒性更大。本研究中污泥浸出液的Cu和Zn濃度都明顯高于上述研究的Cu和Zn的LC50(EC50)區(qū)間，因此，推斷Cu和Zn可能在綜合毒性中的貢獻比例較高。有研究顯示污水污泥的重金屬和其他有機毒性成分比例存在較大地域和處理源的差異性，而Cu和Zn為生活污水主要的重金屬污染物[31-33]。

實驗結(jié)果表明廣州周邊污水污泥毒性較大，如填埋或大量堆肥可能會存在滲濾液污染環(huán)境的問題，如采用海洋傾倒的方式予以處置，可能對海洋環(huán)境產(chǎn)生較大的潛在風險，建議不宜采用該方式處置或者經(jīng)過減毒無害化處理后傾倒。

2.3 4種受試生物毒性方法比較

根據(jù)4種海洋受試生物的毒性效應結(jié)果進行的pearson相關性分析發(fā)現(xiàn)，受試生物費氏弧菌與蒙古裸腹溞和鹵蟲的毒性效應相關性較高，費氏弧菌與蒙古裸腹溞的毒性結(jié)果在P<0.01的水平上顯著正相關，費氏弧菌與鹵蟲在P<0.05的水平上顯著正相關(表4)。有研究表明，費氏弧菌的急性毒性方法與許多運用海洋生物作為受試生物的方法都有良好的相關性，這種方法在沉積物毒性評價等生態(tài)毒理學領域已經(jīng)形成一種標準化系統(tǒng)并得到廣泛推廣[34-36]。

處于較高營養(yǎng)級的裸項櫛鰕虎魚仔魚的毒性結(jié)果與其他受試生物相關性均不強(-0.301～0.090)。同時，5個污水處理廠的污泥對裸項櫛鰕虎魚仔魚產(chǎn)生的毒性效應差別較小(LC50值都較小)，對于污泥樣品毒性的區(qū)分度不佳，結(jié)果表明裸項櫛鰕虎魚仔魚對污泥雖具有較高靈敏度但毒性篩分能力較差。

表4 受試生物LC50(EC50)的pearson相關性系數(shù)矩陣(n=5)Table 4 Pearson correlation coefficient matrix of LC50(EC50) values (n=5)

注：**為P<0.01；*為P<0.05。

Note: ** stands for P<0.01; * stands for P<0.05.

國內(nèi)一些學者分析了陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)對裸項櫛鰕虎魚仔魚(96 h)、鹵蟲(96 h)、蒙古裸腹溞(72 h)和脊尾白蝦(96 h)的毒性，研究結(jié)果表明裸項櫛鰕虎魚仔魚相比其他幾種受試生物對于SDS具有更高的生物敏感性[37-39]，而國外學者研究發(fā)現(xiàn)早期階段的鳉魚對于氯酚類和多氯聯(lián)苯類有機污染物的敏感性普遍較高[40-43]。因此，是否由于5個污泥的浸出液中可能存在一些低水溶性有機污染物，如具有遺傳毒性的氯酚(CPs)、氯苯(CBs)、硝基苯(NBs)、多氯聯(lián)苯(PCBs)、多氯代二苯并二噁英/呋喃(PCDD/Fs)、鄰苯二甲酸酯(PAEs)和多環(huán)芳烴(PAHs)等[44]，又或者常見于生活污水中的水溶性有機污染物直鏈烷基苯磺酸鈉(LAS)和SDS等，從而對裸項櫛鰕虎魚仔魚產(chǎn)生較大毒性，推論有待進一步證實。

何芬等[45]以魚類和發(fā)光細菌等作為受試生物進行的單一化學毒物對比研究則顯示魚類的靈敏度不如蚤類和發(fā)光細菌。該實驗結(jié)果與本研究結(jié)果不一致的原因可能為受試魚類的毒物耐受能力存在差距，或不同毒物化學特征和混合形式的差異所導致。本研究中，其他3種受試生物鹵蟲、蒙古裸腹溞和費氏弧菌在靈敏度和篩分能力上均較高，鹵蟲的LC50值低于費氏弧菌和蒙古裸腹溞，說明其靈敏度更高，這與國內(nèi)學者利用鹵蟲研究污水污泥毒性獲得的結(jié)論基本一致[5]。

綜上分析，費氏弧菌的生物毒性效應與蒙古裸腹溞和鹵蟲有較高相關性，盡管鹵蟲兼具高篩分能力和高靈敏度的優(yōu)點，但費氏弧菌具有更簡便、快速和靈敏的特點，污水污泥毒性實驗中可以優(yōu)先考慮選擇費氏弧菌作為受試生物替代蒙古裸腹溞和鹵蟲。毒性效應較特殊的裸項櫛鰕虎魚仔魚可作為毒性結(jié)果評價一個補充參考項。

致謝：感謝國家海洋局南海環(huán)境監(jiān)測中心陶偉、鄭琰晶在文章撰寫過程中給予的幫助。

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ToxicityofMunicipalSewageSludgetoMarineOrganisms

Lyu Xiangli, Wu Peng, Zhu Aijia, Ni Zhixin, Zhang Jinghuai, Chen Bin*

South China Sea Environmental Monitoring Center, SOA, Guangzhou 510300, China

10.7524/AJE.1673-5897.20170216001

2017-02-16錄用日期2017-05-05

1673-5897(2017)3-636-08

X171.5

A

陳斌(1988-)，女，碩士，助理工程師，主要研究方向為海洋分子生物學。

國家海洋局公益性科研項目子課題(201105010-2)；廣東省自然科學基金項目(2014A030310495)；國家海洋局南海分局海洋科學技術(shù)局長基金(1431)

呂向立(1985-)，男，學士，研究方向為海洋生態(tài)毒理學，E-mail：xianglilyu@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: stlxbb@126.com

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Lyu X L, Wu P, Zhu A J, et al. Toxicity of municipal sewage sludge to marine organisms [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(3): 636-643 (in Chinese)