張躍恒，王大力，高丹，孫昊宇，印春生, *，林志芬

1. 上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，上海 2013062. 污染控制與資源化研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200092

基于QSAR模型的磺胺與群體感應(yīng)抑制劑對(duì)枯草芽孢桿菌聯(lián)合慢性毒性規(guī)律初探

張躍恒1，王大力2，高丹2，孫昊宇2，印春生1, *，林志芬2

1. 上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，上海 2013062. 污染控制與資源化研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200092

群體感應(yīng)抑制劑是抗生素最有可能的替代品，兩者在環(huán)境中的共存會(huì)對(duì)生物造成聯(lián)合毒性影響。以革蘭氏陽(yáng)性菌枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis，B. subtilis)為模式生物，3種群體感應(yīng)抑制劑(呋喃酮、吡咯酮和吡咯)和磺胺類藥物為研究對(duì)象，測(cè)定了20 h單一和聯(lián)合毒性。結(jié)果顯示，3種群體感應(yīng)抑制劑和磺胺的聯(lián)合毒性分別表現(xiàn)為相加和拮抗。同時(shí)根據(jù)不同的聯(lián)合毒性效應(yīng)，以藥物和蛋白分子的對(duì)接結(jié)合能(Ebinding)作為結(jié)構(gòu)參數(shù)分別構(gòu)建了聯(lián)合毒性的QSAR模型，并分析了不同毒性效應(yīng)下混合物中各組分的相互作用關(guān)系。結(jié)果表明，無(wú)論是相加還是拮抗，在二元混合體系中磺胺與其靶蛋白DHPS的有效結(jié)合濃度總是高于群體感應(yīng)抑制劑與LuxS的有效結(jié)合濃度；但當(dāng)產(chǎn)生拮抗作用時(shí)，磺胺與DHPS的有效結(jié)合濃度相對(duì)較低，推測(cè)可能是群體感應(yīng)抑制劑的存在使得磺胺由分子態(tài)變?yōu)殡x子態(tài)，從而使其難以穿過細(xì)胞壁與DHPS結(jié)合導(dǎo)致的。本研究為建立和分析聯(lián)合毒性的QSAR模型提供了一定的理論基礎(chǔ)。

枯草芽孢桿菌；磺胺；群體感應(yīng)抑制劑；慢性聯(lián)合毒性；定量結(jié)構(gòu)-活性相關(guān)

Received12 January 2017accepted2 March 2017

Abstract: Quorum sensing inhibitors (QSIs) are a promising alternative to the antibiotics, and the coexistence of antibiotics and QSIs could lead to joint toxic effect on ecosystem. Individual and combined toxicity of sulfonamides and QSIs to Bacillus subtilis (B. subtilis) were determined in this study, which showed that the joint toxic action of sulfonamides and QSIs was addition or antagonism. Based on different joint toxic action, QSAR models were developed using the interaction energies (Ebinding) between drugs and related proteins, and the relationships of components in mixtures were discussed, respectively. It was found that effective binding concentration of sulfonamides with its target protein (DHPS) was higher than that of QSIs with LuxS in spite of different joint toxic actions. However, in the case of synergistic effect, effective binding concentration of sulfonamides with DHPS was relatively lower since sulfonamides changed from molecular state to ionic state with the impact of some QSIs, leading to impossible entering into the cell. This study can provide theoretical basis for the establishment and analysis of QSAR models of joint toxicity.

Keywords: Bacillus subtilis; sulfonamides; QSI; chronic mixture toxicity; QSAR

抗生素廣泛應(yīng)用于醫(yī)療及畜牧養(yǎng)殖行業(yè)，是世界上用量最大、使用最廣泛的藥物之一。大部分抗生素不能完全被機(jī)體吸收，有80%～90%經(jīng)由人體和畜禽糞尿排入環(huán)境[1-2]。抗生素等藥物的過量使用還能導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性的不斷增強(qiáng)[3]，因此控制抗生素使用量以及開發(fā)新型抗菌藥迫在眉睫。群體感應(yīng)抑制劑(quorum sensing inhibitors，QSIs)是一種作用于細(xì)菌群體感應(yīng)信號(hào)通路(quorum-sensing, QS)的藥物，它能在不影響細(xì)菌生長(zhǎng)的情況下，有效隔斷細(xì)菌毒力因子的形成，同時(shí)不對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生選擇壓力，不會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[4]，所以QSIs被認(rèn)為是抗生素的有效替代品。然而將QSIs直接作用于細(xì)菌時(shí)，抗菌效果并不理想，因此將QSIs與抗生素聯(lián)合作用于細(xì)菌，可能會(huì)提高抗菌效率，同時(shí)減少抗生素的使用[5]。另一方面，QSIs進(jìn)入環(huán)境后可能和環(huán)境中已存在的抗生素共存[2, 6]，對(duì)生物產(chǎn)生聯(lián)合毒性，因此研究抗生素和QSIs的聯(lián)合毒性具有重要意義。

關(guān)于抗生素和QSIs的聯(lián)合毒性已經(jīng)開展了部分工作。有研究者發(fā)現(xiàn)吡咯類、吡咯酮類QSIs和磺胺對(duì)大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)的12 h聯(lián)合毒性產(chǎn)生了相加或拮抗作用[7]；另有人以發(fā)光菌(Vibrio fischeri, V. fischeri)為模式生物，用QSIs和磺胺對(duì)其進(jìn)行了15 min聯(lián)合毒性實(shí)驗(yàn)(發(fā)光抑制)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示聯(lián)合毒性分別顯示為協(xié)同、相加和拮抗[8]。然而這些研究大都是以革蘭氏陰性菌為模式生物進(jìn)行的。由于針對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的聯(lián)合毒性鮮有報(bào)道，且革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的擁有不同的群體感應(yīng)系統(tǒng)[9]，聯(lián)合毒性結(jié)果可能存在差異，所以本文對(duì)磺胺和群體感應(yīng)抑制劑對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的聯(lián)合毒性進(jìn)行了研究。

目前在混合污染物聯(lián)合毒性研究中，定量結(jié)構(gòu)-活性相關(guān)(QSAR)以其簡(jiǎn)單方便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、預(yù)測(cè)功能強(qiáng)大而成為一種預(yù)測(cè)混合物聯(lián)合毒性的有效途徑[10]。Zou等[11]在構(gòu)建混合物對(duì)V. fischeri急性和慢性毒性作用的QSAR模型時(shí)，將藥物分子與蛋白的相互作用能Ebinding值引入方程中，預(yù)測(cè)方程的決定系數(shù)R2分別達(dá)到0.999和0.998。Long等[12]和Fang等[13]分別構(gòu)建了磺胺和其他抗生素對(duì)E.coli 12 h、對(duì)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis，B. subtilis)20 h聯(lián)合毒性作用的QSAR模型，并且指出聯(lián)合毒性的結(jié)果不僅取決于Ebinding值的大小，也可能取決于“有效作用濃度”，為揭示混合物的聯(lián)合毒性機(jī)制提供了一種新思路。

本文以磺胺類抗生素和3類QSIs(呋喃酮、吡咯和吡咯酮)為研究對(duì)象，以革蘭氏陽(yáng)性菌B. subtilis為模式生物，研究了抗生素和QSIs的單一及二元聯(lián)合毒性；此外結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)，按聯(lián)合毒性效果的不同分別構(gòu)建了抗生素和QSIs二元聯(lián)合毒性的QSAR模型，并對(duì)QSAR模型進(jìn)行討論和分析。本文為QSAR模型的建立和分析提供了一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及受試生物

實(shí)驗(yàn)所用抗生素及群體感應(yīng)抑制劑均購(gòu)自Sigma-Aldrich有限公司(St. Louis, MO, USA)(純度>99%)，藥物信息如表1所示?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis 168)購(gòu)自普如汀生物技術(shù)有限公司。

1.2 毒性測(cè)定及表征方法

1.2.1 培養(yǎng)基及菌液配制

培養(yǎng)基：稱取蛋白胨2.50 g，酵母提取物1.25 g，NaCl 1.00 g，加入100 mL蒸餾水溶解，調(diào)節(jié)pH值為7.0～7.2，高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min，制成2.5倍LB培養(yǎng)基。在毒性測(cè)試體系中，2.5倍培養(yǎng)基將被稀釋成單倍。

菌液配制：將第三代斜面菌種接種至5 mL單倍培養(yǎng)基中，在37 ℃、180 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用1% NaCl溶液稀釋對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液，使菌群密度維持在103cell·mL-1左右，攪拌40 min作為實(shí)驗(yàn)菌液備用。

將實(shí)驗(yàn)試劑用1% NaCl溶液配制成等對(duì)數(shù)濃度梯度的系列溶液(助溶劑二甲亞砜<0.5%)。實(shí)驗(yàn)時(shí)加入系列濃度梯度的化合物80 μL至96孔板中，同時(shí)加入2.5倍LB培養(yǎng)基80 μL和40 μL實(shí)驗(yàn)菌液。每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)板設(shè)置18個(gè)空白對(duì)照，溫度設(shè)置為37 ℃培養(yǎng)20 h，并用Thermo化學(xué)發(fā)光讀數(shù)儀(1510，上海寶賽生物科技有限公司)測(cè)定光密度OD620。

1.2.2 單一毒性表征

化合物的單一毒性采用其對(duì)受試菌的半數(shù)效應(yīng)濃度EC50來表征。以化合物濃度的負(fù)對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)繪制劑量-效應(yīng)曲線，進(jìn)行線性回歸并得到抑制率-負(fù)對(duì)數(shù)濃度方程，求得50%抑制率對(duì)應(yīng)的化合物濃度即為EC50。抑制率計(jì)算公式如式(1)：

In%=1-OD/OD0×100%

(1)

式中OD為培養(yǎng)20 h后實(shí)驗(yàn)組的測(cè)量值，OD0為空白對(duì)照組的測(cè)量值，In(%)為抑制率。

1.2.3 聯(lián)合毒性表征

根據(jù)單一化合物毒性的EC50值，配制抗生素和QSIs等毒性比的混合溶液。按照單一毒性實(shí)驗(yàn)的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定混合溶液的毒性并得到混合溶液的EC50mix值。聯(lián)合毒性采用指標(biāo)TU表征，計(jì)算方法如式(2)所示：

TU=CA/EC50A+CB/EC50B

(2)

式中CA和CB分別表示化合物A和化合物B在混合體系中的摩爾濃度(mol·L-1), EC50A和EC50B分別表示化合物A和化合物B的半數(shù)效應(yīng)濃度。

根據(jù)Broderiu等[14]的聯(lián)合毒性判定標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)TU<0.8時(shí)，認(rèn)為兩組分之間存在的是協(xié)同效應(yīng)；0.8>TU>1.2認(rèn)為兩組分之間存在的是加和效應(yīng)；TU>1.2認(rèn)為兩組分之間存在的是拮抗效應(yīng)。

1.2.4 分子對(duì)接及Ebinding值計(jì)算

本文采用Discovery studio 3.1(Accelrys Software Inc.)中的CDOCKER模塊進(jìn)行分子對(duì)接，研究了磺胺和QSIs與相關(guān)蛋白的相互作用。由于枯草芽孢桿菌中的二氫葉酸合成酶(DHPS)以及信號(hào)分子AI-2的合成蛋白LuxS的三級(jí)結(jié)構(gòu)都為未見發(fā)表，所以需要進(jìn)行同源建模，具體如下：以Bacillus anthracis中DHPS的三級(jí)結(jié)構(gòu)1TWS(PDB：http://www.rcsb.org)為模板，根據(jù)草芽孢桿菌的 DHPS氨基酸序列AIU75013.1(NCBI：https://www.ncbi.nlm.nih.gov)進(jìn)行同源建模，獲得枯草芽孢桿菌的DHPS三維結(jié)構(gòu)；以Salmonella typhimurium中的LuxS的三級(jí)結(jié)構(gòu)1TJY為模板，根據(jù)枯草芽孢桿菌的LuxS氨基酸序列2FQT進(jìn)行同源建模，獲得枯草芽孢桿菌的LuxS三維結(jié)構(gòu)。將磺胺和QSIs分別與其作用靶蛋白對(duì)接，以CDOCKER interaction energy (Ebinding，kcal·mol-1)為評(píng)價(jià)參數(shù)，以Ebinding最大負(fù)值作為最穩(wěn)定構(gòu)象[15]。

1.2.5 QSAR模型建立

QSAR是用來描述分子的物理化學(xué)性質(zhì)與分子生物活性之間關(guān)系的模型，本文參照相關(guān)研究[11-13]中使用的方法，以分子對(duì)接結(jié)合能(Ebinding)為結(jié)構(gòu)參數(shù)構(gòu)建了抗生素和QSIs單一和聯(lián)合毒性的QSAR模型，并利用可決系數(shù)(R2)、Fisher值(F)和顯著水平(P)來對(duì)方程擬合效果進(jìn)行說明。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 抗生素和QSIs的單一毒性

抗生素和QSIs分別單獨(dú)作用于B. subtilis時(shí)，都可以表現(xiàn)出一定程度的抑菌作用。兩者單一毒性的-lgEC50(mol·L-1)值如表1所示，其中磺胺類藥物的-lgEC50(mol·L-1)為4.33～5.66，毒性從小到大依次為：SPY

圖1 磺胺和QSIs對(duì)枯草芽孢桿菌20 h的單一毒性效應(yīng)Fig. 1 Single toxicity of sulfonamides and QSIs to Bacillus subtilis 168 under 20 h exposure

表1 磺胺和群體感應(yīng)抑制劑(QSIs)的單一毒性及EbindingTable 1 Single toxicity and Ebinding values of sulfonamides and QSIs

有研究顯示，磺胺類藥物對(duì)E. coli的慢性單一毒性-lgEC50(mol·L-1)為5.29～6.35[7,16]，整體上大于磺胺對(duì)B. subtilis的毒性，推測(cè)這可能是革蘭氏陽(yáng)性菌(B. subtilis)的細(xì)胞壁比革蘭氏陽(yáng)性菌(E. coli)的細(xì)胞壁厚，且肽聚糖含量較高而導(dǎo)致的[13]。

利用分子對(duì)接技術(shù)，我們分別模擬了磺胺和DHPS、QSIs和LuxS的相互作用，并計(jì)算了結(jié)合能Ebinding?；前奉愃幬锸菍?duì)氨基苯甲酸(pABA)的結(jié)構(gòu)類似物(圖2)，它能夠競(jìng)爭(zhēng)性地抑制DHPS的活性從而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)[17-18]；而QSIs作為群體感應(yīng)抑制劑，它的作用途徑可能有3種，即作用于信號(hào)分子的受體蛋白、信號(hào)分子的合成蛋白以及和信號(hào)分子本身相互作用[19]。

革蘭氏陽(yáng)性菌中主要存在2種群體感應(yīng)系統(tǒng)，第1種是種內(nèi)群體感應(yīng)系統(tǒng)，第2種是種間群體感應(yīng)系統(tǒng)。在本文研究中，我們所使用的QSIs的結(jié)構(gòu)和第2種群體感應(yīng)系統(tǒng)的信號(hào)分子呋喃酮酰硼酸二酯(AI-2)類似(如圖2)。然而由于在B. subtilis中尚未發(fā)現(xiàn)AI-2的受體蛋白[20]，因此在本文中我們只考慮QSIs與B. subtilis的信號(hào)分子合成蛋白LuxS的結(jié)合情況。從分子對(duì)接的結(jié)果上看(表1)，磺胺類藥物與其靶蛋白DHPS的Ebinding值在-26.06 kcal·mol-1到-43.09 kcal·mol-1之間，而QSIs和LuxS的Ebinding值介于-11.85 kcal·mol-1和-19.30 kcal·mol-1之間，整體上磺胺與DHPS的Ebinding值大于QSIs和LuxS的Ebinding值。

為驗(yàn)證Ebinding和單一毒性的關(guān)系，嘗試以Ebinding值為結(jié)構(gòu)參數(shù)，結(jié)合單一毒性-lgEC50值進(jìn)行回歸，得到回歸方程如式(3)：

-lgEC50=-0.17×Ebinding-0.95

(3)

n=19 R2= 0.84 F =94.06 P=0.00

式中，Ebinding為磺胺或QSIs與對(duì)應(yīng)蛋白的結(jié)合能。方程決定系數(shù)R2達(dá)到0.84，這意味著藥物的單一毒性的大小與結(jié)合能具有很好的相關(guān)性。

圖2 磺胺和QSIs對(duì)枯草芽孢桿菌的毒性機(jī)理Fig. 2 Toxic mechanisms of sulfonamides and QSIs in B. subtilis

圖3 二元混合物慢性聯(lián)合毒性Fig. 3 The chronic joint effects of sulfonamides and QSIs

2.2 抗生素和QSIs的聯(lián)合毒性

2.2.1 聯(lián)合毒性的作用類型

磺胺類抗生素和QSIs對(duì)枯草芽孢桿菌的聯(lián)合作用絕大部分表現(xiàn)出相加和拮抗(圖3)。其中，F(xiàn)ur、2M3o、DL-P和L-Pr同磺胺的聯(lián)合毒性TU值均大于1.20，呈現(xiàn)出拮抗作用；而2-Py、NV2P、γ-V和磺胺的聯(lián)合毒性TU值大都位于0.80和1.20之間，表現(xiàn)出相加作用；僅有2-Py 和SPY的TU值為0.59，顯示為協(xié)同作用。由于協(xié)同作用現(xiàn)象只出現(xiàn)了1次，數(shù)量過少，不具有代表性，因此在QSAR建模過程中將把該點(diǎn)剔除。

眾所周知，磺胺和QSIs對(duì)B. subtilis的作用通路是相互獨(dú)立的(圖2)，即分別作用于葉酸代謝通路和群體感應(yīng)信號(hào)通路。因此理論上兩者的聯(lián)合毒性應(yīng)該顯示為相加，然而我們的部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出了拮抗，其原因可能是由于部分QSIs的存在可以使磺胺由分子態(tài)變?yōu)殡x子態(tài)，而離子形態(tài)的磺胺藥物是難以通過細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)菌胞內(nèi),從而產(chǎn)生毒性的[21]，因此本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)顯示為拮抗。

2.2.2 聯(lián)合毒性的QSAR預(yù)測(cè)模型

在上文討論單一毒性的部分，我們已經(jīng)將Ebinding值為結(jié)構(gòu)參數(shù)進(jìn)行回歸(式(3))并建立方程，獲得了單一毒性-lgEC50值和Ebinding值之間較好的相關(guān)關(guān)系。在這里參照Z(yǔ)ou等[11]的方法，繼續(xù)嘗試以Ebinding值為結(jié)構(gòu)參數(shù)，建立聯(lián)合毒性的回歸方程。

首先嘗試將以上所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸，回歸方程如式(4)：

(4)

n=48 R2=0.46 F =19.70 P=0.00

圖4 二元混合物中兩組分表觀濃度比和有效作用濃度比Fig. 4 Ratios of nominal and actual concentrations of individual chemicals in binary toxicity

式(4)中的R2值僅為0.46，回歸結(jié)果較差，推測(cè)原因可能是磺胺和QSIs的聯(lián)合毒性屬于2種不同的作用類型。

因此，我們嘗試根據(jù)聯(lián)合作用(TU)的效果不同，將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分為相加組和拮抗組進(jìn)行線性回歸，回歸方程如下：

(5)

n=21 R2=0.91 F=92.5 P=0.00

(6)

n=27 R2=0.78 F = 42.25 P=0.00

式(5)和式(6)分別代表相加組和拮抗組的回歸方程，兩方程的決定系數(shù)R2分別達(dá)到0.91和0.78，結(jié)果較好。這說明進(jìn)行分組后，各組內(nèi)磺胺和QSIs的聯(lián)合毒性與二者和對(duì)應(yīng)蛋白的結(jié)合能有較好的相關(guān)關(guān)系。

由于混合體系是按等毒性濃度進(jìn)行配制的，所以表觀濃度比即為半數(shù)效應(yīng)濃度之比：

(7)

我們用Ri表示磺胺和QSIs的有效結(jié)合濃度比。結(jié)合式(5)、(6)、(7)可分別得到相加組和拮抗組中的Ri值：

(8)

本文的章節(jié)2.2.1部分曾推測(cè)在聯(lián)合毒性作用中，磺胺和QSIs的拮抗效應(yīng)產(chǎn)生的原因可能是部分QSIs能夠使磺胺由分子態(tài)變?yōu)殡x子態(tài)，導(dǎo)致后者難以穿過細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞、產(chǎn)生毒性。結(jié)合上文關(guān)于有效結(jié)合濃度的討論，可以較為完整地解釋拮抗效應(yīng)產(chǎn)生的過程。推論過程如下：

當(dāng)2種藥物組分產(chǎn)生拮抗作用，即兩者作用過程相互干擾時(shí)，Ri值較小(式(9))，即有效結(jié)合濃度變小。當(dāng)2種藥物組分產(chǎn)生相加作用，即毒性效果互不影響時(shí)，則Ri值較大(式(8))，有效結(jié)合濃度較大；這預(yù)示著磺胺和QSIs聯(lián)合作用于枯草芽孢桿菌時(shí)，一部分QSIs可以使磺胺由分子態(tài)變?yōu)殡x子態(tài)，離子態(tài)的磺胺難以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，則磺胺與DHPS的有效結(jié)合濃度就相對(duì)降低(Ri較小)，最后聯(lián)合作用表現(xiàn)為拮抗；與之相對(duì)的，如果QSIs可以和磺胺分子共存，則磺胺就會(huì)較為容易的進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，與DHPS的有效結(jié)合濃度也會(huì)較高(Ri較大)，最后聯(lián)合作用表現(xiàn)為相加。

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APreliminaryInvestigationontheChronicSingleandMixtureToxicityofSulfonamidesandQuorumSensingInhibitorstoBacillussubtilisBasedonQSAR

Zhang Yueheng1, Wang Dali2, Gao Dan2, Sun Haoyu2, Yin Chunsheng1, *, Lin Zhifen2

1. College of Marine Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China2. State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse, College of Environmental Science and Engineering, Tongji University, Shanghai 200092, China

10.7524/AJE.1673-5897.20170112002

2017-01-12錄用日期2017-03-02

1673-5897(2017)3-282-08

X171.5

A

印春生(1963-)，男，博士，教授，主要研究方向?yàn)楹Ｑ蠡瘜W(xué)，發(fā)表學(xué)術(shù)論文100余篇。

同濟(jì)大學(xué)污染控制與資源化研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自主研究項(xiàng)目(PCRRK16007)；國(guó)家自然科學(xué)基金(21377096，21577105)；同濟(jì)大學(xué)英才(攀登)計(jì)劃(0400219287)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金( 0400219181) 資助

張躍恒(1992-), 男, 碩士研究生, 研究方向?yàn)槲⑸锒纠韺W(xué)，E-mail：M150306594@st.shou.edu.cn

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: csyin@shou.edu.cn

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