沈 興，潘 博，周揮銘，劉玲娟，田 杰

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院心內(nèi)科，重慶 400014；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒二科，四川瀘州 646000)

·生物信息學(xué)·

mmu-miR-3475-3P在心臟發(fā)育中的生物信息學(xué)分析*

沈 興1，2，潘 博1，周揮銘1，劉玲娟1，田 杰1

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院心內(nèi)科，重慶 400014；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒二科，四川瀘州 646000)

目的探討mmu--miR-3475-3P可能參與的生物學(xué)過程及信號(hào)通路。方法用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測(cè)定mmu-miR-3475-3P在小鼠胚胎心臟和成熟心臟中的表達(dá)。再綜合應(yīng)用TargetScan、miRDB、miRanda等常用microRNA在線數(shù)據(jù)庫對(duì)miR3475-3p進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，對(duì)所得靶基因進(jìn)行基因功能注釋(Go)和信號(hào)通路分析。結(jié)果mmu-miR-3475-3P在小鼠胚胎心臟和成熟心臟中存在明顯的表達(dá)差異，運(yùn)用TargetScan、miRDB、miRanda對(duì)miR3475-3P進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該microRNA可能調(diào)控441個(gè)靶基因。結(jié)論mmu-miR-3475-3P在小鼠胚胎心臟高表達(dá)，其預(yù)測(cè)的靶基因富集于多個(gè)信號(hào)通路及細(xì)胞生物學(xué)過程。

mmu-miR-3475-3P；生物信息學(xué)；靶基因；心臟發(fā)育

目前，心臟疾病的發(fā)病率逐年上升，已成為威脅人類健康的主要疾病之一[1]。對(duì)正常心臟發(fā)育過程的深入解析可為實(shí)現(xiàn)對(duì)心臟疾病的早期防治提供理論依據(jù)。心臟的構(gòu)建涉及多細(xì)胞、多基因，也受到遺傳與環(huán)境因素的共同影響。表觀遺傳作為遺傳與環(huán)境因素之間的橋梁在胚胎心臟發(fā)育過程中具有重要作用，特別是表觀遺傳中的microRNA被認(rèn)為廣泛參與了心臟的發(fā)育及疾病的發(fā)生、發(fā)展[2-5]。mmu-miR-3475-3P是本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)的在胎鼠心肌中高表達(dá)的microRNA，目前對(duì)其的研究較少。本研究擬通過生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)mmu-miR-3475-3P的關(guān)鍵靶基因和涉及的信號(hào)通道，為進(jìn)一步行mmu-miR-3475-3P在心臟發(fā)育中的功能、機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用清潔級(jí)昆明孕鼠，購于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[合格證號(hào)：SYXK(渝)2007-0016]。實(shí)驗(yàn)用引物均購自廣州市銳博生物科技有限公司，RNA酶抑制劑購自美國Thermo Scientific公司，脫氧核糖核苷三磷酸購自Tiangen公司，綠色熒光染料購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1mmu-miR-3475-3P表達(dá)量在胚胎鼠和成年鼠心臟中的檢測(cè) 以胚胎14.5 d的昆明小鼠(n=3)和生后21 d的成年昆明小鼠(n=3)為對(duì)象，用Trizol試劑提取總RNA，并利用紫外分光光度計(jì)K5500在OD260/280,OD260/230波長下進(jìn)行RNA質(zhì)檢，以該RNA作為模板，以1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成CDNA第1鏈，并以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)小鼠mmu-miR-3475-3P(MIMAT0015219)的編碼序列5′-UCU GGA GGC ACA UGG UUU GAA-3′設(shè)計(jì)合成PCR引物，按如下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)：95 ℃ 20 s、95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s、70 ℃ 1 s，共40個(gè)循環(huán)，繪制溶解曲線。以U6作為反應(yīng)內(nèi)參，microRNA的含量通過2-△△ct法定量計(jì)算。

1.2.2mmu-miR-3475-3P生物信息學(xué)分析 綜合應(yīng)用TargetScan、miRDB、miRanda等常用microRNA在線數(shù)據(jù)庫對(duì)mmu-miR3475-3p進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。對(duì)所得靶基因進(jìn)行基因功能注釋(gene ontology，Go)(http://www.geneontology.org/)，并建立起統(tǒng)計(jì)模型，分析整個(gè)基因組中最顯著的功能，計(jì)算這些基因在某(多)個(gè)特定的分支的超幾何關(guān)系，根據(jù)基因的GO 注釋，選擇本物種的所有基因作為背景基因，用超幾何分布計(jì)算P值，以P<0.05為顯著性閾值分別得到相對(duì)于背景具有統(tǒng)計(jì)意義的高頻率注釋，從而得到基因集合在GO類別上的分布信息和顯著性情況。將mmu-miR3475-3p的預(yù)測(cè)靶基因進(jìn)行基于Kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG，http://www.genome.jp/)的生物學(xué)通路數(shù)據(jù)分析，通過Fisher Exact Test計(jì)算P值，以P<0.05為顯著性閾值得到基因集合相對(duì)于背景具有統(tǒng)計(jì)意義的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及疾病通路。

“喂！放我出去！”步凡用力地敲擊著門板，但回應(yīng)他的，只有門外的嬉笑聲：“黃皮仔，你就在這里好好待著吧！明天早上掃地的人會(huì)來營救你的！”

2 結(jié) 果

人們根據(jù)第二摩崖石刻“永樂十八年領(lǐng)軍至此”“洪熙元年領(lǐng)軍至此”“宣德七年領(lǐng)軍至此”，普遍認(rèn)為劉清共三次來到船廠。

圖1 mmu--miR-3475-3P靶基因文恩交集圖

2.2mmu-miR-3475-3P生物信息學(xué)分析 運(yùn)用TargetScan、miRDB、miRanda對(duì)mmu-miR-3475-3P進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)分別獲得3 797、518、8 431個(gè)靶基因，設(shè)3個(gè)數(shù)據(jù)庫中共同預(yù)測(cè)的靶基因?yàn)楹蜻x基因，共441個(gè)(圖1)。針對(duì)靶基因的GO分析提示mmu-miR-3475-3P涉及多種生物學(xué)過程(圖2)，其中多個(gè)基因涉及心臟、血管發(fā)育、跨膜離子通道轉(zhuǎn)運(yùn)等(表1)。利用KEGG經(jīng)典生物通路數(shù)據(jù)庫對(duì)mmu-miR-3475-3P的靶基因進(jìn)行信號(hào)通路富集分析，結(jié)果提示441個(gè)靶基因參與廣泛的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括代謝通路、內(nèi)吞作用、Wnt信號(hào)通路、Hippo信號(hào)通路等，而其中與心血管發(fā)育密切相關(guān)的Wnt信號(hào)通路共涉及15個(gè)基因，Hippo信號(hào)通路共涉及8個(gè)基因，Notch信號(hào)通路共涉及2個(gè)基因，見表2。

2.1mmu-miR-3475-3P在胚胎小鼠和成年小鼠心肌中的表達(dá)量分析 mmu-miR-3475-3P在胎鼠14.5 d的心肌中的表達(dá)量明顯高于成年鼠心肌中的表達(dá)量，在胎鼠中的表達(dá)量為17.41±5.74，在成年鼠心肌中的表達(dá)量為1.00±0.54，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 mmu--miR-3475-3P靶基因生物學(xué)GO分析

項(xiàng)目P基因心臟起搏細(xì)胞的發(fā)育0.013Popdc2,Maml1冠狀血管的形成0.017Nrp1,Pdgfrb調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞跨膜電位0.021Atp2a2,Pml鉀離子內(nèi)流0.026Kcnj5,Atp1b2,Atp1b1心肌舒張0.026Atp1b1,Atp2a2依賴鈣離子信號(hào)的心肌收縮調(diào)控0.044Atp1b1,Atp2a2

表2 與心血管發(fā)育密切相關(guān)的KEGG經(jīng)典生物通路示例

3 討 論

microRNA是一類小分子非編碼的RNA分子，起到對(duì)基因表達(dá)的負(fù)性調(diào)控作用，廣泛參與細(xì)胞的分化、遷徙，組織器官的形成等。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)microRNA可能控制著約70%的生理過程，但只有小部分microRNA的靶基因及功能得到了初步闡述，大部分microRNA的功能仍然未知。研究未知microRNA對(duì)組織器官的發(fā)育及調(diào)控機(jī)制仍然十分重要。小鼠心臟因?yàn)榕c人類心臟相似，一直作為研究人類心臟的較好的動(dòng)物模型[6]。

本研究在前期研究中發(fā)現(xiàn)mmu-miR-3475-3P在小鼠胚胎期高表達(dá)，提示其可能參與了心臟的早期發(fā)育。對(duì)該microRNA的Go分析發(fā)現(xiàn)該microRNA的靶基因涉及popdc2、pdgfrb、Atp1b1、Atp2a2等基因。而目前的研究表面大部分基因與心臟發(fā)育及疾病形成有關(guān)。如研究表明popdc2是雞胚胎心臟發(fā)育成熟的標(biāo)志基因[7]，而且popdc2存在于大部分哺乳動(dòng)物的心臟，沉默popdc2基因表達(dá)可導(dǎo)致斑馬魚胚胎心臟和骨骼肌發(fā)育障礙[8]，沉默小鼠popdc2基因表達(dá)可導(dǎo)致心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)在應(yīng)激誘導(dǎo)下功能障礙，可誘發(fā)小鼠出現(xiàn)竇性心動(dòng)過緩[9]，下調(diào)popdc2表達(dá)可促進(jìn)新生大鼠心肌細(xì)胞增殖，促其進(jìn)入細(xì)胞循環(huán)參與心肌修復(fù)，且popdc2在心肌中表達(dá)很高，表達(dá)量在胚胎期較少，但生后隨著大鼠出生時(shí)間增加表達(dá)量逐漸升高[10]，與mmu-miR-3475-3P的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。對(duì)microRNA的信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)mmu-miR3475-3p的靶基因富集于心臟發(fā)育密切相關(guān)的Notch、Wnt、Hippo信號(hào)通路，已有大量研究揭示這些通路調(diào)控著心臟的發(fā)育進(jìn)程。如Notch信號(hào)通路調(diào)控心肌分化及心臟瓣膜、心室小梁，以及動(dòng)脈血管發(fā)育；Notch信號(hào)通路中基因JAG的突變將引起法洛四聯(lián)癥的發(fā)生[11-12]。而Wnt通路的異常是先天性心臟病的高風(fēng)險(xiǎn)因素[13-14],持續(xù)激活內(nèi)皮細(xì)胞的Wnt經(jīng)典信號(hào)通路可導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生等[15]。

(2)膠凝材料水化生成的凝膠對(duì)Pb2+的吸附作用，Pb2+以類質(zhì)同相進(jìn)入AFt和復(fù)鹽結(jié)構(gòu)內(nèi)部等的協(xié)同作用，是其固鉛效率顯著高于水泥的重要原因。

本研究證實(shí)了mmu-miR3475-3p在小鼠胚胎期和成年心肌中的表達(dá)有明顯差異。通過生物信息學(xué)分析揭示其可能參與心臟發(fā)育及疾病形成。但在生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析中，存在著假陽性或者假陰性結(jié)果。mmu-miR3475-3p是否在心臟發(fā)育中起到重要的調(diào)控作用仍需進(jìn)一步研究證實(shí)，包括經(jīng)典的過表達(dá)和沉默策略研究mmu-miR3475-3p對(duì)心肌細(xì)胞功能的影響，以及其他分子機(jī)制的研究等。

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Bioinformaticsanalysisformmu-miR-3475-3Pincardiacdevelopment*

ShenXing1,2,PanBo1,ZhouHuiming1,LiuLinjuan1,TianJie1

(1.DepartmentofCardiology,AffiliatedChildren′sHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400014,China;2.SecondDepartmentofPediatrics,AffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

ObjectiveTo investigate the mmu-miR-3475-3P possible participating in biology process and signal pathway.MethodsThe expression of mmu-miR-3475-3P in the mature mouse heart and in the embryonic mouse heart was measured by qRT-PCR.The target genes were predicted through comprehensively using the common microRNA on-line databases such as TargetScan,miRDB and miRanda,and then the obtained targeted genes were performed the gene function annotation and signal pathway analysis.ResultsThere was significant difference between the expression of mmu-miR-3475-3P in the embryonic mouse heart and the expression in the mature heart.Bioinformatics analysis by using TargetScan,miRDB and MiRanda on miR3475-3P revealed that microRNA was likely to regulate 441 target genes.Conclusionmmu-miR-3475-3P is highly expressed in the embryonic mouse heart.The target genes predicted by mmu-miR-3475-3P are enriched in multiple signal pathways and cellular biological processes.

mmu-miR-3475-3P;bioinformatics analysis;target gene;cardiomyogenesis

R725.4

A

1671-8348(2017)26-3671-03

2017-02-22

2017-06-21)

《重慶醫(yī)學(xué)》對(duì)臨床研究論文醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求

《重慶醫(yī)學(xué)》編輯部

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.26.025

瀘州市科技廳-西南醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合課題[2015lzcyds05(9/12)]。

沈興(1976-)，副教授，在讀博士，主要從事兒童心血管疾病基礎(chǔ)與臨床方面研究。

凡投本刊的涉及人的生物醫(yī)學(xué)研究論文，作者應(yīng)說明所在用的試驗(yàn)程序是否經(jīng)過倫理審查委員會(huì)(單位性的、地區(qū)性的或國家性的)評(píng)估，注明批準(zhǔn)號(hào)。涉及患者(受試者)的應(yīng)簽訂知情同意書。