魏莉平,王鍍津,鄒甜甜,費(fèi)安興△

(1.湖北省黃石市婦幼保健院團(tuán)城山院區(qū)檢驗(yàn)科 435000;2.湖北省黃石市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科 435000)

論著·基礎(chǔ)研究

TLS9a核酸適配體對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞的靶向作用研究

魏莉平1,王鍍津2,鄒甜甜1,費(fèi)安興1△

(1.湖北省黃石市婦幼保健院團(tuán)城山院區(qū)檢驗(yàn)科 435000;2.湖北省黃石市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科 435000)

目的探討TLS9a核酸適配體對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞的靶向作用。方法制備馬來酰亞胺修飾的裝載阿霉素的脂質(zhì)體(liposome)，合成FITC熒光及巰基修飾的TLS9a核酸適配體，并將其耦聯(lián)到脂質(zhì)體表面。紫外分光光度法檢測(cè)阿霉素包封率。動(dòng)態(tài)光散射法(DLS)測(cè)納米粒子粒徑大小及電位分布，倒置熒光顯微鏡觀察小鼠肝癌細(xì)胞對(duì)阿霉素?cái)z入及用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)平均熒光強(qiáng)度，評(píng)估小鼠肝癌細(xì)胞對(duì)藥物攝入量。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞活性。結(jié)果流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TLS9a核酸適配體與BNL.1ME.A.7R.1小鼠肝癌細(xì)胞結(jié)合率為54.1%,TLS9a耦聯(lián)的脂質(zhì)體平均粒徑分布在(116.0±5.0)nm。TLS9a-liposome/DOX在pH 5.0的環(huán)境中可以快速釋放化療藥物DOX，72 h藥物釋放量超過70%。TLS9a-liposome/DOX在體外能夠有效抑制小鼠肝癌細(xì)胞BNL.1ME.A.7R.1生長(zhǎng)。結(jié)論TLS9a核酸適配體可以特異性與小鼠肝癌細(xì)胞BNL.1ME.A.7R.1結(jié)合，可用于檢測(cè)小鼠肝癌細(xì)胞。

肝腫瘤；核酸適配體；TLS9a；靶向治療；小鼠肝癌細(xì)胞

盡管化療藥物廣泛應(yīng)用于癌癥治療，但由于他們不具備腫瘤特異性，而在臨床的應(yīng)用中受到限制。因此，發(fā)展有效且具有主動(dòng)靶向功能的化療藥物運(yùn)輸平臺(tái)成為納米醫(yī)藥領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。寡核苷酸適配體不僅能提供與抗體類似的結(jié)合效率，同時(shí)具備低免疫原、高穩(wěn)定、合成簡(jiǎn)單和易改等優(yōu)點(diǎn)，是應(yīng)用于靶向藥物釋放的一種較好的選擇。TLS9a適配體是由Shangguan等[1]于2008年利用cell-SELEX技術(shù)篩選出的一種核酸適配體，其序列為5′-AGT CCA TTT TAT TCC TGA ATA TTT GTT AAC CTC ATG GAC-3′，能夠特異性地與小鼠肝癌細(xì)胞系BNL.1ME.A.7R.1結(jié)合，而與小鼠胚胎肝細(xì)胞BNL.CL.2結(jié)合能力弱，是一種具有潛在應(yīng)用價(jià)值的靶向分子。本研究將熒光標(biāo)記的TLS9a核酸適配體應(yīng)用于流式細(xì)胞技術(shù)來檢測(cè)游離單個(gè)小鼠肝癌細(xì)胞，為小鼠肝癌細(xì)胞的檢測(cè)和診斷提供了新的思路。同時(shí)，本課題組利用TLS9a核酸適配體作為主動(dòng)靶向分子，成功構(gòu)建TLS9a核酸適配體耦聯(lián)的脂質(zhì)體，并在體外考察其藥物釋放及抗小鼠肝癌細(xì)胞效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿(POPC)、二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000 (PEG2000-DSPE)、α-生育酚(α-tocopherol)、二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000-馬來酰亞胺(MAL-PEG2000-DSPE)購(gòu)自美國(guó)Avanti公司；FITC與巰基雙標(biāo)的TLS9a核酸適配體購(gòu)自上海生物工程股份有限公司；阿霉素(DOX)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。其他試劑為實(shí)驗(yàn)室常用分析純級(jí)。

1.1.2細(xì)胞 BNL.1ME.A.7R.1小鼠肝癌細(xì)胞系，BNL.CL.2小鼠胚胎肝細(xì)胞系購(gòu)自ATCC中國(guó)代理公司。

1.2方法

1.2.1流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)核酸適配體與小鼠肝癌細(xì)胞結(jié)合率 收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的BNL.1ME.A.7R.1 和BNL.CL.2細(xì)胞(1×106)，重懸在50 μL清洗緩沖液中[4.5 g/L葡萄糖和5 mmol/L MgCl2的磷酸鹽緩沖液(PBS)]，同時(shí)加入40 μL黏附緩沖液[0.2 mg/mL轉(zhuǎn)移核糖核酸酵母(yeast tRNA)和2.0 mg/mL牛血清清蛋白(BSA)的清洗緩沖液]和10 μL胎牛血清。加入FITC標(biāo)記的TLS9a適配體，使其終濃度為25 nmol/L。4 ℃孵育30 min。用清洗緩沖液清洗3次，最后細(xì)胞重懸在500 μL清洗緩沖液中上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.2馬來酰亞胺修飾的脂質(zhì)體(TSL9a-liposome)制備 10 μmol脂質(zhì)體(POPC∶PEG2000-DSPE∶α-tocopherol∶MAL-PEG2000-DSPE 物質(zhì)量比例為1.0∶1.0∶0.1∶0.1)溶解在1 mL氯仿中。加到圓底燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上抽真空10 min使氯仿完全揮發(fā)。室溫真空干燥4 h，取出加入1 mL的D-Hank′s緩沖液(pH 6.5)超聲波恒溫水浴5 min，使其形成脂質(zhì)體懸液，將上述溶液加入擠推器中的玻璃注射器中，分別過孔徑為200 nm及100 nm的聚碳酸酯膜各20次以上，即得到馬來酰亞胺修飾的脂質(zhì)體。

1.2.3TLS9a核酸適配體耦聯(lián)的脂質(zhì)體制備 將TLS9a和MAL-PEG2000-DSPE(1∶10)加入到上述制備的馬來酰亞胺修飾的從脂質(zhì)體中，混勻，氮?dú)獗Ｗo(hù)下4 ℃孵育24 h，最后產(chǎn)物用超濾濃縮管(3 500 MWCO)清洗3次,去除未結(jié)合的小分子物質(zhì),產(chǎn)物4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4TLS9a-liposome包封DOX 將脂質(zhì)體pH值調(diào)整到7.5，與脂質(zhì)體按照物質(zhì)量比例為1∶10加入，37 ℃振蕩孵育4 h,透析去除未包封的DOX，終產(chǎn)物4 ℃保存?zhèn)溆?。紫外分光光度法檢測(cè)上清液中DOX水平，計(jì)算包封率。

1.2.5適配體修飾的脂質(zhì)體粒徑電位檢測(cè) 利用動(dòng)態(tài)光散射法(DLS)測(cè)量納米材料的粒徑和電位分布圖。取適量脂質(zhì)體溶于1 mL去離子水，25 ℃環(huán)境下檢測(cè)納米材料粒徑和電位分布，重復(fù)3次。

1.2.6納米材料體外藥物釋放考察 分別配置pH 7.4和pH 5.0的PBS，將載藥脂質(zhì)體濃度調(diào)整到1 mg DOX/mL濃度，加入到透析袋中(截留相對(duì)分子質(zhì)量為3 500)，分別置于30 mL pH 7.4和pH 5.0的PBS中。在避光條件下，37 ℃ 100 r/min水浴振蕩。在預(yù)定的時(shí)間取500 μL透析液用熒光光度計(jì)測(cè)算藥物釋放量。重復(fù)3次計(jì)算平均值。

1.2.7評(píng)估DOX攝入量 在6孔板內(nèi)接種BNL.1ME.A.7R.1(3×105/孔)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，分別加入終濃度為10 μg/mL的liposome/DOX、TLS9a-liposome/DOX,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)1 h，收集細(xì)胞，PBS洗3次，500 μL重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)每組收集的10 000細(xì)胞，得到DOX熒光強(qiáng)度。分別收集上述細(xì)胞1×106，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，0.2 mg/mL 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色15 min，PBS重懸，1 000 r/min離心6 min，清洗3次，倒置熒光顯微鏡下觀察小鼠肝癌細(xì)胞對(duì)DOX的攝入量。

1.2.8MTT法評(píng)估靶向藥物體外殺傷效果 BNL.1ME.A.7R.1細(xì)胞(1×104/孔)接種于96孔板，每組重復(fù)8孔，37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)24 h，分別加入不同濃度的DOX、liposome/DOX、TLS9a -liposome/DOX，再培養(yǎng)24 h，移除培養(yǎng)液，加入100 μL不含血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，20 μL MTT液，培養(yǎng)4 h，吸棄上清液，每孔加入100 μL DMSO，100 r/min室溫?fù)u床振蕩10 min。酶標(biāo)儀上490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值。計(jì)算細(xì)胞活力。

2 結(jié) 果

2.1TLS9a用于檢測(cè)小鼠肝癌細(xì)胞 TLS9a核酸適配體可以特異性地與BNL.1ME.A.7R.1小鼠肝癌細(xì)胞結(jié)合，25 nmol/L時(shí)的結(jié)合率為54.1%，而與正常的小鼠胚胎肝細(xì)胞BNL.CL.2的結(jié)合率只有6.4%，見圖1。

A:BNL.CL.2細(xì)胞(對(duì)照);B:BNL.CL.2細(xì)胞與25 nmol/L FITC標(biāo)記的TLS9a核酸適配體;C:BNL.1ME.A.7R.1細(xì)胞(對(duì)照);D:BNL.1ME.A.7R.1細(xì)胞與25 nmol/L FITC標(biāo)記的TLS9a核酸適配體

圖1流式細(xì)胞儀檢測(cè)TLS9a與小鼠肝癌細(xì)胞的結(jié)合率

2.2TLS9a核酸適配體耦聯(lián)的脂質(zhì)體表征 本實(shí)驗(yàn)中制備的TLS9a-liposome粒徑和電位分布如圖2所示。liposome納米材料粒徑分布在(109.0±3.1)nm,TLS9a -liposome納米材料粒徑分布在(116.0±5.0)nm;liposome電位分布在+30 mV左右，TLS9a-liposome電位分布在-23 mV左右，見圖2。

A：liposome粒徑分布圖;B：liposome電位分布圖;C：TLS9a-liposome粒徑分布圖;D：TLS9a-liposome電位分布圖

圖2 DLS檢測(cè)liposome及TLS9a-liposome納米粒子粒徑和電位分布圖

2.3TLS9a-liposome體外藥物釋放測(cè)定 TLS9a-liposome在pH 7.4的環(huán)境中72 h內(nèi)藥物釋放不超過20%，而在pH 5.0的環(huán)境中累積釋放超過70%，人體體液循環(huán)中的pH值接近7.4，腫瘤微環(huán)境中pH值處于酸性環(huán)境,見圖3。

2.4TLS9a-liposome靶向釋放藥物測(cè)定 修飾后TLS9a-liposome能明顯提高小鼠肝癌細(xì)胞對(duì)DOX的攝入量。圖4A中藍(lán)色為細(xì)胞核，紅色為DOX，可見耦聯(lián)TLS9a-liposome組紅色熒光明顯強(qiáng)于未修飾靶向分子組；TLS9a-liposome組細(xì)胞內(nèi)DOX熒光曲線明顯右移，見圖4B。

圖3 TLS9a -liposome/DOX納米材料在不同pH值下藥物釋放結(jié)果

A：熒光顯微鏡檢測(cè)DOX攝入量；B：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)藥物攝入量

圖4 BNL.1ME.A.7R.1小鼠肝癌細(xì)胞DOX攝入效果評(píng)估

*：P<0.05，與liposome/DOX比較

圖5 MTT法檢測(cè)結(jié)果

2.5MTT法檢測(cè)不同濃度的TLS9a-liposome/DOX對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞抑制率 TLS9a-liposome/DOX比liposome/DOX對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞抑制能力更強(qiáng)，見圖5。

3 討 論

核酸適配體在生物傳感、生物檢測(cè)和生物靶向治療方面受到越來越多的重視[2-6]。適配體是小的DNA或RNA鏈，免疫原性極低，對(duì)人體無毒副作用?，F(xiàn)今的技術(shù)可以篩選得到很多針對(duì)人肝癌的特異性適配體，將其應(yīng)用到生物醫(yī)藥靶向診治領(lǐng)域前景極其廣闊，必將產(chǎn)生極大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效應(yīng)。利用核酸適配體構(gòu)建各種新型的生物傳感器用于腫瘤檢測(cè)的研究也給臨床診斷帶來了新的希望[7-8]。

本研究在核酸適配體TLS9a上修飾FITC熒光基團(tuán)，通過流式細(xì)胞術(shù)可以用于檢測(cè)BNL.1ME.A.7R.1小鼠肝癌細(xì)胞。相對(duì)于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，核酸適配體價(jià)格低廉、合成簡(jiǎn)單、易于修飾，為腫瘤的臨床診斷與檢測(cè)方法提供了新的思路[9]。脂質(zhì)體是一種已經(jīng)應(yīng)用于臨床的傳統(tǒng)納米材料，具有很好的生物相容性，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域[10-11]。DOX因其極大的不良反應(yīng)而在臨床上受到極大限制[12-13]。本實(shí)驗(yàn)通過在脂質(zhì)體表面修飾TLS9a核酸適配體，實(shí)現(xiàn)化療藥物的主動(dòng)靶向釋放，使小鼠肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的攝入量增加，從而提高化療藥物對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞的殺傷效果。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)TLS9a-liposome/DOX在模擬體內(nèi)pH7.4環(huán)境時(shí)藥物釋放量很低，而在腫瘤局部酸性環(huán)境下可以快速持久釋放藥物，這說明TLS9a-liposome納米材料在體循環(huán)中能保持相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，并能減少化療藥物在到達(dá)腫瘤部位前的泄露，從而避免化療藥物對(duì)人體產(chǎn)生較大的不良反應(yīng)。伴隨著生物靶向治療的興起，適配體修飾的各種靶向載體必將不斷涌現(xiàn)[14-15]，這為生物靶向治療提供了很好的發(fā)展契機(jī)。

綜上所述，標(biāo)記熒光基團(tuán)的TLS9a核酸適配體可以用于小鼠肝癌細(xì)胞的檢測(cè)，并且TLS9a-liposome/DOX納米載體可以有效靶向釋放化療藥物，從而提高化療藥物對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞的殺傷能力。隨著篩選方法的不斷創(chuàng)新，新型的適配體也將源源不斷出現(xiàn)，這將給臨床對(duì)腫瘤的診斷檢測(cè)和納米醫(yī)藥領(lǐng)域的發(fā)展提供新的機(jī)遇。

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TargetingeffectofTLS9anucleicacidaptameronmicehepaticcancercells

WeiLiping1,WangDujin2,ZouTiantian1，F(xiàn)eiAnxing1△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,TuanchengshanBranchHospital,HuangshiMunicipalMaternalandChildHealthCareHospital,Huangshi,Hubei435000,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,HuangshiMunicipalCentralHospital,Huangshi,Hubei435000,China)

ObjectiveTo investigate the targeting effect of TLS9a nucleic acid aptamer on mice hepatic cancer cells.MethodsThe liposome modified with maleimide and loading doxorubicin(DOX) was prepared,then TLS9a nucleic acid aptamer modified by FITC fluorescence and sulfydryl was synthesized,which was coupled to the liposome surface.The entrapment efficiency of DOX was detected by UV spectrophotometry.The dynamic light scattering(DLS) was applied to measure the particle size of nanoparticles and the potential distribution.The uptake of DOX in mice hepatic cancer cells was detected by the Nikon inverted microscope and the mean fluorescence intensity of liposome/DOX and TLS9a -liposome/DOX was detected by flow cytometry.The cells activity was detected by MTT.ResultsFlow cytometry assay showed that the binding rate of TLS9a nucleic acid aptamer with BNL.1ME.A.7R.1 mice hepatic cancer cells was 54.1%.TLS9a-liposome particle size distribution was in (116.0±5.0)nm.TLS9a-liposome/DOX released DOX quickly at pH 5.0,and the release amount in 72 h was more than 70% of the total release amount.TLS9a-liposome/DOX effectively inhibited the growth of mice hepatic cancer cells BNL.1ME.A.7R.1.ConclusionTLS9a nucleic acid aptamer could specifically combined with mice hepatic cancer cells BNL.1ME.A.7R.1,which could be used to detect mice hepatic cancer cells.

liver neoplasms;nucleic acid aptamer;TLS9a;targeted therapy;mice hepatic cancer cells

R73-36

A

1671-8348(2017)26-3623-03

2017-02-18

2017-06-06)

魏莉平(1986-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事腫瘤生物靶向診斷方面研究?！?/p>

，E-mail:809427843@qq.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.26.008