南文金，黃健強(qiáng)，吳靜波，胡鴻惠，彭國(guó)良，肖正中

（1. 韶關(guān)學(xué)院動(dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)室，廣東 韶關(guān) 512005；2. 粵北生豬生產(chǎn)及疫病防控協(xié)同創(chuàng)新發(fā)展中心，廣東 韶關(guān) 512005）

粵北地區(qū)仔豬腹瀉源大腸桿菌毒力基因檢測(cè)及致病性初步研究

南文金1，2，黃健強(qiáng)1，2，吳靜波1，2，胡鴻惠1，2，彭國(guó)良2，肖正中2

（1. 韶關(guān)學(xué)院動(dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)室，廣東 韶關(guān) 512005；2. 粵北生豬生產(chǎn)及疫病防控協(xié)同創(chuàng)新發(fā)展中心，廣東 韶關(guān) 512005）

采用PCR方法對(duì)56株仔豬黃白痢源大腸桿菌腸毒素和耶爾森菌強(qiáng)毒力島（HPI）相關(guān)毒力因子STa、STb、LT和irp2進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而根據(jù)毒力因子基因型對(duì)部分菌株進(jìn)行致病性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，38株受試菌檢測(cè)到毒力因子，其中STa基因陽(yáng)性率為3.57%，STb基因陽(yáng)性率為53.57%，LT基因陽(yáng)性率為7.14%，irp2基因陽(yáng)性率為21.43%，檢測(cè)的毒力因子表現(xiàn)為5種基因型，主要的毒力因子基因型是STb和STb+irp2。致病性試驗(yàn)顯示毒力基因陽(yáng)性菌株均對(duì)小白鼠具有致病性。結(jié)果表明，粵北地區(qū)致仔豬黃白痢大腸桿菌流行的主要毒力因子為STb，其次為irp2、少數(shù)菌株攜帶STa和LT毒力因子，相關(guān)毒力基因檢測(cè)可以作為快速確定大腸桿菌致病性的重要依據(jù)。

大腸桿菌；腸毒素；強(qiáng)毒力島；毒力基因；致病性

Abstract：Enterotoxin virulence-related gene （STa，STb and LT） and HPI gene （irp2） of 56 strains of Escherichia coli isolated from piglets with diarrhea were detected by corresponding PCR，and part of strains were chosen according to virulence factors gene-type for animal pathogenicity test. The results showed that 38 strains had virulence genes，the positive rates of STa，STb，LT and irp2 genes respectively were 3.57%，53.57%，7.14% and 21.43%. There were 5 virulence factors genotypes，the major genotypes were STb and STb+irp2.The pathogenicity test showed that positive strains had pathogenicity to mice. In north Guangdong，the major virulence factors of pathogenic E. coli from diarrhea piglets were STa and irp2，a few strains carried STa and LT，some isolates expressed two virulence factors. Detection of virulence genes was an important reference for rapid determining pathogenicity of E. coli.

Key words：Escherichia coli；enterotoxin；high pathogenicity island；virulence genes；pathogenicity

大腸桿菌是一種重要人獸共患病原菌，原發(fā)或繼發(fā)感染致病性大腸桿菌引起的仔豬腹瀉（黃白?。┦丘B(yǎng)豬生產(chǎn)中常見(jiàn)的一種細(xì)菌性疾?。?］。大腸桿菌是一種條件性致病菌，常由陰冷潮濕、晝夜溫差大、轉(zhuǎn)群換料等環(huán)境和應(yīng)激因素導(dǎo)致仔豬發(fā)病和死亡。大腸桿菌引起的仔豬腹瀉因發(fā)病日齡不同表現(xiàn)出不同的臨床癥狀和特點(diǎn)，仔豬黃痢主要發(fā)生在7日齡內(nèi)新生仔豬，仔豬白痢主要發(fā)生在1周齡到斷奶哺乳仔豬［2］。豬場(chǎng)發(fā)生仔豬黃白痢，如果控制措施不科學(xué)及時(shí)，往往導(dǎo)致病原在分娩舍傳播，仔豬大批死亡。

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）是導(dǎo)致仔豬發(fā)生黃白痢的主要致病性大腸桿菌，ETEC主要毒力因子是菌毛和腸毒素，大腸桿菌通過(guò)菌毛在腸道組織上皮細(xì)胞定殖，定殖到腸道組織上皮細(xì)胞的大腸桿菌繁殖過(guò)程產(chǎn)生的腸毒素相關(guān)毒力因子（STa、STb和LT）是造成仔豬腹瀉直接原因［3-4］。此外，研究表明，攜帶HPI的大腸桿菌也是導(dǎo)致人和多種動(dòng)物腹瀉重要毒力因子［5］。

為了解粵北地區(qū)仔豬黃白痢大腸桿菌主要毒力因子流行情況，豐富我國(guó)大腸桿菌分子流行病學(xué)資料，本試驗(yàn)對(duì)分離自粵北地區(qū)疑似仔豬黃白痢病的致病性大腸桿菌進(jìn)行毒力因子STa、STb、LT和irp2（HPI標(biāo)志性基因）進(jìn)行檢測(cè)，以期掌握粵北地區(qū)仔豬腹瀉源大腸桿菌毒力因子流行情況以及基因型，分析菌株致病性和毒力因子間關(guān)系，豐富有關(guān)豬源大腸桿菌分子流行病學(xué)資料，為該病的防控及新型疫苗研究方向提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌株：大腸桿菌參考菌株C83903（LT+、STb+），C83920（STa+）購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所，由韶關(guān)學(xué)院動(dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)室保存，HPI+參考菌株為該實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)測(cè)序鑒定的一株irp2基因陽(yáng)性的豬源大腸桿菌；試驗(yàn)用大腸桿菌為2015—2016年分離自粵北地區(qū)多個(gè)豬場(chǎng)疑似黃白痢病的仔豬糞便和腸道內(nèi)容物中，經(jīng)生化試驗(yàn)和分子鑒定為大腸桿菌。

主要試劑：麥康凱培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯為廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品；2×PCR Mix、DNA Marker為廣州東盛生物科技有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖為sigma公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物序列 參照文獻(xiàn)［6-7］合成用于擴(kuò)增大腸桿菌毒力基因STa、STb、LT和irp2的引物序列（表1），引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

表1 大腸桿菌毒力基因擴(kuò)增引物序列

1.2.2 DNA 模版制備 參考菌株和試驗(yàn)菌株接種于麥康凱培養(yǎng)基上，37℃ 培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單個(gè)菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min 搖床震蕩培養(yǎng)16 h，取培養(yǎng)物1.5 mL，10 000 r/min離心5 min，棄上清，加入0.2 mL滅菌去離子水用振蕩器重懸菌體，水中煮沸10min，12 000 r/min離心5 min，吸取上清于另一只滅菌的1.5 mL離心管中，-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR反應(yīng)條件優(yōu)化 在20 μL的PCR反應(yīng)體系中加入2×PCR Mix 10 μL，參考菌株DNA模版2 μL，10 pmol/μL的上下游引物各1 μL，超純水6 μL，對(duì)4對(duì)引物PCR擴(kuò)增退火溫度進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，確定最佳退火溫度。

1.2.4 毒力因子檢測(cè) 用優(yōu)化后的PCR反應(yīng)條件對(duì)56株試驗(yàn)大腸桿菌STa、STb、LT和irp2等4種毒力因子進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 致病性試驗(yàn) 選擇攜帶STa、STb、LT和irp2毒力因子基因型不同受試菌各一株，未檢測(cè)到毒力因子的受試菌中選擇3株來(lái)源不同豬場(chǎng)分離菌株，共計(jì)8個(gè)試驗(yàn)菌株分別接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37℃ 搖床震蕩培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（約8 h），取0.5 mL 培養(yǎng)菌液10 000 r/min離心5 min，棄上清，加入滅菌生理鹽水重懸菌體，離心棄上清，反復(fù)3次，最后用0.5 mL生理鹽水稀釋菌體，腹腔接種健康昆明小鼠，每一個(gè)菌株同時(shí)接種3只小鼠，另設(shè)生理鹽水對(duì)照，每組處理分籠飼養(yǎng)在相同環(huán)境中。

2 結(jié)果與分析

2.1 腸毒素相關(guān)毒力因子檢測(cè)

運(yùn)用PCR方法對(duì)56株試驗(yàn)大腸桿菌腸毒素毒力因子STa、STb、LT基因分別進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，STa基因陽(yáng)性菌2株，STb基因陽(yáng)性菌30株，LT基因陽(yáng)性菌4株，占受試菌株的比例分別為3.57%、53.57%、7.14%（圖1）。檢測(cè)結(jié)果表明在粵北地區(qū)仔豬黃白痢源大腸桿菌主要流行腸毒素毒力因子為STb，僅少數(shù)菌株攜帶STa、LT基因。

圖 1 STa基因、STb基因和PLT基因CR擴(kuò)增

2.2 強(qiáng)毒力島檢測(cè)

運(yùn)用PCR方法對(duì)56株試驗(yàn)菌株HPI標(biāo)志基因irp2進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，有12株試驗(yàn)菌株為陽(yáng)性，占受試菌株的21.43%（圖2）。檢測(cè)結(jié)果表明，HPI陽(yáng)性菌株在仔豬黃白痢源大腸桿菌中也占有一定比例，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)該類(lèi)菌株對(duì)仔豬危害性研究與評(píng)估。

2.3 毒力因子基因型

圖2 irp2基因PCR擴(kuò)增

56株試驗(yàn)菌株中有38株為ETEC或HPI毒力基因陽(yáng)性菌株，將陽(yáng)性菌株按攜帶STa、STb、LT和irp2等4種毒力因子種類(lèi)進(jìn)行分類(lèi)，共組成5種毒力基因型，為單獨(dú)攜帶一種毒力因子或同時(shí)攜帶兩種毒力因子，其中以?xún)H攜帶STb毒力基因的為主要毒力基因型，其次為STb+irp2基因型（表2）?；蛐徒Y(jié)果分析表明，ETEC和HPI毒力基因陽(yáng)性菌株雖然組成5種毒力基因型，但攜帶單一毒力因子占菌株數(shù)量73.68%（28/38），在攜帶兩種毒力基因的菌株中，以同時(shí)攜帶一種腸毒素基因（STb）和強(qiáng)毒力島基因（irp2）為主，未發(fā)現(xiàn)同時(shí)攜帶3種以上毒力基因的菌株。

表 2 ETEC和HPI陽(yáng)性菌毒力因子基因型

2.4 致病性試驗(yàn)

STa、STb、LT和irp2 等4種毒力因子組合的5個(gè)毒力基因型菌株在8～48 h內(nèi)致接種小鼠發(fā)病死亡，死亡高峰在12～24 h間。接種未攜帶以上4種毒力因子菌株的3組小鼠中有1組小鼠也在48 h內(nèi)發(fā)病死亡，其余2組和對(duì)照組小鼠正常生長(zhǎng)。動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)檢測(cè)相關(guān)毒力因子可以為臨床仔豬黃白痢快速診斷提供依據(jù)，但毒力基因型與菌株毒力間關(guān)系還需要進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論與討論

通過(guò)對(duì)大腸桿菌腸毒素和耶爾森菌強(qiáng)毒力島相關(guān)毒力因子檢測(cè)，明確了粵北地區(qū)致仔豬黃白痢大腸桿菌流行的主要毒力因子為STb，其次為irp2、少數(shù)菌株攜帶STa和LT毒力因子，致病性相關(guān)試驗(yàn)表明毒力基因檢測(cè)方法對(duì)仔豬大腸桿病的快速診斷有重要參考價(jià)值。

定殖于仔豬腸道上皮細(xì)胞的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ETEC）繁殖過(guò)程中產(chǎn)生和釋放腸毒素，腸毒素改變腸道細(xì)胞的吸收和分泌功能，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，從而導(dǎo)致大量水分和電解質(zhì)流向腸腔，臨床上表現(xiàn)為水樣腹瀉，因此，腸毒素是導(dǎo)致腹瀉的直接毒力因子［3，8］。從仔豬黃白痢樣品中分離大腸桿菌并快速確定其是否為致病菌株，根據(jù)致病菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果采用有效的藥物防控該病傳播在生產(chǎn)實(shí)踐中有重要意義，而對(duì)臨床分離菌株腸毒素相關(guān)基因檢測(cè)可以快速確定是否為ETEC菌株的重要依據(jù)［9］。

腸毒素主要分為耐熱腸毒素（STa和STb）和不耐熱腸毒素（LT）［1］。本研究檢測(cè)的大腸桿菌STb基因陽(yáng)性率為53.75%，要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于STa和LT陽(yáng)性率。這一結(jié)果和2012年蘇中地區(qū)以及2014年山西豬源大腸桿菌腸毒素毒力因子分布報(bào)道有一致性［10-11］，都為STb陽(yáng)性率要高于STa和LT。但這兩個(gè)地區(qū)報(bào)道的STa和LT陽(yáng)性率都要高于本研究對(duì)粵北地區(qū)調(diào)查結(jié)果。陳祥等［12］2003年對(duì)江蘇、江西、安徽等華東地區(qū)初生仔豬腹瀉源大腸桿菌腸毒素相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè)，主要腸毒素基因?yàn)镾Ta和STb，分別占分離菌株的51.72%和37.24%；近幾年陜西省部分地區(qū)以及上海仔豬腹瀉源大腸桿菌主要毒力因子是STa，少量分離菌株中檢測(cè)到STb和LT毒力因子［8，13］；2015年皖北地區(qū)仔豬大腸桿菌毒力因子檢測(cè)結(jié)果顯示STa和STb比例分別為8.82%和5.88%，兩種耐熱腸毒素毒力因子流行率差別不大［14］。此外，以上不同地區(qū)的調(diào)查報(bào)道中都可以檢測(cè)到少數(shù)同時(shí)表達(dá)兩種或以上腸毒素毒力因子的菌株，這和本試驗(yàn)結(jié)果相同。以上數(shù)據(jù)比較分析可知，不同地區(qū)豬源大腸桿菌的腸毒素毒力因子流行情況不同，這種差異除受到空間影響外，是否和時(shí)間因素有關(guān)不得而知，因?yàn)槲覈?guó)對(duì)豬源大腸桿菌腸毒素毒力因子流行病學(xué)報(bào)道相對(duì)較少，更缺乏一定區(qū)域內(nèi)比較系統(tǒng)的豬大腸桿菌毒力因子分子流行病學(xué)監(jiān)測(cè)研究，相關(guān)報(bào)道都是個(gè)別地區(qū)一個(gè)較短時(shí)期內(nèi)豬大腸桿菌毒力因子流行病學(xué)調(diào)查。

HPI毒力島最早發(fā)現(xiàn)于耶爾森菌屬，后來(lái)發(fā)現(xiàn)在多種腸桿菌屬的細(xì)菌中存在，是導(dǎo)致人和多種動(dòng)物腹瀉的一種重要毒力因子［15-16］。irp2基因是HPI 毒力島主要結(jié)構(gòu)蛋白，可以作為檢測(cè)HPI的標(biāo)志基因［9］。本試驗(yàn)菌株irp2基因陽(yáng)性率為21.43%，低于高小攀等對(duì)仔豬腹瀉樣品中irp2陽(yáng)性率達(dá)到62%報(bào)道，但高于山西和廣東豬源大腸桿菌的HPI陽(yáng)性率15.5%和16.51% 報(bào)道［11，17］。分析產(chǎn)生以上差異原因主要有兩個(gè)方面，首先是不同地區(qū)HPI毒力島流行情況差異，其次是檢測(cè)使用的樣品類(lèi)型，樣本DNA來(lái)源于仔豬腹瀉樣品還是分離鑒定的菌株、菌株是否具有致病性都可能對(duì)檢測(cè)結(jié)果有影響。

大腸桿菌菌株中檢測(cè)到的4種毒力因子STa、STb、 LT和 irp2占受試菌的67.86%（38/56），ETEC和HPI陽(yáng)性菌株毒力因子基因型有5種，其中STb和STb+irp2兩種基因型組合占陽(yáng)性菌株近80%，是該地區(qū)仔豬黃白痢大腸桿菌主要毒力基因型。動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果表明攜帶毒力因子菌株均可致健康昆明小白鼠發(fā)病死亡，因致病性試驗(yàn)中未對(duì)接種細(xì)菌濃度進(jìn)行測(cè)定，只能初步證明菌株是否具有致病性結(jié)論，其毒力因子及其基因型與菌株毒力強(qiáng)弱間關(guān)系還需進(jìn)一步研究。部分沒(méi)有檢測(cè)到腸毒素和毒力島相關(guān)毒力基因的菌株對(duì)小鼠致病性可能是由其他毒力因子導(dǎo)致的，如粘附素、內(nèi)毒素、外膜蛋白、溶血素、寡肽毒素等都能導(dǎo)致動(dòng)物發(fā)?。?8］。

開(kāi)展大腸桿菌毒力因子檢測(cè)及分子流行病學(xué)調(diào)查研究，不但可以為該病的診斷防控、基因工程疫苗研究方向提供依據(jù)，同時(shí)大腸桿菌是一種重要人獸共患病原菌，研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌攜帶的某些毒力因子可能和細(xì)菌耐藥性也有關(guān)系［19］，表達(dá)重要毒力因子的動(dòng)物源大腸桿菌可以通過(guò)食物鏈傳遞和擴(kuò)散給人類(lèi)，對(duì)人類(lèi)健康帶來(lái)隱患和威脅［20］。所以，開(kāi)展不同動(dòng)物源的大腸桿菌毒力因子流行病學(xué)檢測(cè)研究，對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)和公共衛(wèi)生都具有重要意義。

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（責(zé)任編輯 楊賢智）

Detection of virulence genes of Escherichia coli strains isolated
from piglets with diarrhea in north Guangdong and
preliminary study on their pathogenicity

NAN Wen-jin1，2，HUANG Jian-qiang1，2，WU Jing-bo1，2，HU Hong-hui1，2，PENG Guo-liang2，XIAO Zheng-zhong2
（1. Laboratory of Animal Disease，Shaoguan University，Shaoguan 512005，China；2.North Guangdong Collaborative Innovation and Development Center of Pig Farming and Disease Control，Shaoguan 512005，China）

S852.61

A

1004-874X（2017）06-0129-06

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2017-04-08

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2017A020225044，2016A040402038）；廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新聯(lián)盟建設(shè)項(xiàng)目（2016LM1141）；韶關(guān)市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013CX/N09）

南文金（1981-），男，碩士，助理研究員，E-mail：nanwenjin@126.com

彭國(guó)良（1965-），男，碩士，研究員，E-mail：pengguoliang168@163.com