趙詠中，方玉鵬，王建軍，董 偉，許開云

（武威市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，甘肅武威 733000）

湖羊布魯氏菌S2疫苗免疫血清抗體消長規(guī)律研究

趙詠中，方玉鵬，王建軍，董 偉，許開云

（武威市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，甘肅武威 733000）

目的探究湖羊經(jīng)布魯氏菌S2疫苗免疫后的血清抗體消長規(guī)律。方法采用皮下注射25億CFU（正常劑量）、口服免疫100億CFU（正常劑量）、口服免疫150億CFU（1.5倍劑量）3種免疫方法，對試驗湖羊進行S2疫苗接種。在免疫前后的不同時間點，采集血液，分離血清，通過虎紅平板凝集試驗（RBT）和試管凝集試驗（SAT）檢測血清抗體水平。結(jié)果皮下免疫組在免疫后7 d出現(xiàn)抗體，21 d達到峰值，平均抗體效價最高為1:400，RBT和SAT抗體陽性率均為100%；免疫后120 d，RBT、SAT血清抗體陽性率分別為53%、56%；血清抗體存續(xù)時間為240 d。1.5倍劑量口服組免疫后21 d，RBT、SAT抗體陽性率分別為80%、83%，平均抗體效價最高為1:230.9，血清抗體存續(xù)時間為150 d。正常劑量口服免疫組在免疫后14 d產(chǎn)生抗體，21 d的抗體陽性率最高，RBT、SAT抗體陽性率分別為50%、57%，平均抗體效價最高為1:156，血清抗體存續(xù)時間為120 d。結(jié)論布魯氏菌S2疫苗皮下免疫效果明顯優(yōu)于口服免疫效果，但可能存在免疫副反應(yīng)；1.5倍劑量口服優(yōu)于正常劑量口服。

布魯氏菌病；S2疫苗；血清抗體；持續(xù)時間；湖羊

Abstract：[Objective]TO investigate the dynamic changes of serum antibodies in Hu-sheep immunized with brucellosis vaccine (S2). [Methods] Three different methods were used to vaccinate the Hu-sheep：oral immunization of 10 billion CFU（normal dosage），oral immunization of 15 billion CFU（normal dosage），and subcutaneous injection of 2.5 billion CFU（1.5 times than normal dosage）. Then serum samples were collected in different timepoints before and after vaccination and detected by Rose Bengal plate agglutination test（RBT）and tube agglutination test（SAT）. [Results] After subcutaneous injection，the antibodies could be detected on 7th day，and the peak value appeared on 21st day. During this period，the average highest antibody titer was 1:400，and the positive rates of antibodies detected by RBT and SAT were both 100%，while the positive rates of antibodies tested on 120th day were 53% and 56% respectively；The serum antibodies lasted for 240 days. For oral immunization of 1.5 times dosage CFU，on 21st day after dosing，the antibody positive rates by RBT and SAT detection were 80% and 83% respectively；The average highest antibody titer was 1:230.9；The serum antibodies could lasted for 150 days after dosing. After oral immunization of oral dosage CFU，the antibodies appeared on 14th day，then rose up to the highest level on 21st day；The positive rates of antibodies detected by RBT and SAT were 50% and 57%，and the average highest antibody titer was 1:156；At last，the serum antibodies could last for 120 days.[Conclusion] The immune effect of subcutaneous injection method was obvious better than that of oral route，however，side-effects could be found during subcutaneous injection. Other side，effect of oral immunization of 1.5 times dosage cfu was better than the normal dosage oral medication.

Key words：Brucellosis；vaccine of S2 strain；serum antibody；duration；Hu-sheep

布魯氏菌病（以下簡稱布?。┦怯刹剪斒暇鷮偌毦鸬囊环N人獸共患變態(tài)反應(yīng)性傳染病[1]。羊種布魯氏菌能夠引起懷孕母羊流產(chǎn)，公羊發(fā)生睪丸炎等，是引起人布病感染的主要菌型，給畜牧業(yè)發(fā)展和人類健康帶來嚴重危害[2]。我國將布病列為二類動物疫病，并列入《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃（2012—2020年）》重點防控疫病名錄[3]。當前，我國布病控制措施主要以檢疫凈化為主，在重點疫區(qū)對易感動物接種疫苗。目前用于動物布病防控的弱毒活疫苗主要包括豬種S2疫苗、牛種S19疫苗、羊種M5疫苗、羊種Rev.1疫苗和粗糙型牛種RB51疫苗等。20世紀70年代，豬種S2疫苗正式用于羊的免疫。S2疫苗具有適用范圍廣、使用方便、毒力較S19弱等優(yōu)點，適用于豬、牛、山羊、綿羊等多種動物的免疫[4]。

目前，一些地區(qū)S2疫苗的防治效果不甚理想。S2疫苗為光滑性菌株，其LPS中的O抗原刺激機體產(chǎn)生的抗體會干擾常規(guī)血清學(xué)診斷，無法鑒別疫苗接種動物和自然野毒感染動物[5-6]，只能通過疫苗存續(xù)時間來鑒別[7-8]。此外，關(guān)于羊S2疫苗免疫抗體存續(xù)時間的報道也不盡相同。為進一步探究湖羊免疫S2疫苗后的抗體消長規(guī)律，本試驗設(shè)計不同免疫途徑進行S2疫苗接種，以RBT、SAT方法進行免疫血清抗體檢測，從而了解和掌握湖羊S2疫苗的免疫效果、抗體消長規(guī)律和疫苗副作用等，為S2疫苗免疫程序的制定、免疫方法的優(yōu)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

共120只4～5月齡湖羊。在免疫前對所有試驗羊進行RBT和SAT檢測，檢測結(jié)果均為陰性。將試驗羊隨機分為4組，每組30只，分別為皮下免疫組、口服免疫1組、口服免疫2組、空白對照組。對試驗羊均打耳標標記，在相同生產(chǎn)條件下飼養(yǎng)管理。

1.2 試驗疫苗

布病活疫苗（S2株）（產(chǎn)品批號1608016），為中牧實業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠生產(chǎn)。疫苗保存于4 ℃冰箱，使用時恢復(fù)到室溫條件，然后用生理鹽水稀釋，使用專用連續(xù)注射器口服或皮下注射。

1.3 檢測試劑

布病虎紅平板凝集試驗抗原（批號160010601）、試管凝集試驗抗原（批號160010801）、陽性對照、陰性對照（20160501）均購自青島易邦生物工程有限公司。各檢測試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.4 疫苗接種方法

對3組試驗羊隔離飼養(yǎng)，分別采用口服和皮下注射2種方法進行S2疫苗免疫接種。根據(jù)疫苗使用說明書，設(shè)正常劑量和1.5倍劑量。皮下免疫組（正常劑量），每只羊免疫25億CFU；口服免疫組（正常劑量），每只羊免疫100億CFU；口服免疫組（1.5倍劑量），每只羊免疫150億CFU?？瞻讓φ战M不免疫。

對免疫后試驗羊的臨床表現(xiàn)、體溫、飲食等進行觀察和記錄，用于評價S2疫苗不同劑量及不同免疫途徑對羊的疫苗副作用。

1.5 血清樣品采集及抗體水平檢測

分別在免疫前及免疫后7、14、21、42、70、150、180、210、240 d，采集試驗羊血液并分離血清，采用RBT、SAT分別檢測試驗羊的血清抗體水平。具體操作與判定按國家標準GB/T18646—2002進行。

1.6 資料分析

結(jié)果以“平均值±標準差”表示，利用SPSS 20. 0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，處理數(shù)據(jù)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫前后試驗羊血清抗體

在免疫前血清樣品中均未檢出抗體效價；免疫后的各試驗羊均存在血清抗體效價；各試驗組免疫前與免疫后的平均血清抗體效價差異極顯著（P＜0.01）（圖1）。皮下免疫組免疫后14、21、42、70 d之間的抗體效價差異不顯著，但與其他時間點差異均顯著；1.5倍劑量口服組21 d的效價與其他時間點差異顯著，90 d與120 d的效價差異不顯著，7 d與180 d的差異不顯著；正常劑量口服組21 d的效價與其他時間點差異顯著，14 d與90 d的差異不顯著，7 d與120 d的差異不顯著，150、180、210、240 d之間的效價差異不顯著（表1）。

圖1 皮下免疫組、正常劑量免疫組、1.5倍劑量免疫組抗體效價變化

2.2 試驗組抗體陽性率情況

皮下免疫組免疫后7 d產(chǎn)生血清抗體，21 d抗體陽性率達100%（圖2）；正常劑量口服組免疫后21 d產(chǎn)生抗體，抗體陽性率為50%（圖3）；1.5倍劑量口服組免疫后14 d產(chǎn)生抗體，21 d抗體陽性率為82%（圖4）。

圖2 皮下免疫組陽性率曲線

表1 布病S2疫苗抗體效價統(tǒng)計結(jié)果

表1 布病S2疫苗抗體效價統(tǒng)計結(jié)果

注：同行數(shù)據(jù)肩標相同字母或無字母標注，表示差異不顯著（P＞0.05）；肩標不同字母，表示差異顯著（P＜0.05）

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圖3 正常劑量口服組陽性率曲線

圖4 1.5倍劑量口服組陽性率曲線

2.3 布病S2疫苗不同免疫途徑抗體效價差異性

對各試驗組的抗體效價結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，皮下免疫組在7 d抗體效價達1:347.5（-1.81±0.09）log2，顯著高于正常劑量口服組與1.5倍劑量口服組（P＜0.01），240 d的皮下免疫組抗體效價仍顯著高于正常劑量口服組與1.5倍劑量口服組，表明皮下免疫組的免疫效果最好，且持續(xù)時間顯著優(yōu)于1.5倍劑量口服組和正常劑量口服組；7～240 d內(nèi)各時間點的1.5倍劑量口服組抗體效價顯著高于正常劑量口服組（P＜0.05），表明1.5倍劑量口服組抗體存續(xù)時間顯著優(yōu)于正常劑量口服組。

3 分析與討論

本試驗采用皮下免疫和口服免疫2種途徑進行免疫接種，通過長期連續(xù)跟蹤檢測，從抗體陽性率、抗體平均效價水平以及血清抗體存續(xù)時間等方面對S2疫苗免疫湖羊后的抗體消長規(guī)律進行探究。從圖1、圖2、圖3中可以看到，皮下免疫組免疫后7 d即產(chǎn)生抗體，21 d抗體陽性率達到最高，抗體平均效價水平最高為1:400，抗體陽性率最高為100%，抗體存續(xù)時間為240 d；從表1可以看到，皮下免疫組的抗體平均效價水平高于1.5倍劑量口服組，1.5倍劑量口服組的又高于正常劑量口服組。白麗艷等[9]、劉寧[10]等檢測發(fā)現(xiàn)正常劑量注射免疫S2疫苗后的RBT和SAT抗體陽性率最高為80%。樊生平等[11]肌注50億菌的抗體陽性率最高為100%，抗體平均效價最高達1:2 358，與本研究結(jié)果相似。田素梅等[12]免疫S2疫苗后15 d平均抗體即達最高峰，抗體存續(xù)時間可持續(xù)280 d。高紅霞等[13]研究發(fā)現(xiàn)，綿羊在免疫S2活菌苗后30 d，其體內(nèi)血清抗體即達最高峰。蔡一非等[14]采取皮下免疫50億活菌苗，7 d后體內(nèi)血清抗體即達最高峰。上述研究結(jié)果表明，在S2疫苗免疫后7～30 d內(nèi)，羊體內(nèi)血清抗體可達峰值。

皮下免疫組血清抗體陽性率和抗體平均效價均遠高于1.5倍劑量和正常劑量口服免疫組，抗體陽性率最高為100%，最高抗體效價為1:400（本試驗檢測最高值），且抗體存續(xù)時間可持續(xù)240 d。另外，據(jù)研究S2疫苗有一定的殘余毒力[15-16]，其對懷孕母羊是否會引起流產(chǎn)等副作用尚不明確。本試驗在皮下免疫后，出現(xiàn)1例死亡，有18例試驗羊免疫后3～5 d內(nèi)出現(xiàn)食欲下降、精神倦怠，個別羊免疫后1～2 d內(nèi)，出現(xiàn)體溫升高，之后自行恢復(fù)。因此，建議對未孕母羊采用皮下免疫，以保證免疫效果確實；對育成母羊配種前要進行全群檢疫，對陰性母羊可采用皮下注射免疫，避免出現(xiàn)疫苗副反應(yīng)，提高免疫安全性。

1.5 倍劑量口服組免疫后14 d即產(chǎn)生抗體，21 d達到高峰，RBT、SAT抗體陽性率最高分別 為80%、83%，抗體存續(xù)時間為150 d；正常劑量口服組免疫后21 d產(chǎn)生抗體并達到最高峰，RBT、SAT抗體陽性率最高分別為50%、57%，抗體存續(xù)時間為120 d。1.5倍劑量口服組抗體陽性率、平均抗體效價和抗體存續(xù)時間都優(yōu)于正常劑量口服組。鐘映梅等[17]對綿羊免疫S2疫苗，免疫后7 d檢測到抗體，42 d血清抗體陽性率達峰值，口服免疫后抗體陽性率最高為41.1%。本試驗結(jié)果也進一步驗證了樊生平等[11]的研究觀點：綿羊口服200億和100億免疫劑量抗體陽性率表現(xiàn)出明顯差異。但與申捷等[18]的研究結(jié)果有所差異：綿羊口服100億和200億兩種免疫將抗體陽性率差異較小。為進一步保證綿羊免疫效果，綜合考慮抗體陽性率、抗體效價水平和抗體存續(xù)時間等因素，對懷孕母畜應(yīng)選用1.5倍劑量口服免疫。

從檢測方法和檢測結(jié)果來看，RBT和SAT抗體陽性率曲線基本一致，但SAT檢出的陽性數(shù)高于RBT。這與鐘映梅等[17]、黨富德等[19]的研究結(jié)果一致。原因可能與SAT以檢測血清抗體IgM蛋白為主，而RBT則以IgG蛋白為主有關(guān)。因此，建議在大群檢測時，首先使用RBT進行初檢，對疑似陽性的用SAT復(fù)檢，以保證檢測結(jié)果準確可靠。

4 小結(jié)

本試驗結(jié)果表明，S2疫苗皮下免疫和口服免疫方式的免疫效果差異較大。從血清抗體產(chǎn)生時間、抗體陽性率、抗體效價水平、抗體存續(xù)時間等方面來看，皮下免疫組均優(yōu)于口服免疫組，但存在一定的副反應(yīng)，1.5倍劑量口服免疫組優(yōu)于正常劑量口服免疫組。因此，育成母羊配種前首先應(yīng)進行全群檢疫，對陰性母羊采用皮下注射免疫，對懷孕母畜宜用1.5倍劑量口服免疫。

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（責(zé)任編輯：朱迪國）

Study on the Antibody Dynamics of Vaccine Brucellosis Vaccine（S2）in Hu-sheep

Zhao Yongzhong，F(xiàn)ang Yupeng，Wang Jianjun，Dong Wei，Xu Kaiyun
（Wuwei Institute of Animal Husbandry and Veterinary，Wuwei，Gansu 733000）

S852.52

B

1005-944X（2017）10-0075-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.10.021

甘肅省種畜場布病檢測凈化計劃