謝樂芳，李莉莉，陳丙年，王力，*

（1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建廈門361021；2.廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院演武分院，福建廈門361005）

3種Dawson型雜多酸對(duì)酪氨酸酶的抑制作用

謝樂芳1，李莉莉1，陳丙年2，王力1，*

（1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建廈門361021；2.廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院演武分院，福建廈門361005）

合成3種Dawson型雜多酸H8[P2Mo17Zn（OH2）O61]、H8[P2Mo17Cu（OH2）O61]和H7[P2Mo17Fe（OH2）O61]（分別簡(jiǎn)寫為P2Mo17Zn、P2Mo17Cu和P2Mo17Fe），并用紅外和紫外光譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。進(jìn)而用酶動(dòng)力學(xué)方法研究3種化合物對(duì)酪氨酸酶二酚酶的抑制作用（包括抑制效果、抑制機(jī)理、抑制類型）。結(jié)果表明：P2Mo17Zn、P2Mo17Cu和P2Mo17Fe 3種化合物對(duì)酪氨酸酶二酚酶均有明顯的抑制效果，對(duì)應(yīng)的IC50值分別為0.346 2、0.361 5、0.383 1 mmol/L。3種化合物均屬于可逆競(jìng)爭(zhēng)型，抑制常數(shù)KI分別為0.106 8、0.068 2、0.057 2 mmol/L。綜合比較，3種化合物的抑酶效果依次是P2Mo17Zn＞P2Mo17Cu＞P2Mo17Fe。

酪氨酸酶；抑制作用；雜多酸；酶動(dòng)力學(xué)

Abstract：Three kinds of Dawson-type heteropoly acids H8[P2Mo17Zn（OH2）O61]，H8[P2Mo17Cu（OH2）O61]and H7[P2Mo17Fe（OH2）O61]were synthesised（abbreviated as P2Mo17Zn，P2Mo17Cu and P2Mo17Fe）.The structures of these compounds were characterized by the UV and IR spectroscopy.And then these compounds'inhibitory effect on tyrosinase were studied by enzyme kinetic method （including inhibition effects，inhibition mechanism and inhibition type）.The results showed that three compounds had obvious inhibitory effects on tyrosinase，and the IC50values of P2Mo17Zn，P2Mo17Cu and P2Mo17Fe were 0.346 2，0.361 5 and 0.383 1 mmol/L，respectively.Moreover，the three kinds of compounds were reversible competitive inhibitiors，and their inhibition constants（KI）were 0.106 8，0.068 2 and 0.057 2 mmol/L，respectively.Comprehensive comparison，the order of the inhibiting ability of three kinds of compounds on tyrosinase was P2Mo17Zn＞P2Mo17Cu＞P2Mo17Fe.

Key words：tyrosinase；inhibitory effect；heteropoly acid；enzyme kinetic method

酪氨酸酶（tyrosinase，EC 1.14.18.1）結(jié)構(gòu)復(fù)雜，含有多個(gè)亞基，其活性中心含有銅離子，是一種氧化還原酶[1-3]。微生物、動(dòng)植物以及人體中都分布有酪氨酸酶，它是生物體合成黑色素的關(guān)鍵限速酶，兼具單酚酶和二酚酶活性[4-6]：催化L-酪氨酸羥基化為L(zhǎng)-多巴和氧化L-多巴形成多巴醌[3-4，7-8]，多巴醌經(jīng)進(jìn)一步復(fù)雜反應(yīng)生成黑色素。而黑色素的過量表達(dá)則會(huì)引起色素沉著等相關(guān)疾病[1-2，8]和果蔬的酶促褐變，嚴(yán)重影響美觀和經(jīng)濟(jì)效益。因此通過抑制酪氨酸酶活性來(lái)控制黑色素的生成量，進(jìn)而治療或防止色素沉著和延緩酶促褐變的研究也越來(lái)越多[7]。目前，抑制酪氨酸酶活性的研究主要集中在天然提取物[5，7-11]、人工合成的有機(jī)化合物[2-3，6，11-13]以及少量的無(wú)機(jī)化合物[14]。因此，研發(fā)和尋找高效無(wú)毒、特異性強(qiáng)的酪氨酸酶抑制劑已成為醫(yī)藥、農(nóng)學(xué)、食品等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[5]。

多金屬氧酸鹽（Polyoxometalates，簡(jiǎn)寫為 POMs），是一類分子金屬氧化物，具有結(jié)構(gòu)多樣性和特殊的物理化學(xué)性質(zhì)，在催化、分子基功能材料、磁性分子、仿生學(xué)和多功能材料[15]方面已經(jīng)有廣泛的應(yīng)用。尤其是，多金屬氧化簇能夠接受額外的電子進(jìn)行可逆的氧化還原反應(yīng)，同時(shí)保持結(jié)構(gòu)不變[16]。這些性質(zhì)使其能夠成為具有吸引力的氧化還原催化劑，作為分子材料和設(shè)備的功能單位[17]。不僅如此，許多研究發(fā)現(xiàn)多金屬氧酸鹽可能成為潛在的有效酶抑制劑[18-19]。為此，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)多金屬氧酸鹽用于抑制酪氨酸酶活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)Keggin型多金屬氧酸鹽對(duì)酪氨酸酶具有很好的抑制作用[20-25]，為進(jìn)一步研究其他類型多酸對(duì)酪氨酸酶的抑制作用，對(duì)Dawson型多酸的抑酶效果進(jìn)行研究，以期研制出更新穎、更安全有效的酪氨酸酶抑制劑，為擴(kuò)展多金屬氧酸鹽的應(yīng)用以及果蔬保鮮甚至色素沉著性疾病的治療提供有用信息。因此，本文按照文獻(xiàn)方法合成并研究了 H8[P2Mo17Zn（OH2）O61]、H8[P2Mo17Cu（OH2）O61]和H7[P2Mo17Fe（OH2）O61]（分別簡(jiǎn)寫為P2Mo17Zn、P2Mo17Cu和P2Mo17Fe）對(duì)酪氨酸酶的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

H8[P2Mo17Zn（OH2）O61]、H8[P2Mo17Cu（OH2）O61]和 H7[P2Mo17Fe（OH2）O61]按文獻(xiàn)方法自行合成，用紅外、紫外光譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征[26-28]；酪氨酸酶（2 687 U/mg）、L-3，4-二羥基苯丙氨酸（L-DOPA）、二甲基亞砜（DMSO）：Sigma-Aldrich化學(xué)公司；其它試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

Cintra 2020型紫外-可見分光光度計(jì)：澳大利亞GBC儀器公司；Nicolet Avatar 330型傅立葉變換紅外光譜儀：美國(guó)Thermo Electron公司。

1.2 方法

1.2.1 二酚酶抑制活性測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[29]對(duì)酪氨酸酶活力進(jìn)行測(cè)定，原理是基于L-DOPA經(jīng)酪氨酸酶催化生成的黑色素在475 nm處有最大吸收峰，吸收系數(shù)ε=3 700 L/（cm·mol）。在1 cm比色皿中，臨時(shí)配制3 mL NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液（50 mmol/L，pH=6.8）測(cè)活體系：首先加入 0.1 mL不同濃度的抑制劑（溶于DMSO，終濃度為3.33%），然后加入2.8 mL經(jīng)30℃水浴10 min的0.5 mmol/L的多巴底物，最后加入0.1 mL酪氨酸酶溶液（對(duì)照組為0.1 mL DMSO），立即混勻，測(cè)定反應(yīng)體系的吸光度值隨時(shí)間變化的曲線，根據(jù)直線的斜率計(jì)算酶活力。

1.2.2 二酚酶抑制活性的動(dòng)力學(xué)分析

運(yùn)用上述3 mL測(cè)活體系，改變加入的酶量和抑制劑量，測(cè)定反應(yīng)體系的酶活力，從而判定抑制劑對(duì)酪氨酸酶的抑制機(jī)理。通過改變加入的底物濃度，測(cè)定不同濃度抑制劑作用下的酪氨酸酶活力，經(jīng)Lineweaver-Burk作圖，以所得直線的斜率和Y軸的截距分別對(duì)抑制劑濃度進(jìn)行二次作圖，可求得抑制劑常數(shù)KI（游離酶）和KIS（酶－底物絡(luò)合物），從而判斷抑制劑對(duì)酪氨酸酶的抑制類型[22]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Origin 8.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和分析，用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析，顯著差異水平：顯著（P＜0.05）；極顯著（P＜0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑制劑的光譜表征

用紅外光譜和紫外光譜對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，P2Mo17Zn、P2Mo17Cu和 P2Mo17Fe的紅外譜圖（圖 1）和紫外譜圖（圖2）如圖所示。

圖1 P2Mo17Zn（A）、P2Mo17Cu（B）和P2Mo17Fe（C）的紅外譜圖Fig.1 IR spectrum of P2Mo17Zn（A），P2Mo17Cu（B）and P2Mo17Fe（C）

從紅外譜圖可以看出，在4 000 cm-1～400 cm-1范圍內(nèi)可以觀察到有Dawson結(jié)構(gòu)的特征吸收峰，以P2Mo17Fe為例：3 429.0 cm-1是水分子的彎曲振動(dòng)、1 618.0 cm-1是O-H伸縮振動(dòng)、1 062.5 cm-1對(duì)應(yīng)P-Oa鍵反對(duì)稱伸縮振動(dòng)、954.5 cm-1對(duì)應(yīng)Mo-Od鍵反對(duì)稱伸縮振動(dòng)、871.5 cm-1對(duì)應(yīng)Mo-Ob鍵反對(duì)稱伸縮振動(dòng)、790.5 cm-1對(duì)應(yīng)Mo-Oc鍵反對(duì)稱伸縮振動(dòng)。P2Mo17Zn和P2Mo17Cu在對(duì)應(yīng)的波數(shù)范圍內(nèi)也出現(xiàn)了相應(yīng)的特征吸收峰，與參考文獻(xiàn)相符[26-27]。

圖 2 P2Mo17Zn（A）、P2Mo17Cu（B）和 P2Mo17Fe（C）的紫外譜圖Fig.2 UV spectrum of P2Mo17Zn（A），P2Mo17Cu（B）and P2Mo17Fe（C）

由圖2可看出，P2Mo17Zn、P2Mo17Cu和 P2Mo17Fe的紫外譜圖均在213 nm波長(zhǎng)附近出現(xiàn)了強(qiáng)的吸收峰，對(duì)應(yīng)于Dawson型結(jié)構(gòu)多酸的特征吸收峰，與參考文獻(xiàn)相符[26-27]，說明所合成的化合物確實(shí)為Dawson型多酸。

2.2 抑制劑對(duì)酪氨酸酶二酚酶抑制活性的影響

P2Mo17Zn（A）、P2Mo17Cu（B）和 P2Mo17Fe（C）對(duì)酪氨酸酶的抑制效果如圖3所示。

圖3 P2Mo17Zn（A）、P2Mo17Cu（B）和P2Mo17Fe（C）對(duì)酪氨酸酶的抑制效果Fig.3 Inhibitory effects of P2Mo17Zn（A），P2Mo17Cu（B）and P2Mo17Fe（C）on tyrosinase

分別以P2Mo17Zn、P2Mo17Cu和P2Mo17Fe為抑制劑，研究其對(duì)酪氨酸酶二酚酶催化L-DOPA生成黑色素的活力的影響，由圖3可看出，隨著抑制劑濃度的增大，酪氨酸酶的相對(duì)酶活力不斷下降，存在明顯的劑量效應(yīng)，說明P2Mo17Zn、P2Mo17Cu和P2Mo17Fe 3種化合物對(duì)酪氨酸酶均有明顯的抑制效果。根據(jù)抑制曲線可得導(dǎo)致酶活力下降50%時(shí)P2Mo17Zn、P2Mo17Cu和P2Mo17Fe的濃度（IC50）分別為 0.346 2、0.361 5、0.383 1 mmol/L，表明3種化合物對(duì)酪氨酸酶確實(shí)有明顯的抑制作用，且P2Mo17Zn對(duì)酪氨酸酶的抑制效果優(yōu)于P2Mo17Cu，P2Mo17Cu優(yōu)于P2Mo17Fe。

2.3 抑制劑對(duì)酪氨酸酶二酚酶的抑制機(jī)理

分別以不同濃度的P2Mo17Zn、P2Mo17Cu和P2Mo17Fe為抑制劑，改變加入的酶量，測(cè)定不同濃度抑制劑作用下酪氨酸酶的酶活力，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可以看出，以酶活力對(duì)加入的酶量作圖，得到的一組直線均經(jīng)過原點(diǎn)，且隨著抑制劑濃度的增加，直線斜率不斷減小，說明3種化合物對(duì)酪氨酸酶進(jìn)行可逆抑制，即3種化合物均是與酶進(jìn)行非共價(jià)可逆結(jié)合，從而降低酪氨酸酶的活力。

圖 4 P2Mo17Zn（A）、P2Mo17Cu（B）和 P2Mo17Fe（C）對(duì)酪氨酸酶二酚酶抑制機(jī)理的測(cè)定Fig.4 Inhibitory mechanism of P2Mo17Zn（A），P2Mo17Cu（B）and P2Mo17Fe（C）on tyrosinase

2.4 抑制劑對(duì)酪氨酸酶二酚酶的抑制類型及其抑制常數(shù)

在3 mL 50 mmol/L的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液（pH=6.8）測(cè)活體系中，通過改變加入的底物和抑制劑濃度，測(cè)定不同濃度抑制劑作用下酪氨酸酶酶活力，結(jié)果如圖5所示。

圖 5 P2Mo17Zn（A）、P2Mo17Cu（B）和 P2Mo17Fe（C）對(duì)酪氨酸酶二酚酶抑制類型及其抑制常數(shù)的測(cè)定Fig.5 Inhibitory types and the inhibitory constants of P2Mo17Zn（A），P2Mo17Cu（B）and P2Mo17Fe（C）on tyrosinase

通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖，得到一組相交于一點(diǎn)的直線，交點(diǎn)非常接近Y軸，并且隨著抑制劑濃度的增加，直線斜率增大，米氏常數(shù)Km值增大，由此判斷3種化合物對(duì)酪氨酸酶的抑制類型為競(jìng)爭(zhēng)型，即抑制劑與底物競(jìng)爭(zhēng)酪氨酸酶的活性結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)一步以直線的斜率對(duì)抑制劑的濃度作圖，從圖中可計(jì)算得到3種化合物對(duì)酪氨酸酶游離酶的抑制常數(shù)KI分別為 0.106 8、0.068 2、0.057 2 mmol/L（見圖 5插圖）。

3 結(jié)論

通過酶動(dòng)力學(xué)方法研究3種不同過渡金屬取代的Dawson型磷鉬酸對(duì)酪氨酸酶二酚酶的抑制效果、機(jī)理以及類型。結(jié)果表明：3種化合物對(duì)酪氨酸酶均有明顯的抑制作用（與經(jīng)典酪氨酸酶抑制劑熊果甙IC50=5.30 mmol/L[30]比較），其 IC50分別為 0.346 2、0.361 5、0.383 1 mmol/L。3種化合物對(duì)酪氨酸酶的抑制均屬于可逆競(jìng)爭(zhēng)型抑制，抑制常數(shù)KI分別為0.106 8、0.068 2、0.057 2 mmol/L。綜合比較，P2Mo17Zn對(duì)酪氨酸酶的抑制作用優(yōu)于其他兩種化合物。因此，本試驗(yàn)可能為研制出更新穎、更安全有效的酪氨酸酶抑制劑，為擴(kuò)展多金屬氧酸鹽的應(yīng)用以及果蔬保鮮甚至色素沉著性疾病的治療提供有用信息。

[1]陳清西,林建峰,宋康康.酪氨酸酶抑制劑的研究進(jìn)展[J].廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2007,46(2):274-282

[2]Tang J,Liu J,Wu F.Molecular docking studies and biological evaluation of 1,3,4-thiadiazole derivatives bearing Schiff base moieties as tyrosinase inhibitors[J].Bioorganic Chemistry,2016,69:29-36

[3]Liu J,Cao R,Yi W,et al.A class of potent tyrosinase inhibitors:Alkylidenethiosemicarbazide compounds[J].European Journal of Medicinal Chemistry,2009,44(4):1773-1778

[4]胡泳華,賈玉龍,陳清西.酪氨酸酶抑制劑的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2016,55(5):760-768

[5]關(guān)天旺,楊航,劉嘉煜,等.龍眼核多酚提取物對(duì)酪氨酸酶抑制作用的研究[J].食品研究與開發(fā),2016,37(17):15-20

[6]Lee S Y,Baek N,Nam T G.Natural,semisynthetic and synthetic tyrosinase inhibitors[J].Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry,2016,31(1):1-13

[7]傅佳愈,楊遠(yuǎn)帆,倪輝,等.茶花粉提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2015,15(7):66-72

[8]Di Petrillo A,González-Paramás A M,Era B,et al.Tyrosinase inhibition and antioxidant properties of Asphodelus microcarpus extracts[J].BMC Complementary and Alternative Medicine,2016,16(1):453-461

[9]徐莉,李彩霞,宋海,等.綠茄葉黃酮的響應(yīng)面優(yōu)化提取及其對(duì)酪氨酸酶的抑制作用[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志,2016,35(5):8-13

[10]陳怡,梁偉,鄭思琦,等.茯苓三萜類化合物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用[J].新經(jīng)濟(jì),2016(Z1):156

[11]程水明,雷霄宇,劉冰潔,等.茯苓皮三萜抑制酪氨酸酶機(jī)理研究[J].食品研究與開發(fā),2016,37(9):18-22

[12]王慶華,何云,王曉藝.復(fù)合抑制劑對(duì)酪氨酸酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響[J].食品研究與開發(fā),2015,36(19):36-40

[13]蘇明星,王偉,唐建陽(yáng).庚酸-3,4-二羥基苯酯和3,4-二羥基苯甲酸己酯對(duì)蘑菇酪氨酸酶抑制效應(yīng)[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2011,11(2):42-46

[14]李莉莉,邢蕊,鄧陽(yáng)陽(yáng),等.酪氨酸酶抑制劑的研究新進(jìn)展[J].食品工業(yè),2016,37,(8):235-239

[15]Nie Y,Chen W,Liu Z,et al.Synthesis and photocatalytic hydrogen evolution activity of three Keggin-type polyoxometalates with different central atoms[J].Inorganic Chemistry Communications,2015,61:184-186

[16]Li N,Sun Z,Liu R,et al.Enhanced power conversion efficiency in phthalocyanine-sensitized solar cells by modifying TiO2photoanode with polyoxometalate[J].Solar Energy Materials and Solar Cells,2016,157:853-860

[17]Zhang S,Liu L,Li F,et al.Synthesis,characterization and photoelectric properties of Dawson-type polyoxometalate covalently linked to zinc(II)porphyrin[J].Inorganica Chimica Acta,2016,453:179-185

[18]Sun X,Wu Y,Gao W,et al.CD39/ENTPD1 Expression by CD4+Foxp3+RegulatoryTCellsPromotesHepaticMetastaticTumorGrowth in Mice[J].Gastroenterology,2010,139(3):1030-1040

[19]Fraqueza G,Ohlin C A,Casey W H,et al.Sarcoplasmic reticulum calcium ATPase interactions with decaniobate,decavanadate,vanadate,tungstate and molybdate[J].Journal of Inorganic Biochemistry,2012,107(1):82-89

[20]Xing R,Wang F,Dong L,et al.Inhibitory effects of Na7PMo11CuO40on mushroom tyrosinase and melanin formation and its antimicrobial activities[J].Food Chemistry,2016,197:205-211

[21]Chen B,Xing R,Wang F,et al.Inhibitory effects of α-Na8SiW11CoO40on tyrosinase and its application in controlling browning of freshcut apples[J].Food Chemistry,2015,188:177-183

[22]Xing R,Zheng A,Wang F,et al.Functionality study of Na6PMo11FeO40as a mushroom tyrosinase inhibitor[J].Food Chemistry,2015,175:292-299

[23]邢蕊,鄭阿萍,王芳,等.釩取代的多酸鹽對(duì)酪氨酸酶抑制機(jī)理的研究[J].分子科學(xué)學(xué)報(bào),2015,31(5):436-440

[24]鄭阿萍,陳丙年,陳發(fā)河,等.釩取代硅鎢氧酸鹽對(duì)酪氨酸酶的抑制作用[J].應(yīng)用化學(xué),2013,30(2):165-170

[25]鄭阿萍,王芳,邢蕊,等.兩種多酸型酪氨酸酶抑制劑的性能研究[J].高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào),2014,35(3):476-481

[26]高麗華,趙月,趙慧珍,等.Dawson結(jié)構(gòu)鉬磷過渡元素三元雜多酸穩(wěn)定性的研究[J].哈爾濱師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào),1993,9(2):52-56

[27]王恩波,高麗華,劉景福,等.具有Dawson結(jié)構(gòu)的鉬釩磷雜多酸的制備和性質(zhì)研究[J].化學(xué)學(xué)報(bào),1988(8):757-762

[28]Jing S,Wang Z,Zhu W,et al.Oxidation of cyclohexane with hydrogen peroxide catalyzed by Dawson-type vanadium-substituted heteropolyacids[J].Reaction Kinetics,Mechanisms and Catalysis,2006,89(1):55-61

[29]Hu Y,Zhuang J,Yu F,et al.Inhibitory effects of cefotaxime on the activity of mushroom tyrosinase[J].Journal of Bioscience and Bioengineering,2016,121(4):385-389

[30]宋康康,邱凌,黃璜,等.熊果甙作為化妝品添加劑對(duì)酪氨酸酶抑制作用[J].廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2003,42(6):791-794

The Inhibition of Three Kinds of Dawson-type Heteropoly Acids on Tyrosinase

XIE Le-fang1，LI Li-li1，CHEN Bing-nian2，WANG Li1，*
（1.Food and Bioengineering College of Jimei University，Xiamen 361021，F(xiàn)ujian，China；2.YanWu Affiliated Hospital of Zhongshan Hospital Xiamen University（Xiamen University Hospital），Xiamen 361005，F(xiàn)ujian，China）

2017-01-16

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.038

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21371072）

謝樂芳（1992—），女（漢），在讀碩士研究生，研究方向：生物學(xué)。

*通信作者：王力，教授，博士，研究方向：多酸化學(xué)。