鄭睿行，周子焱，傅曉，林成棟，沈堅(jiān)

（寧波市食品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，浙江寧波315000）

HPLC測(cè)定玉米中玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A

鄭睿行，周子焱，傅曉，林成棟，沈堅(jiān)*

（寧波市食品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，浙江寧波315000）

建立玉米中玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）和赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）的超高效液相色譜檢測(cè)方法。樣品用乙腈/水（90∶10，體積比）振蕩提取，過濾后過真菌毒素凈化柱，取上清液氮?dú)獯蹈桑昧鲃?dòng)相溶解殘?jiān)?，過0.22 μm有機(jī)濾膜于進(jìn)樣瓶，采用高效液相色譜檢測(cè)法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）分析。在ZORBAX SB-C18反相柱上分離后，ZEN以甲醇/水（60∶40，體積比）作為流動(dòng)相，OTA以乙腈/水/乙酸（43∶56∶1，體積比）為流動(dòng)相，熒光檢測(cè)器檢測(cè)。ZEN的線性范圍為0.5 μg/mL～6.0 μg/mL，相關(guān)系數(shù)大于0.99；OTA的線性范圍為0.05 μg/mL～0.8 μg/mL，相關(guān)系數(shù)大于0.99。3個(gè)不同水平的加標(biāo)平均回收率為86.4%～114.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于10%。ZEN和OTA的檢測(cè)限分別為5.0 μg/kg和1.0 μg/kg。應(yīng)用該方法對(duì)收集的不同玉米樣品進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)ZEN和OTA污染較嚴(yán)重，超標(biāo)率均為71.4%。該方法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，能夠用于玉米樣品中真菌毒素的測(cè)定。

玉米；玉米赤霉烯酮；赭曲霉毒素A；超高效液相色譜檢測(cè)

Abstract：Determination method of zearalenone（ZEN）and ochratoxin A（OTA）in corn by high-performance liquid chromatography （HPLC）was established.Acetonitrile/water（90 ∶10，volume ratio）for the extraction solvent extracted zearalenone and ochratoxin A in corn，clean-up column purification；then the supernatant was dried by nitrogen，with the mobile phase to dissolve the residue，through the 0.22 μm organic filter to the inlet，HPLC detection.Methanol/water（60∶40，volume ratio）was used as mobile phase for ZEN，and acetonitrile/water/acetic acid（43 ∶56 ∶1，volume ratio）for OTA.The linearity range of ZEN and OTA were 0.5 μg/mL-6.0 μg/mL and 0.05 μg/mL-0.8 μg/mL，respectively，with correlation coefficient＞0.99.Recovery experiments were conducted by adding standard into the corn sample，with recoveries of 86.4%-114.1%，relative standard deviation of less than10%.The detection limit of ZEN and OTA were 5.0 μg/kg and 1.0 μg/kg，respectively.Different corn samples were found to be highly contaminated by ZEN and OTA using the method，with 71.4%of excessive rate.The method is simple and fast，good reproducibility，suitable for ZEN and OTA detection in the actual application.

Key words：corn；zearalenone；ochratoxin A；high performance liquid chromatography（HPLC）

玉米是我國重要的糧食作物和工業(yè)原料，經(jīng)常用作食品配料和飼料原料。由于環(huán)境、氣候和儲(chǔ)藏因素的影響，玉米極易污染霉菌，在適宜的溫度、水分和濕度條件下，這些霉菌會(huì)產(chǎn)生真菌毒素，其中玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）和赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）是比較常見的兩種真菌毒素[1]。ZEN主要是由鐮刀菌屬（Fusarium）的菌株產(chǎn)生的類雌激素化合物，可對(duì)人和動(dòng)物造成多種毒性作用。而由于ZEN的雌激素作用，生殖系統(tǒng)是其主要的靶器官[2]。研究表明ZEN對(duì)雌性和雄性的生殖力都會(huì)造成損傷，其中豬對(duì)ZEN最為敏感，食用ZEN污染的飼料可導(dǎo)致母豬外陰及乳腺腫脹，甚至引發(fā)陰道和直腸脫落[3]。OTA主要是由赭曲霉和青霉屬產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物，在農(nóng)產(chǎn)品中廣泛存在。OTA可對(duì)很多動(dòng)物物種造成毒性，其中腎臟是主要的靶器官。研究表明OTA可以導(dǎo)致腎病和人類巴爾干地方性腎病[4]。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)將OTA列為可能的人類致癌物。

ZEN和OTA污染的玉米被人和動(dòng)物食用后，會(huì)對(duì)人和動(dòng)物的健康造成極大地危脅，因此建立高效而準(zhǔn)確檢測(cè)玉米中ZEN和OTA的方法十分重要。目前ZEN和OTA的檢測(cè)方法主要包括免疫法、薄層色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法和高效液相色譜-質(zhì)譜法等[5-7]。但是免疫法、薄層色譜法的準(zhǔn)確度不夠高，而質(zhì)譜法對(duì)儀器和操作要求較高，因此目前高效液相色譜法是最常用的檢測(cè)方法。所用的樣品前處理技術(shù)包括液-液萃取和固相萃取，前者操作繁瑣且需要使用大量的有機(jī)溶劑，后者常用到免疫親和柱。但是免疫親和柱操作繁瑣且價(jià)格昂貴。本文通過固液萃取法同時(shí)提取玉米中的ZEN和OTA，選用真菌毒素凈化柱分離雜質(zhì)，對(duì)國標(biāo)中的前處理方法進(jìn)行了簡(jiǎn)化，高效液相色譜進(jìn)行分離檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)玉米中ZEN和OTA的快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

ZEN和OTA污染玉米：河南洛陽；ZEN、OTA標(biāo)品（純度≥98.0%）：上海百靈威公司；甲醇、乙腈（色譜純）：美國Fisher Scientific公司；氮?dú)猓航K無錫新南氣體有限公司；其它分析純?cè)噭┚徸陨虾０凫`威公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent HPLC 1260高效液相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司；MD200-1氮?dú)獯蹈蓛x：杭州奧盛儀器有限公司；Simplicity UV超純水制備系統(tǒng)：法國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

準(zhǔn)確稱取適量的ZEN和OTA標(biāo)準(zhǔn)品，分別用甲醇和乙腈配成濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20℃冰箱中避光保存。使用前用甲醇/水（60∶40，體積比）將ZEN 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成 0.5、1、2、4、6 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液，用乙腈/水/乙酸（43∶56∶1，體積比）將 OTA 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成 0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液。上述標(biāo)準(zhǔn)工作液置于4℃冰箱中待HPLC分析。

1.3.2 玉米樣品的前處理

取一定量的玉米籽粒磨粉并過30目篩，然后稱量25 g玉米粉于150 mL具塞錐形瓶中。向錐形瓶中加入100 mL乙腈/水（90∶10，體積比）溶液，在搖床上振蕩45 min（30℃，200 r/min）。將提取液過濾得到上清液，取4 mL上清液通過凈化柱（PuriToxSR M160），收集2 mL流出液于5 mL聚乙烯離心管中；另外取4mL上清液通過赭曲霉毒素A專用凈化柱（PuriToxSR O130 Ochratoxin Column），收集2 mL流出液于5 mL聚乙烯離心管中。將上述液體于55℃下氮?dú)獯蹈珊螅謩e用流動(dòng)相復(fù)溶，漩渦振蕩器振蕩40 s，過0.22 μm有機(jī)濾膜于進(jìn)樣瓶中，等待HPLC分析。

1.3.3 液相色譜條件

色譜柱：ZORBAXSB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30℃；ZEN 流動(dòng)相：甲醇/水（60∶40，體積比）；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；熒光檢測(cè)器：激發(fā)波長274 nm，發(fā)射波長 440 nm；OTA 流動(dòng)相：乙腈/水/乙酸（43 ∶56 ∶1，體積比）；流速：0.9 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；熒光檢測(cè)器：激發(fā)波長333 nm，發(fā)射波長477 nm。

1.3.4 定性和定量

根據(jù)國標(biāo)采用外標(biāo)法定量，保留時(shí)間定性，樣品中目標(biāo)化合物色譜峰的保留時(shí)間必須與標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰一致，同時(shí)向污染玉米中加標(biāo)，通過比較目標(biāo)峰的變化加以驗(yàn)證。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的確定

ZEN和OTA都易溶于甲醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯等極性溶劑?？紤]到丙酮和乙酸乙酯毒性較大，通常采用甲醇和乙腈作為提取溶劑。根據(jù)國標(biāo)，ZEN采用乙腈/水（90∶10，體積比）作為提取溶劑，而OTA采用甲醇/水（80∶20，體積比）作為提取溶劑，考慮到分別提取過程繁瑣，所以采用一種提取劑同時(shí)提取兩種目標(biāo)化合物。相比甲醇，乙腈更能減少蛋白質(zhì)、糖類、氨基酸和酶類的溶解性，避免它們對(duì)目標(biāo)物的干擾，因此選用乙腈/水（90∶10，體積比）作為兩者的共同提取溶劑，同時(shí)為了考察乙腈/水對(duì)于OTA的提取效果，本試驗(yàn)分別用乙腈/水（90∶10，體積比）和甲醇/水（80∶20，體積比）提取玉米中的OTA，見圖1和圖2。

圖1 提取溶劑為乙腈∶水（90∶10，體積比）時(shí)OTA的峰面積Fig.1 The peak area of OTA by extraction of acetonitrile/water（90 ∶10，volume ratio）

圖2 提取溶劑為甲醇∶水（80∶20，體積比）時(shí)OTA的峰面積Fig.2 The peak area of OTA by extraction of methanol/water（80 ∶20，volume ratio）

結(jié)果表明，當(dāng)分別采用兩種提取劑時(shí)，OTA的峰面積沒有顯著差異，乙腈/水（90∶10，體積比）對(duì)OTA同樣具有較好的提取效果。因此，本試驗(yàn)確定乙腈/水（90∶10，體積比）為樣品提取溶劑。

2.2 分離小柱的選擇

在不同過柱條件下ZEN和OTA的回收率見圖3。

圖3 不同過柱條件下ZEN和OTA的回收率Fig.3 The recoveries of ZEN and OTA by different columns

向玉米粉中添加30 μg/kg的ZEN和10 μg/kg的OTA，按照1.3.2描述的方法進(jìn)行前處理，除過柱條件不同外，其他步驟均相同。其中免疫親和柱的步驟參照GB/T 5009.209-2008《谷物中玉米赤霉烯酮的測(cè)定免疫親和層析凈化高效液相色譜法》[8]和GB/T 23502-2009《食品中赭曲霉毒素A的測(cè)定》[9]。結(jié)果表明，當(dāng)使用凈化柱時(shí)，玉米粉中ZEN和OTA的回收率最高，對(duì)于ZEN，過免疫親和柱和不過柱子回收率沒有顯著差異，而對(duì)于OTA，不過柱子回收率偏低，且雜峰較多。本試驗(yàn)所用凈化柱對(duì)玉米樣品中真菌毒素的提取回收率比免疫親和柱回收率要高，其對(duì)ZEN和OTA的回收率均在90%～95%；另外其操作步驟更為簡(jiǎn)便，凈化前也不需進(jìn)行活化、淋洗和洗脫等操作只需直接上樣，有效地減少了有機(jī)溶劑的使用和浪費(fèi)。

2.3 樣品定性

ZEN、OTA標(biāo)品加標(biāo)后的色譜圖見圖4和圖5。

圖4 玉米樣品中ZEN的定性Fig.4 The qualitative determination of ZEN in corn

圖5 玉米樣品中OTA的定性Fig.5 The qualitative determination of OTA in corn

ZEN和OTA的定性采用保留時(shí)間，當(dāng)保留時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰的保留時(shí)間一致時(shí)認(rèn)為是目標(biāo)化合物的色譜峰。本研究采用加標(biāo)法對(duì)該定性方法進(jìn)行確認(rèn)，防止其他化合物的干擾。結(jié)果表明，污染玉米和污染玉米加標(biāo)后均在與標(biāo)品的保留時(shí)間一致處出現(xiàn)了色譜峰，且加標(biāo)玉米的色譜峰峰高明顯大于污染玉米的色譜峰。這表明采用保留時(shí)間定性能夠確定目標(biāo)化合物的存在。

2.4 線性關(guān)系、檢出限和回收率

測(cè)定1.3.1中系列標(biāo)準(zhǔn)液，得到ZEN和OTA的外標(biāo)工作曲線見表1。

如表1 所示，ZEN 在 0.5 μg/mL～6 μg/mL，OTA 在0.05 μg/mL～0.8 μg/mL 范圍內(nèi)線性良好。方法的檢出限以加標(biāo)樣品色譜峰S/N≥3確定，結(jié)果見表2。

表1ZEN和OTA的線性曲線Table 1 The standard curve of ZEN and OTA

表2 玉米中ZEN和OTA的加標(biāo)回收率Table 2 The recoveries of ZEN and OTA

精確稱取25 g玉米粉，分別加入ZEN和OTA標(biāo)準(zhǔn)液，使ZEN和OTA在玉米粉中的濃度分別為30、60、120 μg/kg和 2.5、5、10 μg/kg。按照優(yōu)化的條件進(jìn)行處理和測(cè)定，外標(biāo)法定量。從表2可以看出，2種目標(biāo)化合物在各自的3個(gè)加標(biāo)水平下回收率為86.4%～114.1%，RSD小于10%，符合國際上對(duì)于食品污染物殘留檢測(cè)的要求。

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

收集不同品種的玉米，按照1.3.2優(yōu)化方法測(cè)定，結(jié)果如表3所示。

表3 不同玉米樣品中ZEN和OTA含量Table 3 Determination of ZEN and OTA in corn samples

數(shù)據(jù)表明，7個(gè)玉米樣品中ZEN的陽性檢出率為85.7%，超標(biāo)率 71.4%（≤60 μg/kg）[10]；OTA 陽性檢出率和超標(biāo)率均為 71.4%（≤5 μg/kg）[10]。百奧明公司調(diào)查了2009年～2011年全球7049份農(nóng)產(chǎn)品中的真菌毒素含量，其中ZEN和OTA的陽性率分別為45%和28%[11]。李榮濤等[12]利用單克隆抗體生物免疫技術(shù)測(cè)定了48份小麥樣本和33份玉米樣本，發(fā)現(xiàn)玉米赤霉烯酮的檢出率為 100%，含量為 18 μg/kg～730 μg/kg。相比這些結(jié)果，本研究中玉米樣品中ZEN和OTA污染較嚴(yán)重，這主要是由于取樣不同造成的。本試驗(yàn)所采集的樣品主要用于后期真菌毒素脫毒研究，因此一般會(huì)采集污染較嚴(yán)重玉米。

3 結(jié)論

本文建立玉米中ZEN和OTA的超高效液相色譜檢測(cè)方法。該方法對(duì)國標(biāo)中的方法進(jìn)行了簡(jiǎn)化，在所測(cè)定的范圍內(nèi)，該方法的線性良好，回收率高，重現(xiàn)性好，符合玉米樣品中痕量污染物檢測(cè)的要求。本方法代替了免疫親和柱的使用，減少了有機(jī)試劑的使用，使操作更加簡(jiǎn)單。另外對(duì)收集的玉米樣品進(jìn)行測(cè)定，ZEN和OTA污染較嚴(yán)重，因此應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)糧食中真菌毒素的檢測(cè)和監(jiān)管工作。

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Determination of Zearalenone and Ochratoxin A in Corn by Means of HPLC

ZHENG Rui-hang，ZHOU Zi-yan，F(xiàn)U Xiao，LIN Cheng-dong，SHEN Jian*
（Ningbo Institute for Food Control，Ningbo 315000，Zhejiang，China）

2017-01-19

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.030

鄭睿行（1982—），男（漢），高級(jí)工程師，碩士研究生，研究方向：食品質(zhì)量安全檢驗(yàn)。

*通信作者：沈堅(jiān)（1966—），男（漢），高級(jí)工程師，本科，研究方向：食品質(zhì)量安全檢驗(yàn)。