劉超，于永軍，趙興華，李希珍，陳俊榮

（滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河北滄州061001）

響應(yīng)面法優(yōu)化黃芪發(fā)酵工藝研究

劉超，于永軍，趙興華，李希珍，陳俊榮*

（滄州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河北滄州061001）

通過響應(yīng)面法優(yōu)化得到酵母菌發(fā)酵黃芪的最佳工藝。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量和初始pH值為響應(yīng)因素，以總黃酮含量為響應(yīng)值，利用Box-Behnken中心組合方法進(jìn)行四因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行響應(yīng)面分析。影響黃芪總黃酮含量的因素主次順序?yàn)榘l(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間＞接種量＞初始pH值，最佳發(fā)酵工藝條件為發(fā)酵時(shí)間9.46 d，發(fā)酵溫度29.07℃，接種量10.45%，初始pH 6.52，總黃酮預(yù)計(jì)含量為0.890 mg/mL，在此基礎(chǔ)上調(diào)整發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行試驗(yàn)，實(shí)際總黃酮含量為0.866 mg/mL，與預(yù)計(jì)含量相差2.70%。響應(yīng)面法優(yōu)化黃芪發(fā)酵工藝合理，可用于實(shí)踐。

響應(yīng)面法；工藝優(yōu)化；黃芪發(fā)酵；酵母菌

Abstract：To determine the optimal process of Radix Astragali fermented by yeast.On the basis of single factor experiments，a four-factor three-level Box-Behnken central composite design was utilized for mathematical modeling for total flavonoids content as a response to fermentation time，temperature，inoculum concentration and initial pH，followed by responses surface analysis of the relationship between the function and the four variables.The effect order of the four factors on the preparation technology was fermentation temperature＞time＞inoculum concentration＞initial pH.The optimal fermenting conditions were fermentation time 9.46 d，fermen tationtemperature29.07℃，inoculum concentration 10.45%，initial pH 6.52.Undersuchcondition，theestimatted content of total flavonoids contents was 0.890 mg/mL，experiments were conducted after adjusting the fermentation conditions.The actual content was 0.866 mg/mL，lower than estimated content 2.70%.Optimization of fermentation process by response surface methodology was reasonable，this method can be used in practice.

Key words：response surface methodology；optimization process；astragalus fermentation；yeast

黃芪是我國(guó)傳統(tǒng)的補(bǔ)氣中藥，迄今已有二千多年的歷史，具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗炎、抗衰老、抗腫瘤、抗氧化、保肝、防治糖尿病及降低腦缺血損傷等多種藥理作用[1]。其中黃酮是一種重要的藥效成分，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗病毒作用、抗應(yīng)激功效、促生長(zhǎng)、改善心肺功能等多種用途[2-4]。在微生物發(fā)酵中藥研究中，黃芪是研究比較多的一個(gè)中藥品種，相關(guān)研究文獻(xiàn)較多，從黃芪發(fā)酵菌種、工藝優(yōu)化、發(fā)酵方式、藥效評(píng)價(jià)、成分變化等方面都有所闡述[5-7]，但總體來說仍處于研究的初級(jí)階段。

酵母菌是單細(xì)胞真菌，是被人類廣泛應(yīng)用的微生物，也是發(fā)酵黃芪的重要菌種。山西中醫(yī)學(xué)院的郭羽、劉必旺等利用酵母菌發(fā)酵黃芪，對(duì)發(fā)酵后的多糖和黃酮進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)酵母菌發(fā)酵黃芪藥材對(duì)多糖含量有一定影響，且其產(chǎn)率與傳統(tǒng)水煎方法相比有一定程度的提高；他們發(fā)現(xiàn)黃芪發(fā)酵液可提高糖尿病大鼠的免疫力，對(duì)體內(nèi)、體外受試菌均有一定抑制作用，并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[8-10]。

本文以黃芪總黃酮的含量為因變量，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用統(tǒng)計(jì)軟件Design-Expert中響應(yīng)面法的Box-Behnken模式，對(duì)酵母菌發(fā)酵黃芪工藝進(jìn)行了研究[11-13]，為該藥材的資源開發(fā)與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃芪：安國(guó)藥材市場(chǎng)，經(jīng)鑒定為蒙古黃芪；酵母菌：滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥物研究所保藏；YPD瓊脂培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)藥品生物制品檢定所；碳酸鈣、乙醇、蒽酮等所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ZWY-240恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智誠(chéng)科技有限公司；超凈工作臺(tái)：海爾股份有限公司；MJ-78A全自動(dòng)滅菌鍋：施都凱儀器設(shè)備有限公司；BS 223S分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；HWS恒溫恒濕培養(yǎng)箱：北京科偉永興儀器有限公司；KN-130萬能粉碎機(jī)：長(zhǎng)沙康寧電子科技有限公司；H1650-W高速離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；756S/759S紫外可見分光光度計(jì)：上海棱光技術(shù)有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海振捷實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

配制YPD瓊脂斜面培養(yǎng)基→將保藏的酵母菌接種于斜面培養(yǎng)基→37℃恒溫培養(yǎng)2 d～3 d，觀察菌種管長(zhǎng)菌情況，發(fā)現(xiàn)染菌情況馬上處理→同樣方法活化3次，得到活化菌種。

1.3.2 種子液的制備

將活化菌種接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基，恒溫振蕩培養(yǎng)箱，搖床溫度30℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，培養(yǎng)24 h，作為種子液備用。

1.3.3 發(fā)酵液制備

黃豆芽500 g，加水1 000 mL，煮沸l(wèi) h，過濾后補(bǔ)足水分，分裝100 mL，加入5.0 g黃芪藥材粉末，121℃濕熱滅菌20 min，為發(fā)酵培養(yǎng)基。按一定比例的接種量將種子液接入一定初始pH值的發(fā)酵培養(yǎng)基，在一定溫度下，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min進(jìn)行恒溫振蕩培養(yǎng)，在培養(yǎng)一定時(shí)間后取出，進(jìn)行發(fā)酵液的前處理：6 000 r/min離心15 min，分離上清和殘?jiān)?，將?duì)照樣品進(jìn)行平行操作。

1.3.4 發(fā)酵工藝單因素試驗(yàn)

發(fā)酵時(shí)間對(duì)于黃芪總黃酮含量的影響：發(fā)酵時(shí)間為 1、3、5、7、9、11 d，接種量為 10%，發(fā)酵溫度為 28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min，初始pH值為6.5。

發(fā)酵溫度對(duì)于黃芪總黃酮含量的影響：發(fā)酵溫度為 20、24、28、32、36、40 ℃，發(fā)酵時(shí)間為 9 d，接種量為10%，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min，初始pH值為6.5。

接種量對(duì)于黃芪總黃酮含量的影響：接種量為5%、10%、15%、20%，發(fā)酵溫度為28℃，發(fā)酵時(shí)間為9 d，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min，初始pH值為6.5。

初始pH值對(duì)于黃芪總黃酮含量的影響：初始pH值為 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，發(fā)酵時(shí)間為 9 d，接種量為10%，發(fā)酵溫度為28℃，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min。

1.3.5 響應(yīng)面分析試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量、初始pH值這4個(gè)因素為自變量。根據(jù)Box-Benhnken設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面因素水平表Table 1 Factors and levels of the response surface design

以總黃酮的含量為響應(yīng)值，利用Design Expert 8.0.6.1軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出最佳發(fā)酵工藝，試驗(yàn)重復(fù)3次[14]。

1.3.6 黃芪總黃酮含量測(cè)定

黃芪總黃酮含量測(cè)定采用紫外分光光度法[15]，過程如下：首先配制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，經(jīng)處理后在510 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，測(cè)定吸光度，根據(jù)濃度與吸光度的關(guān)系制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程。然后制備樣品溶液，樣品經(jīng)處理后在最大吸收峰位置測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃芪總黃酮含量的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃芪總黃酮含量的影響見圖1。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)總黃酮含量的影響Fig.1 Effect of fermentation time on total flavonoids content

由圖1可知，發(fā)酵時(shí)間為1 d～9 d時(shí)，發(fā)酵液中總黃酮含量隨發(fā)酵時(shí)間的增加而增高，至9 d時(shí)達(dá)到最高。但當(dāng)發(fā)酵時(shí)間再增加時(shí)，總黃酮含量卻有略微下降。說明發(fā)酵時(shí)間過長(zhǎng)不利于總黃酮的形成，阻礙其生物轉(zhuǎn)化，使總黃酮的含量有所降低。

2.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)黃芪總黃酮含量的影響

發(fā)酵溫度對(duì)黃芪總黃酮含量的影響見圖2。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)總黃酮含量的影響Fig.2 Effect of temperature on total flavonoids content

由圖2可知，溫度對(duì)總黃酮的含量有一定的影響，發(fā)酵溫度到達(dá)28℃時(shí)含量最高，再繼續(xù)升高溫度總黃酮含量略緩慢下降，當(dāng)溫度過高時(shí)，總黃酮含量明顯下降。此結(jié)果與酵母菌的生長(zhǎng)規(guī)律相吻合，低溫和高溫都不利于菌體生長(zhǎng)，尤其是高溫對(duì)于菌體生長(zhǎng)抑制明顯。

2.1.3 接種量對(duì)黃芪總黃酮含量的影響

接種量對(duì)黃芪總黃酮含量的影響見圖3。

圖3 接種量對(duì)總黃酮含量的影響Fig.3 Effect of inoculum concentration on total flavonoids content

由圖3可知，接種量對(duì)總黃酮的含量的影響較小，接種量到達(dá)10%時(shí)含量最高，再繼續(xù)增大接種量總黃酮含量有所下降，但是變化幅度并不大。

2.1.4 初始pH值對(duì)黃芪總黃酮含量的影響

初始pH值對(duì)黃芪總黃酮含量的影響見圖4。

圖4 初始pH值對(duì)總黃酮含量的影響Fig.4 Effect of pH on total flavonoids content

由圖4可知，接種量對(duì)總黃酮的含量的影響較大，隨著pH值的升高，總黃酮含量逐漸增大，初始pH值到達(dá)6.0時(shí)含量最高，在6.0～7.0之間變化較小，超過7.0后，總黃酮含量下降明顯。

2.2 發(fā)酵工藝響應(yīng)面分析試驗(yàn)

2.2.1 數(shù)學(xué)模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)結(jié)果見2。

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)和結(jié)果Table 2 Design and results of response surface analysis

以黃芪發(fā)酵液中總黃酮的含量為響應(yīng)值，采用Design-Expert回歸分析軟件分析表2中的29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值，經(jīng)軟件綜合分析后，各試驗(yàn)因素對(duì)總黃酮含量的影響可采用如下回歸方程表示出來：

總黃酮含量=0.88+0.041×A+0.062×B+0.028×C+0.018×D+2.750×10-3×A×B-0.039×A×C-0.018×A×D-7.500×10-3×B×C-0.028×B×D-1.000×10-3×C×D-0.081×A2-0.14×B2-0.096×C2-0.077×D2

對(duì)模型進(jìn)行方差分析的結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面二次模型方差分析Table 3 Variance analysis of response surface quadratic mode

可以看出：P模型＜0.0001，表明模型差異極顯著；總黃酮含量失擬項(xiàng)P=0.1314，表明失擬不顯著，所選用的二次回歸模型是適當(dāng)?shù)?；?duì)模型進(jìn)行回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，得到模型一次項(xiàng) A、B、C（P＜0.01）差異極顯著，一次項(xiàng)D（P＜0.05）差異顯著，其影響強(qiáng)弱的排序?yàn)椋喊l(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間＞接種量＞初始pH值。

2.2.2 總黃酮的響應(yīng)面分析

利用Design-Expert軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的響應(yīng)面如圖5～圖10所示。

圖5 發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度的交互作用對(duì)總黃酮含量影響的響應(yīng)面Fig.5 Response surface plot showing the effects of time and temperature on total flavonoids contents

圖6 發(fā)酵時(shí)間和接種量的交互作用對(duì)總黃酮含量影響的響應(yīng)面Fig.6 Response surface plot showing the effects of time and inoculum concentration on total flavonoids contents

圖7 發(fā)酵時(shí)間和初始pH的交互作用對(duì)總黃酮含量影響的響應(yīng)面Fig.7 Response surface plot showing the effects of time and pH on total flavonoids contents

圖5～圖10為當(dāng)固定發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量和初始pH值中任意兩個(gè)因素為零水平時(shí)，其余兩個(gè)因素的交互作用及對(duì)總黃酮含量的影響?？傸S酮含量隨著任意兩個(gè)變量的增加均呈上升趨勢(shì)，當(dāng)達(dá)到某一定值時(shí)，曲面下降或區(qū)域平緩，通過響應(yīng)面圖能夠觀察出最高點(diǎn)。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過對(duì)回歸模型求解方程，得出黃芪發(fā)酵總黃酮最佳發(fā)酵工藝為發(fā)酵時(shí)間9.46 d，發(fā)酵溫度29.07℃，接種量10.45%，初始pH 6.52，在此條件下總黃酮預(yù)計(jì)含量為0.890 mg/mL。為了便于試驗(yàn)，把發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行調(diào)整如下：發(fā)酵時(shí)間9.5 d，發(fā)酵溫度29℃，接種量10.5%，初始pH 6.5，進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，所得總黃酮的含量的分別為0.866、0.875、0.858 mg/mL，其平均值0.866 mg/mL，與回歸方程所得的總黃酮預(yù)計(jì)含量0.890 mg/mL的相對(duì)誤差為2.70%，該回歸方程可用于實(shí)踐。

圖8 發(fā)酵溫度和接種量的交互作用對(duì)總黃酮含量影響的響應(yīng)面Fig.8 Response surface plot showing the effects of temperature and inoculum concentration on total flavonoids contents

圖9 發(fā)酵溫度和初始pH值的交互作用對(duì)總黃酮含量影響的響應(yīng)面Fig.9 Response surface plot showing the effects of temperature and pH on total flavonoids contents

圖10 接種量和初始pH值的交互作用對(duì)總黃酮含量影響的響應(yīng)面Fig.10 Response surface plot showing the effects of inoculum concentration and pH on total flavonoids contents

3 結(jié)論

黃芪是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材，其使用有幾千年的歷史，中藥發(fā)酵技術(shù)改善了黃芪的藥效作用，為更好的利用黃芪開創(chuàng)了一條新的道路?？傸S酮是黃芪中重要的藥效成分之一，對(duì)其發(fā)酵工藝的研究還比較欠缺，通過本試驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析，可以找到一種最有效的發(fā)酵工藝，為黃芪的開發(fā)和利用奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

以總黃酮含量為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化酵母菌發(fā)酵黃芪的最佳工藝條件為：發(fā)酵時(shí)間9.46 d，發(fā)酵溫度29.07℃，接種量10.45，初始pH 6.52，在此條件下黃酮預(yù)計(jì)含量為0.890 mg/mL。將發(fā)酵參數(shù)在此基礎(chǔ)上進(jìn)行調(diào)整，進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，所得總黃酮的平均含量為0.866 mg/mL，與回歸方程所得的總黃酮預(yù)計(jì)含量相差2.70%，該模型可較好的應(yīng)用于發(fā)酵工藝的優(yōu)化。

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Optimization of Fermentation Process of Radix Astragali by Response Surface Methodology

LIU Chao，YU Yong-jun，ZHAO Xing-hua，LI Xi-zhen，CHEN Jun-rong*
（Cangzhou Medical College，Cangzhou 061001，Heibei，China）

2017-03-24

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.014

河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃自籌經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（16272509）

劉超（1979—），女（漢），講師，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工藝優(yōu)化。

*通信作者：陳俊榮（1963—），女，教授，研究方向：黃芪發(fā)酵。