陳馮錢，黃杰濤，鄭婷婷，張蓮姬

（延邊大學(xué)理學(xué)院，吉林延吉133000）

微波輔助提取金花葵多糖工藝及體外抗氧化性研究

陳馮錢，黃杰濤，鄭婷婷，張蓮姬*

（延邊大學(xué)理學(xué)院，吉林延吉133000）

以多糖得率為指標(biāo)，采用正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化微波輔助提取金花葵多糖的工藝，并測(cè)定金花葵多糖的體外抗氧化活性。結(jié)果表明：微波輔助提取金花葵多糖的最佳工藝條件為微波功率280 W、微波輻射時(shí)間2 min、提取溫度70℃、提取時(shí)間3.0 h，在此條件下多糖平均得率為5.51%；金花葵多糖對(duì)羥基自由基、超氧陰離子自由基具有明顯的清除能力，并能夠有效抑制小鼠肝勻漿脂質(zhì)的過(guò)氧化，其IC50分別為0.068、1.23、1.20 mg/mL。

金花葵；多糖；微波輔助提取；抗氧化

Abstract：Based on polysaccharide yield indicators，the optimum processing conditions of microwave-assisted extraction of polysaccharides fromAurea helianthustemswere studied by orthogonal design method，and determined the antioxidant activity ofAurea helianthustemspolysaccharide.The results indicated that the optimum extraction parameters of polysaccharide were microwave power 280 W，microwave radiation time 2 min，hydrothermal extraction temperature 70℃，hydrothermal extraction time 3.0 h.Under the optimum conditions，the average extraction rate of polysaccharide was 5.51%.Aurea helianthustemspolysaccharide had the effective scavenging activities of hydroxyl radical and superoxide anion free radical.In addition，it could inhibit the peroxidation of the mouse liver homogenate.The IC50was 0.068，1.23，1.20 mg/mL，respectively.

Key words：Aurea helianthustems；polysaccharides；microwave-assisted extraction；antioxidant

金花葵（Aurea helianthustems）為錦葵科、秋葵屬1年生草本植物，在200多種秋葵屬植物中最具食用、藥用、保健價(jià)值的植物。目前野生金花葵瀕臨絕種，但在太行山東部山麓地區(qū)及晉中、晉南地區(qū)、東北地區(qū)有很多金花葵人工種植基地，其資源很豐富[1]。金花葵的花、莖、葉、種子中都含有豐富的生物活性物質(zhì)，如黃酮[2-3]、金絲桃苷[4]、不飽和脂肪酸[5]、微量元素[6]、揮發(fā)油[7]、多糖等[8]。

多糖在自然界分布極廣，亦很重要。有的是構(gòu)成動(dòng)植物細(xì)胞壁的組成成分，有的是作為動(dòng)植物儲(chǔ)藏的養(yǎng)分。近年來(lái)對(duì)多糖的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤、抗衰老、抗病毒、降血糖、抗輻射、調(diào)節(jié)免疫等[9]多種生物活性。目前，對(duì)金花葵的研究多數(shù)集中在栽培、黃酮、不飽和脂肪酸等方面，而對(duì)金花葵多糖的研究鮮有報(bào)道[10]。

微波輔助法作為一種新型技術(shù)，廣泛應(yīng)用于天然活性成分的提取，它具有穿透性強(qiáng)、能耗小、時(shí)間短、得率高等優(yōu)點(diǎn)[11]，而目前對(duì)金花葵中多糖的微波輔助提取和抗氧化活性的研究報(bào)道較少。本文以金花葵的莖葉粉為材料，以多糖得率為指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化微波輔助提取金花葵多糖的提取工藝，并對(duì)所提取的多糖從清除羥基自由基、清除超氧陰離子自由基和抑制小鼠肝勻漿脂質(zhì)的過(guò)氧化等3個(gè)方面進(jìn)行了抗氧化活性研究，以期為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)金花葵資源提供科學(xué)依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金花葵莖葉粉：金花葵莖葉由吉林省延吉市人工種植基地提供，實(shí)驗(yàn)室烘干，粉碎，過(guò)60目篩，裝入密封袋備用；小鼠：雄性，體重18 g～20 g，由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)部提供。

T6新世紀(jì)紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；80-2臺(tái)式離心機(jī)：金壇市科析儀器有限公司；LGWD700（MG-5012M）微波爐：樂(lè)金電子（天津）電器有限公司。

石油醚、無(wú)水乙醇、濃硫酸、苯酚、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鄰苯三酚、三氯乙酸、硫代巴比妥酸（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 金花葵多糖的提取工藝流程及得率計(jì)算

金花葵莖葉于60℃低溫烘干至恒質(zhì)量后粉碎過(guò)60目篩子→用石油醚和無(wú)水乙醇索氏抽提脫脂處理后60℃恒溫烘干→微波輔助水浸提取金花葵莖葉粉→離心→濃縮上清液→醇沉→離心→金花葵粗多糖→sevag法除蛋白[12]→活性炭脫色[13]→60℃恒溫烘干→金花葵多糖

金花葵多糖含量的測(cè)定及得率的計(jì)算：采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的線性回歸方程為y=0.010 5x-0.062 2，R2=0.997 4，參照文獻(xiàn)[14]測(cè)定其換算因子為1.093。按公式（1）計(jì)算多糖含量。

式中：C為測(cè)得的樣品溶液中葡萄糖濃度，μg/mL；D為樣品溶液稀釋倍數(shù)；f為換算因子；W為金花葵莖葉粉質(zhì)量，g。

1.2.2 單因素及正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

依次選擇微波功率、提取溫度、提取時(shí)間、微波輻射時(shí)間，設(shè)計(jì)不同水平，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，試驗(yàn)中料液比均為1∶30（g/mL），提取次數(shù)均為2次。每個(gè)單因素試驗(yàn)做出的最優(yōu)值作為下一組單因素的固定條件值。

微波功率的選擇為提取時(shí)間2 h，微波時(shí)間1 min，提取溫度 60 ℃，分別在 140、280、420、560、700 W 微波功率下提取多糖。

提取溫度的選擇為提取時(shí)間2 h，微波功率280 W，微波時(shí)間 1 min，分別在 40、50、60、70、80、90 ℃浸提條件下提取多糖；

提取時(shí)間的選擇為提取溫度70℃，微波功率280 W，微波輻射時(shí)間 1 min，分別在 1、1.5、2、2.5、3、3.5 h浸提時(shí)間下提取多糖；

微波輻射時(shí)間的選擇為提取溫度70℃，微波功率 280 W ，提取時(shí)間 3 h，分別在 1、2、4、6、8、10 min 的微波輻射時(shí)間條件下提取多糖。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，因素與水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.3 金花葵多糖體外抗氧化活性

羥基自由基清除率，參照H2O2/Fe體系法測(cè)定[15]，超氧陰離子自由基清除率，采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定[16]，對(duì)小鼠肝勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率，采用TBARS法測(cè)定[17]，并分別計(jì)算出IC50（清除率達(dá)到50%時(shí)反應(yīng)物的濃度）。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取金花葵多糖的單因素試驗(yàn)

微波功率、提取溫度、提取時(shí)間、微波輻射時(shí)間對(duì)金花葵多糖提取效果的影響如圖1、圖2、圖3、圖4所示。

圖1 微波功率對(duì)多糖得率的影響Fig.1 Effect of microwave power on polysaccharides extraction rate

圖2 提取溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.2 Effect of temperature on polysaccharides extraction rate

圖3 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction times on polysaccharides extraction rate

圖4 微波輻射時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.4 Effect of microwave radiation time on polysaccharides extraction rate

微波功率 140、280、420、560、700 W 條件下的金花葵多糖得率分別為2.8%、3.27%、2.98%、2.73%、2.51%，可見(jiàn)隨著微波功率的提高，得率先增加，后緩慢下降，280 W時(shí)得率最大。因此選擇280 W為最佳的微波功率。

提取溫度 40、50、60、70、80、90 ℃條件下的金花葵多糖得率分別為2.29%、2.87%、3.16%、4.95%、3.36%、3.05%，可見(jiàn)提取溫度為40℃～70℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，多糖得率也相應(yīng)的增加，在70℃時(shí)達(dá)到最大值，之后隨著溫度的增加，多糖得率開(kāi)始下降。探究其可能的原因是當(dāng)溫度較低時(shí)，不能夠充分提取出多糖，但溫度過(guò)高的時(shí)候，導(dǎo)致多糖的分解，其得率從而下降，因此選擇最佳的提取溫度為70℃。

提取時(shí)間 1、1.5、2、2.5、3、3.5 h 條件下的金花葵多糖得率分別為 3.21%、3.61%、3.82%、4.21%、5.08%、4.87%，可見(jiàn)提取時(shí)間1 h～3 h范圍內(nèi)，金花葵多糖得率隨提取時(shí)間的增加而升高，但超過(guò)3 h，得率反而開(kāi)始下降，因此選擇最佳的提取時(shí)間為3.0 h。

微波輻射時(shí)間 1、2、4、6、8、10 min 條件下的金花葵得率分別為 5.04%、5.46%、5.25%、4.96%、4.62%、4.53%，可見(jiàn)微波時(shí)間為2 min時(shí)，得率最高。輻射時(shí)間2 min之后，隨著時(shí)間的增加，多糖的得率緩慢下降，這是由于開(kāi)始時(shí)微波輻射時(shí)間的增加有助于多糖的溶出，但當(dāng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)受到破壞[18]，因此選擇最佳的微波輻射處理時(shí)間為2 min。

2.2 提取金花葵多糖的正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理見(jiàn)表3。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理表Table 3 The design and results of orthogonal test

由表3可知，各因素對(duì)金花葵多糖得率的主次因素為微波功率＞提取溫度＞微波輻射時(shí)間＞提取時(shí)間。從正交試驗(yàn)結(jié)果分析而知，最佳提取組合為A2B2C2D2，而由表3可以看出，最佳提取組合為A2B2C3D1。因此對(duì)這兩個(gè)組合進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，其結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 試驗(yàn)組的多糖得率結(jié)果Table 4 The result of polysaccharide sample’s experience%

由表4可知，A2B2C2D2組合優(yōu)于A2B2C3D1組合，因此微波輔助提取金花葵多糖的最佳工藝條件是微波功率為280 W，微波輻射時(shí)間為2 min，提取溫度為70℃，提取時(shí)間為3.0 h。

2.3 金花葵多糖抗氧化性的測(cè)定

金花葵多糖的濃度對(duì)羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除率的影響及對(duì)小鼠肝勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化的影響如圖5、圖6、圖7所示。

圖5 金花葵多糖濃度對(duì)羥基自由基清除率的影響Fig.5 Effects ofAurea helianthustemspolysaccharide concentration on clearance ratio of hydroxyl free radical

圖6 金花葵多糖濃度對(duì)超氧陰離子清除率的影響Fig.6 Effects ofAurea helianthustemspolysaccharide concentration on superoxide anion radical

圖7 金花葵多糖濃度對(duì)肝組織脂質(zhì)過(guò)氧化的影響Fig.7 Effects ofAurea helianthustemspolysaccharide concentration on lipid peroxide of liver homogenate

由圖5、圖6、圖7可知，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，金花葵多糖對(duì)自由基的清除率及脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率的影響是相同的，都隨金花葵濃度的增加而提高。金花葵多糖對(duì)兩種不同自由基的清除效果有顯著的區(qū)別，清除羥基自由基的IC50為0.068 mg/mL，而清除超氧陰離子自由基的IC50為1.23 mg/mL，濃度相差近18倍，說(shuō)明金花葵多糖對(duì)羥基自由基具有更好清除作用。金花葵多糖抑制小鼠肝組織脂質(zhì)過(guò)氧化的IC50為1.20 mg/mL，當(dāng)金花葵多糖的濃度為2.5 mg/mL時(shí)，其抑制率達(dá)80.2%，表明金花葵多糖能夠顯著抑制小鼠肝脂質(zhì)過(guò)氧化的發(fā)生。

3 結(jié)論

1）本研究經(jīng)單因素與正交試驗(yàn)優(yōu)化微波輔助提取金花葵多糖的工藝條件，即微波功為率280 W，微波輻射時(shí)間為2 min，提取溫度為70℃，提取時(shí)間為3.0 h。在最優(yōu)提取工藝條件下，金花葵多糖平均得率為5.51%，試驗(yàn)的4種因素對(duì)金花葵多糖得率的影響作用大小順序依次為微波功率＞提取溫度＞微波輻射時(shí)間＞提取時(shí)間。

2）在體外抗氧化試驗(yàn)中金花葵多糖表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力，金花葵多糖清除羥基自由基、超氧陰離子自由基的能力和對(duì)小鼠肝脂質(zhì)過(guò)氧化抑制能力均與其濃度呈正相關(guān)關(guān)系，對(duì)羥基自由基的清除能力大于超氧陰離子自由基的清除能力。

[1]盧丹,賈瑞波.中藥金花葵的研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥物評(píng)價(jià),2015,32(2):90-92

[2]蘭蓉,李浡,劉卉,等.金花葵總黃酮的提取和含量測(cè)定[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(12):280-282

[3]危晴,蘭蓉,辛秀蘭,等.紫外分光光度法測(cè)定金花葵籽中總黃酮的含量[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(12):7050-7060

[4]邱金玲,劉朋,熊維政,等.金花葵中金絲桃苷的含量測(cè)定[J].中醫(yī)學(xué)報(bào),2015,30(12):1793－1795

[5]李浡,胡定煜,李雙石,等．金花葵油中不飽和脂肪酸的GC-MS測(cè)定[J]．食品研究與開(kāi)發(fā),2012,33(5):121-123

[6]劉臨.原子吸收光譜法測(cè)定金花葵中微量元素[J].微量元素與健康研究,2008,25(4):27-29

[7]王剛,郭延磊.金花葵子揮發(fā)油的化學(xué)成分分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(14):7297－7298

[8]程麗敏,董爽,梁文明,等.金花葵莖可溶性糖的提取及抗氧化性研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2016,37(22):59-63

[9]申利紅,王建森,李雅,等.植物多糖的研究及應(yīng)用進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)2011,27(2):349-352

[10]黃杰濤,張蓮姬.響應(yīng)面法優(yōu)化金花葵多糖提取工藝[J].食品工業(yè)科技,2016,37(19):217-220

[11]張曉靜,龔婷,扶慶權(quán),等.響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取蘋果皮中總黃酮的工藝研究.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2015,50(6):148-155

[12]趙燕珠,吳周和,柯百勝,等.啤酒酵母多糖脫蛋白方法的應(yīng)用研究[J].食品工業(yè)科技,2009,30(10):244-249

[13]張麗紅,謝三都,徐芳,等.紫蘇葉多糖活性炭脫色工藝優(yōu)化[J].食品與機(jī)械,31(3):224-230

[14]張霞,聶少平,李景恩,等.夏枯草中多糖的提取與含量的測(cè)定[J].食品研究與開(kāi)發(fā)2012,33(12):81-85

[15]金鳴,蔡亞欣,李金榮,等.鄰二氮菲-Fe2+氧化法檢測(cè)H2O2/Fe體系產(chǎn)生的羥自由基[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,1996,23(6):553-555

[16]王威,左雙海,程超.貢水白柚柚皮乙醇提取物的體外抗氧化作用[J]．食品科學(xué),2010,15(31):143-148

[17]王新偉,崔言開(kāi),田雙起,等.牛至油、香芹酚、檸檬醛和肉桂醛的抗氧化性能研究[J]．食品工業(yè)科技,2013,34(14):311-314

[18]許麗麗,沈楚椰.溪黃草多糖的微波提取及其抗氧化性研究[J].食品研究與發(fā),2016,36(19):64-67

Microwave-assisted Extraction and Antioxidant Activities of Polysaccharides from Aurea helianthustems Polysaccharide

CHEN Feng-qian，HUANG Jie-tao，ZHENG Ting-ting，ZHANG Lian-ji*
（College of Science，Yanbian University，Yanji 133000，Jilin，China）

2017-02-06

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.011

延邊大學(xué)2016年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（ydbksky2016101）

陳馮錢（1996—），男（漢），本科在讀，研究方向：天然產(chǎn)物提取及活性研究。

*通信作者：張蓮姬，副教授，博士，研究方向：天然產(chǎn)物提取及活性研究。