虞旦,謝婭霏,蘇寧,安全,趙丹,王昌濤,李萌,*
(1.北京工商大學(xué)理學(xué)院,北京100048;2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院化妝品技術(shù)中心,北京100176;3.云南白藥集團(tuán)公司,云南昆明650500)
新鮮仙人掌多糖的提取及其抗氧化活性研究
虞旦1,謝婭霏1,蘇寧2,安全3,趙丹1,王昌濤1,李萌1,*
(1.北京工商大學(xué)理學(xué)院,北京100048;2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院化妝品技術(shù)中心,北京100176;3.云南白藥集團(tuán)公司,云南昆明650500)
對(duì)新鮮仙人掌提取多糖最優(yōu)工藝及其抗氧化效果進(jìn)行研究。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法RSM對(duì)熱水浸提新鮮仙人掌多糖提取條件進(jìn)行優(yōu)化,優(yōu)化后的工藝為:溫度64.25℃,時(shí)間1.5 h,液料比22.38∶1(mL/g),提取率高達(dá)(0.114 2±0.027 3)%,多糖純度為(37.686±9.009)μg/mL。利用體外實(shí)驗(yàn)?zāi)P驮u(píng)價(jià)其抗氧化性,結(jié)果表明該提取液對(duì)3種自由基有一定的清除能力,且呈劑量相關(guān)性,濃度分別為5.58、10.04、8.78 mg/mL的提取液可清除50%的DPPH自由基、羥自由基和ABTS+自由基。
仙人掌多糖;熱水浸提;抗氧化性;響應(yīng)面分析
Abstract:The extraction conditions ofO.dilleniipolysaccharide with a series of methods were examined.On the basis of one factor tests,the response surface methodology was used to optimize the boiling water extraction ofO.dilleniipolysaccharides.Design expert analysis indicated that the optimal processing conditions were:temperature 64.25 ℃,time 1.5 h,liquid to solid ratio 22.38 ∶1(mL/g),under these conditions,the extraction yield ofO.dilleniipolysaccharides was (0.114 2±0.027 3)%and mass concentration was (37.686±9.009)μg/mL.Vitro experimental model was used to evaluate the antioxidant activities,the results showed that the extracting liquid of theO.dilleniihad the capacity to scavenge three kind of free radical and scavenging activity was increased with the polysaccharide concentration.The extracting liquor with 5.58,10.04,8.78 mg/mL concentration of extracting liquor ofO.dilleniicould eliminate 50%DPPH free radical,hydroxyl radicals and ABTS+free radical.
Key words:O.dillenii polysaccharide;boiling water extraction;antioxidant capacity;response surface methodology(RSM)
仙人掌(Opuntia dilleniiHaw.),是石竹目仙人掌科(Cactaceae)的植物總稱,別名仙人扇、霸王樹、觀音掌、仙巴掌、火掌等,常生長(zhǎng)于沙漠及半沙漠等干燥少雨環(huán)境中,大小及形態(tài)多樣,屬于多肉植物。
仙人掌多糖(Opuntia dilleniiPolysaccharides,ODP)是仙人掌主要生物活性成分之一,主要提取自仙人掌的莖和果實(shí),主要由極性大分子化合物葡萄糖、阿拉伯糖和鼠李糖等組成,活性較高,能夠降血糖血脂、抗氧化、抑菌和保濕。多糖不溶于乙醇,易溶于水,現(xiàn)在已有的研究中對(duì)多糖的提取常用的方法有水提、酸提、堿提、苯酚提取、超聲輔助提取、微波輔助提取和酶提取等方法[1]。多糖的生物學(xué)功能眾多,臨床作用廣泛,尤其是在美容方面,據(jù)研究,仙人掌多糖有保濕、穩(wěn)定、改善膚色、抗衰老、抗菌等功能[2-5],因而可作為美容食品和化妝品的有效成分。且高分子多糖無(wú)毒副作用,與常用化妝品成分配伍性好,作為功效型化妝品添加劑將有著廣闊的前景[6]。
目前,如何高效、高純度、低成本地從中提取仙人掌多糖是研究的重點(diǎn)。由于過(guò)酸、過(guò)堿或溫度物理?xiàng)l件過(guò)極端都會(huì)一定程度上破壞仙人掌多糖的結(jié)構(gòu),所以在本課題中,選用了熱水浸提法,將更有利于多糖結(jié)構(gòu)的保護(hù)[7],此外,新鮮仙人掌肥厚的肉質(zhì)莖內(nèi)含有豐富的礦物質(zhì)、纖維素、SOD(Superoxide Dismutase,超氧化物歧化酶)和黃酮類等多種活性功能成分[8],為更好地保留這些活性物質(zhì),所以本試驗(yàn)用的是新鮮的去皮仙人掌進(jìn)行熱提,提取率基數(shù)是新鮮仙人掌重量,區(qū)別于其他文獻(xiàn)中將仙人掌烘干成干粉再提取。
選用生長(zhǎng)期為3~8個(gè)月的新鮮仙人掌:云南白藥集團(tuán)公司(這個(gè)生長(zhǎng)期內(nèi)的仙人掌富含仙人掌多糖ODP),未去皮原材料平均稱重約 130g/塊~200g/塊;葡萄糖、苯酚、硫酸、高氯酸、冰醋酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、硫酸銅、福林酚(均為分析純):國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;水(過(guò)濾超純水):由北京工商大學(xué)理學(xué)院實(shí)驗(yàn)室制備。
BS2202S型電子天平、A2492型電子天平:北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;DQHZ-2001A大容量全溫度振蕩培養(yǎng)箱:江蘇省太倉(cāng)市華美生化儀器廠;HH-2電熱恒溫水浴鍋:北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠;DSHZ-300恒溫水浴振蕩器:江蘇省太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì):北京普析通用儀器有限公司;YZB-蘇(錫)1132-2004低速大容量多管離心機(jī):無(wú)錫市瑞江分析儀器有限公司;HR2195攪拌機(jī)勻漿機(jī):飛利浦有限公司。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制,參照苯酚硫酸法[9],經(jīng)測(cè)定,在0~120 μg/mL濃度范圍內(nèi)吸光度A490對(duì)多糖濃度進(jìn)行線性回歸,標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=0.015 1x+0.004 2,R2=0.999 6,x為多糖濃度,μg/mL;y為吸光度值。
水溶性O(shè)DP樣品含量測(cè)定:準(zhǔn)確吸取樣品1 mL置于試管中,吸取0.5 mL 5%苯酚于試管,搖勻待其充分反應(yīng),再加入2.5 mL濃H2SO4,蓋上試管蓋,充分搖勻,并靜置5 min;將反應(yīng)后的試劑沸水浴1 h,取出在490 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)。
1.3.2.1 時(shí)間單因素試驗(yàn)
選取 1、2、3、4、5 h 這 5 個(gè)時(shí)間梯度作時(shí)間的單因素探究試驗(yàn)條件,固定液料比為20∶1(mL/g),提取溫度為70℃,提取pH值為7,取上層離心液6.6 mL,定溶于10 mL的容量瓶,測(cè)定多糖含量。設(shè)置3組平行。
1.3.2.2 溫度單因素試驗(yàn)
選取 50、60、70、80、90 ℃這 5 個(gè)溫度梯度作溫度的單因素探究試驗(yàn)條件,固定液料比為20∶1(mL/g),提取時(shí)間為3 h(因?yàn)? h時(shí)的提取率更高一些),提取pH值為7,取上層離心液6.6 mL,定溶于10 mL的容量瓶,測(cè)定多糖含量。設(shè)置3組平行。
1.3.2.3 液料比單因素試驗(yàn)
選取液料比 5 ∶1、10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1(mL/g)這6個(gè)梯度作液料比的單因素探究試驗(yàn)條件,為保持與除單因素之外的大部分試驗(yàn)條件相同,固定提取溫度為70℃,提取時(shí)間為3 h,提取pH值為7,取上層一定量離心液,使其稀釋倍數(shù)保持30倍,將溶液定溶于10 mL的容量瓶,測(cè)定多糖含量。設(shè)置3組平行。
1.3.2.4 pH單因素試驗(yàn)
選取 pH 值為 3、4、5、6、7、8、9、10 這 8 個(gè)梯度作pH值的單因素探究試驗(yàn)條件,為保持與除單因素之外的大部分試驗(yàn)條件相同,固定液料比為20∶1(mL/g),提取時(shí)間為3 h,提取溫度為70℃,取上層離心液6.6 mL,定溶于10 mL的容量瓶,測(cè)定多糖含量。設(shè)置3組平行。
在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較大的幾個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)(RSM),按照設(shè)計(jì)表格(見表1)進(jìn)行試驗(yàn),并測(cè)定多糖含量。
表1 響應(yīng)面RSM試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels for RSM experimental design
采用響應(yīng)面試驗(yàn)所得的最優(yōu)試驗(yàn)方法進(jìn)行多糖的提取,加入4倍體積的無(wú)水乙醇,冰箱冷藏24 h,次日于離心機(jī)3 000 r/min離心20 min,取沉淀,冷凍干燥,條件為-80℃,3 Pa,48 h。得到仙人掌粗多糖,再配置相當(dāng)濃度的樣品液用于抗氧化性分析。
將粗提仙人掌多糖配制不同濃度的ODP溶液,對(duì)不同濃度ODP溶液分別進(jìn)行DPPH自由基、ABTS+自由基和羥自由基清除率試驗(yàn),同時(shí)計(jì)算半抑制濃度IC50。
1.3.5.1 DPPH自由基清除試驗(yàn)[19]
取等體積(一般為3mL)的待測(cè)液與2×10-4mol/L的DPPH溶液混勻(1號(hào)管);取等體積的水與2×10-4mol/L的DPPH溶液混勻(2號(hào)管);取等體積的無(wú)水乙醇與待測(cè)液混勻(3號(hào)管)。反應(yīng)30 min后,在517 nm處測(cè)1,2和3號(hào)管的吸光度值,分別記為 A1,A2和 A3。DPPH 自由基清除率/%=(A0+A2-A1)/A0×100。
1.3.5.2 羥自由基清除試驗(yàn)[20]
取0.5 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲無(wú)水乙醇溶液于試管中,依次加入1 mL 0.15 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS,pH7.40)和 0.5 mL蒸餾水,充分混勻后,加入0.5 mL 0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液,混勻后,加入0.5 mL 0.01%雙氧水,于37℃水浴60 min后,在536 nm測(cè)其吸光值,所得數(shù)據(jù)為損傷管吸光度A損傷。未損傷管以0.5 mL蒸餾水代替損傷管中的0.5 mL 0.01%雙氧水,操作方法同損傷管,測(cè)得未損傷管的吸光度值A(chǔ)未損傷。樣品管以0.5 mL樣品代替損傷管中的0.5 mL蒸餾水,操作方法同損傷管,測(cè)得樣品管中的吸光度A樣品。羥自由基清除率/%=(A樣品-A損傷)/(A未損傷-A損傷)×100
1.3.5.3 ABTS+自由基清除試驗(yàn)[21]
將 5 mL 7 mmol/L ABTS+和 88 μL 140 mmol/L 過(guò)硫酸鉀溶液混合,在室溫、避光條件下靜置過(guò)夜,形成ABTS+儲(chǔ)備液。使用前用無(wú)水乙醇稀釋成工作液,使其在734 nm下的吸光度在0.70±0.02。在一系列比色管中,分別加入4 mL ABTS+工作液,再分別加入40 μL不同濃度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)品溶液,準(zhǔn)確振蕩30 s,測(cè)定反應(yīng)6 min后734 nm波長(zhǎng)下的吸光度。繪制吸光度與Trolox標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。取4 mL的ABTS+工作液置于試管中,加入40 μL樣品待測(cè)液,準(zhǔn)確振蕩30 s,6 min后測(cè)定在734 nm下的吸光度,取3個(gè)平行取平均值,記為 A。ABTS+自由基清除率/%=(1-A/0.700)×100。
按照方法1.3.2.1探究不同提取時(shí)間條件對(duì)ODP的提取率的影響,結(jié)果見圖1。
圖1 提取時(shí)間對(duì)ODP提取率的影響Fig.1 Effect of time on the polysaccharides content
如圖1所示,提取率隨著時(shí)間的增加而增加,到2h時(shí)達(dá)到了一個(gè)峰值0.162%,多糖濃度為53.46 μg/mL,隨后提取率雖有略微提升,但變化率不明顯,趨于平緩。可能是由于時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使ODP本身結(jié)構(gòu)分解導(dǎo)致提取率降低,本著工藝低成本和高提取率的原則,選擇1.5、2、2.5 h作為響應(yīng)面試驗(yàn)水平。
按照方法1.3.2.2探究不同提取溫度條件對(duì)ODP的提取率的影響,結(jié)果見圖2。
圖2 提取溫度對(duì)ODP提取率的影響Fig.2 Effect of temperature on the polysaccharides content
如圖2所示,提取率隨著溫度的增加變化率顯著,在溫度為60℃時(shí)達(dá)到了峰值0.171%,多糖濃度為56.43 μg/mL,隨后提取率隨著溫度的升高而降低,在80℃后變化開始趨于平緩??赡苁且欢囟认聲?huì)促進(jìn)ODP的溶出,過(guò)高溫度會(huì)破壞本身結(jié)構(gòu)導(dǎo)致提取率降低,因此,選擇55、60、65℃作為響應(yīng)面試驗(yàn)水平。
按照方法1.3.2.3探究不同提取液料比對(duì)ODP的提取率的影響,結(jié)果見圖3。
如圖3所示,ODP提取率隨著液料比的增加而增加,在液料比為20∶1(mL/g)時(shí)達(dá)到了峰值0.139%,濃度為45.87μg/mL,隨后提取率隨著液料比的升高而降低,在液料比35∶1(mL/g)后變化開始趨于平緩。說(shuō)明溶劑液料比對(duì)提取率有顯著的影響。因此,選擇15∶1、20 ∶1、25 ∶1(mL/g)作為響應(yīng)面試驗(yàn)水平。
圖3 提取液料比對(duì)ODP提取率的影響Fig.3 Effect of liquid-to-material ratio on the polysaccharides content
按照方法1.3.2.4探究不同提取pH值對(duì)ODP的提取率的影響,結(jié)果見圖4。
圖4 提取pH值對(duì)ODP提取率的影響Fig.4 Effect of pH on the polysaccharides content
如圖4所示,ODP提取率隨著pH值的變化波動(dòng)甚微,總體趨于平緩,只在pH值過(guò)酸和過(guò)堿出現(xiàn)了先降后升的情況,而在緒論中論述酸堿環(huán)境對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)影響中提到過(guò),過(guò)酸、過(guò)堿情況下都會(huì)一定程度對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)有損傷,故而,在響應(yīng)面試驗(yàn)上不將pH值作為一個(gè)水平。
根據(jù)上述4個(gè)單因素試驗(yàn)結(jié)果分析,可見其中溫度、時(shí)間、液料比3個(gè)因素對(duì)提取ODP有著顯著的影響,使用Design-Expert.8.05試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2,對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合得到響應(yīng)面分析結(jié)果見圖5至圖7,得到回歸方程:
Y=0.094+0.000 5X1+0.002 25X2+0.004 5X3-0.022X1X2+0.001 75X1X3-0.016X2X3-0.025X12+0.009 575X22-0.012X32,回歸方程中各變量對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性,由F檢驗(yàn)來(lái)判定,P值(F>Fα)越小,則相應(yīng)變量的顯著程度越高。從回歸分析結(jié)果(見表3)可以看出,各因素中X12在10%顯著水平下可認(rèn)為顯著,其它因素不是極顯著,而且 F(X3)>F(X2)>F(X1)。方差模型(R2=0.998 5)R值越接近1.0,說(shuō)明試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值的相關(guān)性越好。對(duì)回歸方程取一階偏導(dǎo)數(shù)等于零,整理如下:
表2 仙人掌熱水浸提工藝響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design matrix with experimental and predicted values on the yield of ODP
圖5Z=f(X1,X3)的響應(yīng)曲面和等高線Fig.5 Response surface and contour of Z=f(X1,X)
圖6Z=f(X1,X2)的響應(yīng)曲面和等高線Fig.6 Response surface and contour of Z=f(X1,X2)
圖7Z=f(X2,X3)的響應(yīng)曲面和等高線Fig.7 Response surface and contour of Z=f(X2,X3)
式(1)(2)(3)聯(lián)立方程組,解得 X1=0.003 62,X2=0.027 96,X3=0.169 12,將X1X2X3帶回回歸方程得試驗(yàn)理論結(jié)果,為0.094 41%,驗(yàn)證模型的可靠性,課題中采用最佳提取工藝:提取溫度為64.25℃,提取時(shí)間為 1.5 h,提取液料比為 22.38∶1(mL/g),在此條件下進(jìn)行平行試驗(yàn)3次,實(shí)際得率為(0.114 2±0.027 3)%,預(yù)測(cè)值為0.114 8%與預(yù)測(cè)值誤差為0.026 7%,與BBD預(yù)測(cè)值基本一致。因此,采用RSM優(yōu)化得到的提取工藝參數(shù)可靠性佳。
表3 仙人掌多糖得率的回歸方差分析表Table 3 Variance analysis of the regression equation for yield of ODP
將模型中的某一因素固定在零水平作響應(yīng)面圖可獲得另外兩個(gè)因素的交互作用圖。圖形的響應(yīng)曲面及其等高線圖的形狀可以反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱(如圖5、6、7)。響應(yīng)面的拋物面開口向下,且有極大值點(diǎn),說(shuō)明所選因素水平里包括了最優(yōu)組合[22]。等高線為橢圓形表示兩因素交互作用顯著,而圓形則說(shuō)明交互作用不顯著。比較3組圖可知:溫度比對(duì)仙人掌多糖浸提的影響最為顯著,表現(xiàn)為曲線較陡;而提取時(shí)間與料液比次之,表現(xiàn)為曲線較為平滑,且隨其數(shù)值的增加或減少,響應(yīng)值變化較小。
配置不同濃度VC溶液作為陽(yáng)性對(duì)照,分別采用了DPPH自由基、羥自由基、ABTS+自由基清除方法測(cè)定抗氧化性為仙人掌粗多糖溶液做參考。結(jié)果見圖8、圖9、表4。
圖8 VC對(duì)3種自由基清除能力比較Fig.8 The compare about three kinds of radical scavenging ability of VC
圖9 ODP對(duì)3種自由基清除能力比較Fig.9 The compare about three kinds of radical scavenging ability of ODP
表4 IC50結(jié)果Table 4 Results of IC50 mg/mL
由表4對(duì)比可以看出,仙人掌多糖對(duì)3種自由基均具有清除能力。隨著ODP的濃度的升高,對(duì)DPPH自由基的清除率在增加,ODP濃度達(dá)到6.4 mg/mL前,對(duì)DPPH的清除率增幅明顯,在6.4 mg/mL后增速逐漸趨于平緩,濃度達(dá)到25.6 mg/mL時(shí)清除率為90.03%。ODP對(duì)羥自由基的清除率曲線較DPPH自由基清除率曲線趨勢(shì)更平緩,在濃度12.8mg/mL前清除率變化率大于濃度12.8 mg/mL后的清除率。ODP對(duì)ABTS+自由基的清除率如圖所示,當(dāng)濃度由0.8 mg/mL升至3.2mg/mL時(shí),清除率變化明顯,在濃度由3.2mg/mL至12.8 mg/mL時(shí),清除率隨著濃度的增加而增加,增速平衡,在ODP濃度達(dá)到12.8 mg/mL后,清除率沒(méi)有明顯的變化,趨于平緩,在最后的區(qū)間內(nèi)清除率又瞬間有了增幅。由此可看出ODP對(duì)ABTS+自由基也有顯著的清除效果,但清除效果隨著ODP濃度的增加變化趨勢(shì)不穩(wěn)定。從表4中我們可以看出,DPPH自由基的IC50值小于羥自由基和ABTS+自由基的IC50值,說(shuō)明ODP對(duì)DPPH自由基的清除能力強(qiáng)于另外兩種自由基的清除能力。其中,羥自由基清除率的IC50值最大,說(shuō)明ODP對(duì)羥自由基的清除率最弱。
本課題探索的熱水浸提新鮮仙人掌多糖的響應(yīng)面優(yōu)化最佳提取工藝為提取溫度64.25℃,提取時(shí)間1.5 h,提取液料比 22.38 ∶1(mL/g),pH 值為 7,最優(yōu)得率為 (0.114 2±0.027 3)%,ODP 濃度為 (37.686±9.009)μg/mL,相對(duì)于其他文獻(xiàn)的多糖得率偏低,主要是因?yàn)樘崛÷视?jì)算基數(shù)的不同,本課題直接使用新鮮仙人掌莖提取,提取率基數(shù)是新鮮仙人掌重量,而采用仙人掌干粉提取的文獻(xiàn)中提取率基數(shù)是干粉重量,所以造成數(shù)據(jù)相差較大。
本課題探究了醇沉后粗多糖的抗氧化性。分別采用了DPPH自由基、羥自由基、ABTS+自由基清除方法,結(jié)果顯示仙人掌多糖ODP對(duì)3種自由基均有良好的清除作用,且對(duì)3種自由基清除的能力為:DPPH自由基>ABTS+自由基>羥自由基。研究中發(fā)現(xiàn)簡(jiǎn)潔預(yù)處理下的仙人掌多糖得率雖然低,但是抗氧化活性相對(duì)于已有的抗氧化活性研究成果中,抗氧化性能更佳。
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Extracting Conditions and Antioxidant Activities of the Polysaccharides Extracted from Fresh Opuntia dillenii
YU Dan1,XIE Ya-fei1,SU Ning2,AN Quan3,ZHAO Dan1,WANG Chang-tao1,LI Meng1,*
(1.School of Science,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China;2.Cosmetic Center,Chinese Academy of Inspection and Quarantine,Beijing 100176,China;3.Yunnan Baiyao Group Co.,Ltd.,Kunming 650500,Yunnan,China)
2017-07-17
10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.007
中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)裝箱資金資助項(xiàng)目(2015JK015);質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)項(xiàng)目(201310132);質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)項(xiàng)目(201410019)
虞旦(1993—),女(漢),碩士研究生在讀,研究方向:化妝品原料。
*通信作者:李萌,女,副教授,博士,研究方向:化妝品原料。