顏輝　蔡豪　賈俊強

摘要：為開發(fā)一種新型降血糖肽，以牡丹籽蛋白為原料，探索使用生物酶法制備牡丹籽降血糖肽。以α-葡萄糖苷酶抑制活性為標準，使用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶進行最佳酶類篩選，選擇抑制活性最好的酶，然后使用單因素試驗、響應(yīng)面試驗優(yōu)化工藝條件。胰蛋白酶的抑制效果最好，響應(yīng)面優(yōu)化得到最優(yōu)工藝條件：蛋白濃度為08%、加酶量為5 401.57 U/g、溫度為37.62 ℃、時間為43.18 min、pH值=8.07。該條件下經(jīng)過試驗驗證α-葡萄糖苷酶的實際抑制率達到22.21%，與預(yù)測值22.11%基本吻合，模型回歸顯著。該結(jié)論為牡丹籽降血糖肽進一步研究與生產(chǎn)提供基礎(chǔ)，也為牡丹籽蛋白高效利用提供新方向。

關(guān)鍵詞：牡丹籽蛋白；α-葡萄糖苷酶抑制率；酶解；響應(yīng)面法；最優(yōu)工藝條件

中圖分類號： R284.2文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）14-0167-04

牡丹油是我國新型的食用油，其中牡丹籽的含油率為29%[1]，粗蛋白含量約占20%，蛋白含量較為豐富。牡丹油營養(yǎng)價值高，需求量也越來越大。迄今為止，油料牡丹的種植面積已達2萬hm2以上[2]。榨油后的牡丹籽粕多作為飼料，深層次的加工利用較少，如何高效利用牡丹籽蛋白是本領(lǐng)域亟待解決的問題[3]。

糖尿病是一種嚴重影響人們身體健康的疾病[4]。近年來，隨著經(jīng)濟飛速發(fā)展，人們的飲食越來越好，運動卻日趨減少，糖尿病的發(fā)病率逐年增加。傳統(tǒng)的降血糖藥分為葡萄糖苷酶抑制劑、胰島素增敏劑、胰島素促分泌劑、中成藥、胰島素、雙胍類、磺酞脲類等7種藥物類型[5-7]，由于藥物治療存在副作用，長期使用患者難以接受。近年來，通過食療達到控制血糖的方法越來越受到人們的青睞，其中新開發(fā)的α-葡萄糖苷酶抑制物是專家學(xué)者的努力方向。

最新研究表明，蛋白質(zhì)經(jīng)過蛋白酶酶解之后所獲得的生物活性物質(zhì)多肽具有降血壓、降血脂等功效[8]，雜色蛤、蠶絲、蛋清、乳清等蛋白經(jīng)過酶解也表現(xiàn)出一定的α-葡萄糖苷酶抑制作用，可以起到輔助降血糖作用[9-14]。以牡丹籽蛋白為酶解底物、酶解多肽對α-葡萄糖苷酶活性抑制率為評價指標，建立制備方法，并采用響應(yīng)面法進行工藝優(yōu)化，獲得最佳酶解參數(shù)，為開發(fā)新型降血糖多肽提供試驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與儀器

試驗動物為昆明小鼠，購自江蘇大學(xué)試驗動物中心（合格證編號：20152299）。

試驗材料與藥品：牡丹籽購自安徽省亳州市譙城區(qū)萬畝藥材種植農(nóng)民專業(yè)合作社；對硝基苯酚-α-吡喃葡萄糖苷（pNPG）購自阿拉丁試劑（上海）有限公司；胰蛋白酶（質(zhì)量比1 ∶250）、木瓜蛋白酶均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；堿性蛋白酶購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1牡丹籽蛋白的制備

牡丹籽經(jīng)65 ℃烘干12 h，剝殼，65 ℃烘干8 h，榨油，將所得牡丹籽粕烘干粉碎，與蒸餾水按照料液比1 g ∶[KG-*3]10 mL混溶，1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至 9.5，50 ℃超聲水浴2 h，3 800 r/min離心15 min；所得沉淀重復(fù)提2次，合并所得溶液，4 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值至4.5，4 000 r/min 離心15 min，棄上清；將所得沉淀55 ℃烘干，粉碎，過40目篩得到牡丹籽蛋白。

1.2.2α-葡萄糖苷酶制備

脫臼處死小鼠，取小腸浸泡于0 ℃生理鹽水中，洗去雜物，液氮研磨。將研磨粉與pH值=6.8的0.05 mol/L磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，簡稱PBS）質(zhì)量體積比1 mg ∶10 mL加入，渦旋振蕩 30～60 s，4 ℃ 8 000 r/min離心10 min，取上清。

1.2.3檢測方法

酪氨酸標準曲線與酶活力的測定方法參照周景祥等的方法[15]；α-葡萄糖苷酶抑制率測定方法參照Lee等的方法[14]。

1.2.4單因素條件的篩選與響應(yīng)面試驗設(shè)計

以α-葡萄糖苷酶抑制率為評價指標，通過單因素試驗對加酶量、底物濃度、溫度、時間、pH值等條件進行篩選。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，將加酶量、溫度、時間、pH值作為響應(yīng)面設(shè)計的響應(yīng)值進行分析。

1.2.5數(shù)據(jù)分析

通過Design Expert 8.0.6軟件建立響應(yīng)面模型與分析數(shù)據(jù)。

2結(jié)果與分析

2.1酶類篩選的結(jié)果

分別選取豬胰蛋白酶、地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶進行蛋白酶的篩選試驗。反應(yīng)體系為50 mL，時間為 3 h，底物濃度為2%，按照各自適宜pH值、溫度進行反應(yīng)。酶解反應(yīng)容器放在恒溫水浴鍋內(nèi)，間歇攪拌，加入1 mol/L NaOH溶液維持pH值穩(wěn)定。反應(yīng)結(jié)束后，沸水浴10 min滅酶，冷卻之后8 000 r/min離心10 min，取上清液檢測α-葡萄糖苷酶抑制率。

由表1可知，堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶的酶解多肽產(chǎn)物對α-葡萄糖苷酶的抑制效果較差，胰蛋白酶酶解產(chǎn)物抑制效果較好。這可能是因為堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶的酶切位點較為廣泛導(dǎo)致產(chǎn)物多樣，胰蛋白酶酶切位點較為特殊，酶切位點集中在精氨酸（arginine，簡稱Arg）、賴氨酸（lysine，簡稱Lys）為羧基端的肽鍵部分[16]，特殊序列能對α-葡萄糖苷酶分子產(chǎn)生抑制作用。因此，選擇胰蛋白酶進行試驗。

2.2單因素試驗結(jié)果

2.2.1不同酶解時間對抑制率的影響

在不同時間點0、10、20、30、40、50、60、70 min，加酶量為5 000 U/g，底物濃度為0.8%，溫度為37 ℃，pH值=8.0的條件下分別檢測抑制效果。由圖1可知，在0～40 min時抑制率不斷上升，可能是因為胰蛋白酶將牡丹籽蛋白質(zhì)切成具有抑制活性的多肽不斷增多，在40 min時抑制率達到最高，繼續(xù)延長反應(yīng)時間，抑制率并未有明顯增加，因此選擇40 min作為最優(yōu)時間。

2.2.2不同加酶量對抑制率的影響

在加酶量為0、2 000、3 000、4 000、5 000、6 000 U/g，時間為40 min，底物濃度為 0.8%，溫度為37 ℃，pH值=8.0的條件下分別檢測抑制效果。由圖2可知，加酶量在0～6 000 U/g范圍內(nèi)，α-葡萄糖苷酶抑制率隨著加酶量增加明顯增強，當超過 5 000 U/g 之后增幅平緩，這可能是酶分子結(jié)合位點達到飽和，反應(yīng)速度增加緩慢。因此，選擇5 000 U/g的加酶量作為最適加酶量。

2.2.3不同底物濃度對抑制率的影響

在底物濃度為0、02%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、2.0%、3.0%，加酶量為 5 000 U/g，時間為40 min，溫度為37 ℃，pH值=8.0條件下分別檢測抑制效果。由圖3可知，底物濃度在0～0.8%內(nèi)，隨著底物的逐漸增多，抑制率明顯上升，在0.8%～3.0%內(nèi)，抑制率上升緩慢，一方面可能是蛋白中存在一定的蛋白酶抑制劑[17]，一方面酶分子達到飽和。為了更加經(jīng)濟，選擇0.8%濃度進行響應(yīng)面設(shè)計。

2.2.4不同pH值對抑制率的影響

在pH值為6、7、8、9、10，加酶量為5 000 U/g，時間為40 min，溫度為37 ℃，底物濃度為0.8%時，分別檢測抑制效果。由圖4可知，在6～10的范圍內(nèi)，隨著pH值的增加，α-葡萄糖苷酶的抑制率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；在pH值為8.0時達到最大值；pH值在 8～10范圍內(nèi)，抑制率下降。這表明胰蛋白酶的最適pH值為8.0，因此選擇8.0作為最優(yōu)pH值。

2.2.5不同溫度對抑制率的影響

在溫度為31、34、37、40、43 ℃，加酶量為5 000 U/g，時間為40 min，底物濃度為 0.8%，pH值為8.0時分別檢測抑制效果。由圖5可知，在溫度31～37 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度升高，抑制率逐漸增高，對于 α-葡萄糖苷酶的抑制率呈快速上升趨勢，37 ℃時達到頂點，然后在37～43 ℃時緩慢下降，表明胰蛋白酶的最適溫度為37 ℃，因此選擇 37 ℃ 作為最優(yōu)溫度。

2.3響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.3.1響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

為優(yōu)化酶解工藝，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用二次回歸旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計，對酶解工藝進行優(yōu)化試驗，選取加酶量（A）、溫度（B）、時間（C）、pH值（D）作為4個因素， 每個因素選取5個顯著水平結(jié)合前期單因素結(jié)果，設(shè)定各因素水平編碼（表2），響應(yīng)面設(shè)計與結(jié)果如表3所示。

2.3.2模型方差分析

在蛋白質(zhì)酶解的工藝參數(shù)中，影響抑制效果的因素按照主次順序排列：A（加酶量）>B（溫度）>C（時間）>D（pH值）。加酶量和溫度有顯著差異，時間和pH值無差異顯著性；加酶量與溫度、pH值存在交互作用，達到顯著水平。

模型極其顯著，失擬項不顯著；總決定系數(shù)R2=0958 5，調(diào)整決定系數(shù)R2=0.896 3，說明該模型的擬合程度較好，該方程模型成立，可以進行預(yù)測（表4）。

抑制率=21.7+1.49A+1.23B+0.61C-0.52D-1.5AB-0.6AC+1.72AD+0.76CD-1.74A2-2.09B2-0.85C2-2.09D2。

在分析回歸模型結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)上述二次方程，作酶解加酶量、溫度、時間、pH值對抑制率影響的響應(yīng)面圖，分析2個因素交互作用的影響[18]。由圖6-a可知，沿酶解加酶量方向等高線比溫度方向等高線密集，說明加酶量對抑制率的影響要大于酶解溫度的影響；由圖6-b可知，沿加酶量等高線比時間等高線密集，說明加酶量對抑制率的影響大于時間的影響；由圖6-c可知，沿pH值等高線遠遠比加酶量等高線密集，說明pH值對抑制率的影響高于加酶量；由圖6-d可知，沿pH值的等高線密度比時間因素等高線密集，說明pH值對抑制率的影響高于時間。

在底物濃度為0.8%的條件下，經(jīng)過響應(yīng)曲面分析得出酶解牡丹籽蛋白最優(yōu)工藝條件：加酶量為5 401.57 U/g，溫度為37.62 ℃，時間為43.18 min，pH值為8.07，此條件預(yù)測抑制率達到22.11%。為驗證模型可靠性，進行3次驗證，測得抑制率為22.21%，與預(yù)測值基本一致?？梢?，得到的優(yōu)化工藝參數(shù)準確可靠，具有實用性。

3結(jié)論

牡丹籽蛋白是一種新型的蛋白，作為傳統(tǒng)飼料利用價值較低。本研究選用牡丹籽蛋白，以α-葡萄糖苷酶抑制率為指標，通過單因素篩選和響應(yīng)面試驗得出最優(yōu)酶解工藝：蛋白濃度為0.8%、加酶量為5 401.57 U/g、溫度為37.62 ℃、時間為43.18 min、pH值為8.07，抑制率達到22.11%，經(jīng)過驗證試驗抑制率為22.21%，因此模型可靠，回歸顯著，具有應(yīng)用價值。本試驗為酶法制備牡丹籽降血糖肽的進一步研究提供基礎(chǔ)，也為牡丹籽蛋白的高效利用指引一條新的道路。

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