史殿魁，魏明

(1 沈陽(yáng)市第七人民醫(yī)院，沈陽(yáng)110003；2 鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院)

PDTC對(duì)大鼠放射性肺損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制

史殿魁1，魏明2

(1 沈陽(yáng)市第七人民醫(yī)院，沈陽(yáng)110003；2 鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院)

目的探討氫吡咯二硫代氨基甲酸酯(PDTC)對(duì)大鼠放射性肺損傷的保護(hù)作用及其對(duì)肺組織核因子κB(NF-κB)、細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)表達(dá)的影響。方法將60只Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組和PDTC組，每組20只。模型組、PDTC組采用6 MV X射線照射雙肺制作放射性肺損傷模型。PDTC組照射前3天開(kāi)始皮下注射PDTC 10 mg/kg，持續(xù)至照射后30天。正常對(duì)照組和模型組同期注射等體積生理鹽水。各組照射開(kāi)始后8、24周處死后取肺組織，部分右肺組織行HE、Masson染色，觀察肺組織病理變化；取右肺中上葉，檢測(cè)羥脯氨酸表達(dá)；取左肺組織，稱濕重，計(jì)算肺系數(shù)；取右肺下葉，檢測(cè)肺組織ICAM-1、NF-κB mRNA表達(dá)。結(jié)果正常對(duì)照組右肺組織均未見(jiàn)明顯異常。照射開(kāi)始后8周，模型組肺組織病變以滲出為主，并出現(xiàn)少許膠原纖維沉積；照射開(kāi)始后24周，肺泡壁增厚，肺泡腔明顯變小，肺間質(zhì)內(nèi)各種細(xì)胞成分增多，可見(jiàn)明顯的局部灶性纖維化區(qū)域。PDTC組照射開(kāi)始后8、24周肺組織病變較模型組同期明顯減輕，纖維化增厚主要集中在支氣管及血管外膜，肺泡區(qū)域幾乎未見(jiàn)明顯纖維化。模型組照射開(kāi)始后8、24周肺組織羥脯氨酸表達(dá)、肺系數(shù)均高于正常對(duì)照組(P均<0.05)，PDTC組各時(shí)間點(diǎn)肺組織羥脯氨酸表達(dá)、肺系數(shù)較模型組同時(shí)間點(diǎn)明顯降低(P均<0.05)，但仍高于正常對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)(P均<0.05)。模型組照射開(kāi)始后8、24周肺組織ICAM-1、NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于正常對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)(P均<0.05)，PDTC組各時(shí)間點(diǎn)肺組織ICAM-1、NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量均較模型組同時(shí)間點(diǎn)降低(P均<0.05)，且高于正常對(duì)照組(P均<0.05)。結(jié)論P(yáng)DTC能減輕放射性肺損傷大鼠的肺部炎癥和纖維化程度，其機(jī)制可能與抑制NF-κB活化、調(diào)控ICAM-1表達(dá)有關(guān)。

放射性肺損傷；氫吡咯二硫代氨基甲酸酯；核因子κB；細(xì)胞間黏附分子1

放射治療(簡(jiǎn)稱放療)是食管癌、肺癌、乳腺癌等惡性腫瘤的主要治療手段之一。放療常會(huì)造成正常肺組織不同程度損傷[1]，故其為胸部疾病放療的主要限制性因素。目前放射性肺損傷的發(fā)生機(jī)制尚不清楚[2]。核因子κB(NF-κB)是一種控制編碼細(xì)胞因子、細(xì)胞黏附分子的轉(zhuǎn)錄因子，細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)是炎性反應(yīng)過(guò)程中的一種重要的細(xì)胞因子，在放射性肺損傷過(guò)程中，二者表達(dá)均升高[3，4]；說(shuō)明NF-κB、ICAM-1可能參與放射性肺損傷過(guò)程。氫吡咯二硫代氨基甲酸酯(PDTC)是一種人工合成的二硫氨基酸脂，具有抑制NF-κB活化、抗炎等作用[5]，其能否用于治療放射性肺損傷目前尚不清楚。2015年7月～2016年12月，本研究探討PDTC對(duì)大鼠放射性肺損傷的干預(yù)作用及其對(duì)肺組織NF-κB、ICAM-1表達(dá)的影響，旨在為臨床放射性肺損傷的靶向治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 雌性Wistar大鼠60只，SPF級(jí)，8周齡，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)自鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(豫)2013-0005。PDTC，純度99%，美國(guó)Sigma公司。HE染液及Masson染液，南京建成生物工程研究所；即用型SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒、ICAM-1兔IgG多克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司；NF-κB多克隆抗體，美國(guó)Santa Cruze公司。醫(yī)用直線加速器，德國(guó)西門(mén)子公司；TEC-2800型生物組織石蠟包埋機(jī)，意大利郝思琳公司；BX50型光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司；RY-2235型石蠟切片機(jī)，德國(guó)Leica公司；HPIAS-100型彩色高清晰度病理圖像分析儀，西安華海電子有限公司。

1.2 放射性肺損傷模型制作及分組處理 所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、模型組和PDTC組，每組20只。模型組和PDTC組制備放射性肺損傷模型，具體方法：腹腔注射2%戊巴比妥鈉45 mg/kg麻醉，仰臥于固定裝置上，胸部覆蓋1 cm厚蠟塊，以調(diào)整劑量分布。醫(yī)用直線加速器6 MV X射線照射雙肺，鉛擋遮蔽縱隔，吸收劑量率2 Gy/min，照射野4 cm×3 cm，源皮距100 cm，每只照射8 Gy/d，連續(xù)照射5天，總劑量40 Gy。PDTC組從照射前3天開(kāi)始，皮下注射PDTC溶液10 mg/kg，持續(xù)至照射開(kāi)始后30天。正常對(duì)照組和模型組同期皮下注射等體積生理鹽水。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察 至照射24周，正常對(duì)照組、模型組、PDTC組分別存活20、10、14只。照射8、24周時(shí)，各組隨機(jī)取5只，斷頸處死，取雙肺組織，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。右肺組織用于觀察肺組織病理形態(tài)變化、檢測(cè)肺組織羥脯氨酸表達(dá)及ICAM-1、NF-κB mRNA表達(dá)，左肺組織用于計(jì)算肺系數(shù)。

1.3.1 肺組織病理變化 取部分右肺組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，完全脫水后石蠟包埋，室溫靜置1 h，-20 ℃冰箱凍存2 h，4 μm厚連續(xù)切片。將石蠟切片浸于水中完全舒展，置于烤箱中干燥1～2 h。然后分別行HE染色和Masson染色，顯微鏡下觀察支氣管黏膜及黏膜下肺組織充血、水腫和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維化情況。

1.3.2 肺組織羥脯氨酸表達(dá) 取各組右肺中上葉(約50 mg)，去掉周?chē)Y(jié)締組織，按照羥脯氨酸試劑盒說(shuō)明，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)560 nm波長(zhǎng)處吸光度(A)值，計(jì)算羥脯氨酸表達(dá)。羥脯氨酸表達(dá)(μg/mg)=[測(cè)定管A值-空白管A值]/[標(biāo)準(zhǔn)管A值-空白管A值]×標(biāo)準(zhǔn)管含量(5 μg/mL)×水解液總體積(10 mL)/肺組織濕重(50 mg)。

1.3.3 肺系數(shù) 取左肺組織稱重，計(jì)算肺系數(shù)。肺系數(shù)=肺濕重/體質(zhì)量×100%。

1.3.4 肺組織ICAM-1、NF-κB mRNA表達(dá) 采用RT-PCR法。取右肺下葉，異硫氰酸胍一步法提取肺組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增引物由上海博亞生物有限公司設(shè)計(jì)合成。內(nèi)參照采用β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)，引物序列：ICAM-1上游引物：5′-GGCGTCCATTTACACCTATTC-3′，下游引物：5′-TTCCTTTTCTTCTCTTGCTTG-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度382 bp；NF-κB上游引物：5′-CCCCATGGTTCAGAAGCTTG-3′，下游引物：5′-TTGAACGACCATCGATGAAA-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度410 bp；β-actin上游引物：5′-GGGCTGTATTCCCCTCCATC-3′，下游引物：5′-GTCACGCACGATTTCCCTCTC-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度272 bp。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，56 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，共33個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后掃描拍照，用KODAKID型凝膠成像分析系統(tǒng)分析擴(kuò)增產(chǎn)物灰度值。以目的基因與內(nèi)參基因電泳條帶校正光密度值的比值作為目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組肺組織病理形態(tài)變化 ① HE染色：正常對(duì)照組肺組織可見(jiàn)肺泡壁纖細(xì)，毛細(xì)血管壁完整，無(wú)滲出和出血，結(jié)構(gòu)清晰；照射開(kāi)始后8周，模型組肺組織病變以滲出為主，表現(xiàn)為肺間質(zhì)及肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張充血、出血、間質(zhì)水腫致肺泡壁輕度增厚，同時(shí)伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；照射開(kāi)始后24周，肺泡壁增厚，肺泡腔明顯變小，壁內(nèi)成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和毛細(xì)血管數(shù)目增多，肺間質(zhì)內(nèi)各種細(xì)胞成分增多。PDTC組各時(shí)間點(diǎn)病變均較模型組明顯減輕。見(jiàn)插頁(yè)Ⅰ圖3。②Masson染色：正常對(duì)照組肺組織未見(jiàn)明顯纖維化；模型組肺組織在照射開(kāi)始后8周開(kāi)始即出現(xiàn)少許膠原纖維沉積，照射開(kāi)始后24周可見(jiàn)明顯的局部灶性纖維化區(qū)域，證實(shí)肺纖維化形成；PDTC組各時(shí)間點(diǎn)纖維化程度均較模型組減輕，纖維化增厚主要集中支氣管及血管外膜，肺泡區(qū)域幾乎未見(jiàn)明顯纖維化。見(jiàn)插頁(yè)Ⅰ圖4。

2.2 各組肺組織羥脯氨酸表達(dá)及肺系數(shù)比較 見(jiàn)表1。

表1 各組肺組織羥脯氨酸表達(dá)及肺系數(shù)比較

注：與正常對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05；與模型組同時(shí)間點(diǎn)比較，#P<0.05。

2.3 各組肺組織ICAM-1、NF-κB mRNA表達(dá)比較 見(jiàn)表2。

表2 各組肺組織ICAM-1、NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3 討論

美國(guó)放射腫瘤治療協(xié)作組將發(fā)生在放療90天內(nèi)的放射性損傷稱為急性放射性損傷，超過(guò)90天發(fā)生的放射性損傷稱為晚期放射性損傷。早期放射性肺損傷主要為放射性肺炎，是一種由免疫介導(dǎo)的以淋巴細(xì)胞性肺泡炎為主的局部放射反應(yīng)。晚期放射性肺損傷主要為放射性纖維化，是因靶細(xì)胞損傷后釋放多種細(xì)胞因子，啟動(dòng)成纖維細(xì)胞進(jìn)行增殖，導(dǎo)致膠原蛋白大量合成，最終使大量膠原沉積在肺間質(zhì)。放射性肺損傷是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過(guò)程，多種細(xì)胞因子在其發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起調(diào)控作用。NF-κB是一個(gè)多功能核轉(zhuǎn)錄因子，生物學(xué)活性廣泛，且極易被激活，如TNF-α、射線等。激活后的NF-κB又可促進(jìn)多種炎性介質(zhì)(如細(xì)胞因子、ICAM-1、趨化因子等)轉(zhuǎn)錄，參與多種細(xì)胞因子、趨化因子和促纖維因子的合成，以及細(xì)胞外基質(zhì)交聯(lián)、成纖維細(xì)胞的分化和細(xì)胞增殖等過(guò)程[6]，從而在炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，放射線可激活TNF基因，繼而在NF-κB的激活過(guò)程中起重要作用[7，8]。Haase等[9]研究發(fā)現(xiàn)，增大照射劑量后，大鼠肺組織中NF-κB表達(dá)升高6倍以上。因此認(rèn)為，NF-κB可能與放療后肺組織慢性炎癥和間質(zhì)細(xì)胞纖維化有關(guān)。

PDTC為公認(rèn)的NF-κB抑制劑，一方面可通過(guò)糾正氧化應(yīng)激，減少NF-κB的誘導(dǎo)因素，進(jìn)而抑制NF-κB的表達(dá)；另一方面可能通過(guò)干擾NF-κB激活的信號(hào)通路，抑制NF-κB活化，進(jìn)而降低相關(guān)細(xì)胞因子的過(guò)度表達(dá)，顯著減輕炎性反應(yīng)的瀑布效應(yīng)[10]。NF-κB是一個(gè)多功能核轉(zhuǎn)錄因子，激活的NF-κB可促進(jìn)多種炎性介質(zhì)轉(zhuǎn)錄，并參與多種細(xì)胞因子(如TNF-α、ICAM-1等)的合成，以及細(xì)胞外基質(zhì)交聯(lián)、成纖維細(xì)胞的分化和增殖過(guò)程，從而在炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[11]。有研究表明，放射線可激活NF-κB，這可能與放射性肺損傷關(guān)系密切[12]。本研究結(jié)果顯示，大鼠肺組織放射線照射后，肺組織中NF-κB被激活，并持續(xù)24周以上，這可能與后期慢性炎癥和間質(zhì)細(xì)胞纖維化有關(guān)。在這個(gè)過(guò)程中，不同細(xì)胞間及細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用尤其重要，而黏附分子在其中扮演著橋梁的角色。ICAM-1主要存在于肺組織的肺泡上皮和毛細(xì)血管內(nèi)皮上，射線可誘導(dǎo)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生ICAM-1，趨化白細(xì)胞黏附于內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致炎性反應(yīng)。本研究正常對(duì)照組肺組織中ICAM-1 mRNA不表達(dá)或少量表達(dá)，模型組接受放射后ICAM-1在肺組織中表達(dá)明顯增強(qiáng)，表明ICAM-1與肺損傷的炎性反應(yīng)密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，某些組織中NF-κB的活性改變與ICAM-1表達(dá)相關(guān)，在基礎(chǔ)狀態(tài)下少量NF-κB受到刺激后被激活，ICAM-1表達(dá)升高[13]。因此推測(cè)，在放射性肺損傷中NF-κB很可能在基因轉(zhuǎn)錄水平對(duì)ICAM-1的表達(dá)起著調(diào)控作用，從而影響后續(xù)的一系列炎癥反應(yīng)過(guò)程。我們推測(cè)，通過(guò)NF-κB抑制劑減少NF-κB的活化后，既可削弱NF-κB調(diào)控下的炎性反應(yīng)，也可調(diào)控ICAM-1表達(dá)，以減輕肺泡炎性反應(yīng)，繼而減輕肺組織損傷。

總之，PDTC能夠減輕放射性肺損傷大鼠肺部炎癥及纖維化程度，其機(jī)制可能與抑制NF-κB活化、調(diào)控ICAM-1表達(dá)有關(guān)。

[1] Miller KL， Shafman TD， Marks LB. A practical approach to pulmonary risk assessment in the radiotherapy of lung cancer[J]. Semin Radiat Oncol， 2004，14(4):298-307.

[2] 張振勇，曹秋婷，吳榮.放射性肺損傷中核因子κB和細(xì)胞間黏附分子的表達(dá)及意義[J].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，43(2)：155-158.

[3] Suzuki Y, Ruiz-Onega M, Lorenzo O, et al. Inflammation and angiotensinⅡ[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2003,35(6):881-900.

[4] 程健，孔玲玲，李紅軍，等.黃酮類化合物預(yù)防放射性肺損傷的分子機(jī)制[J].國(guó)際腫瘤學(xué)雜志，2012，39(8)：588-590.

[5] Kabay B, Teke Z, Aytekin FO, et al. Pyrrolidine dithiocarbamate reduces lung injury caused by mesenteric ischemia/reperfusion in a rat model[J]. World J Surg, 2007,31(9):1707-1715.

[6] 張朦,周菊英.NF-κB在放射性損傷中的表達(dá)改變及作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中華放射醫(yī)學(xué)和防護(hù)雜志，2016，36(7)：553-556.

[7] Sherman ML, Datta R, Hallahan DE, et al. Regulation of tumor necrosis factor gene expression by ionizing radiation in human myeloid leukemia cells and peripheral blood monocytes[J]. J Clin Invest, 2010,87(5):1794-1797.

[8] Brach MA, Hass R, Sherman ML, et al. Ionizing radiation induces expression and binding activity of the nuclear factor kappa B[J]. J Clin Invest, 1991,88(2):691-695.

[9] Haase MG, K1awitter A, Geyer P, et al. Sustained elevation of NF-κB DNA binding activity in radiation-induced lung damage in rats[J]. Int J Radiat Biol, 2008,79(11):863-877.

[10] Tomita M, Okuyama T, Katsuyama H, et al. Mouse model of paraquat-poisoned lungs and its gene expression profile[J]. Toxicology, 2007,231(1):200-209.

[11] Zhang X, Wu M, Jiang H, et al. Angiotensin Ⅱ up-regulates endothelial lipase expression via the NF-kappa B and MAPK signaling pathways[J]. PLoS One, 2014,9(9):e107634.

[12] Shermall ML, Datta R, Hallahan DE, et al. Regulation of tumor necrosis factor gene expression by ionizing radiation in human myeloid leukemia cells and peripheral blood monocytes[J]. J Clin Invest, 2010,87(5):1794-1797.

[13] 康亞輝，王金鳳，張曲，等.穿心蓮內(nèi)酯對(duì)小鼠放射性肺損傷的防護(hù)作用[J].中華放射醫(yī)學(xué)和防護(hù)雜志，2014，34(7)：507-511.

魏明(E-mail： gushiweiming@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.32.012

R730.55

A

1002-266X(2017)32-0042-03

2017-02-03)