劉愛民，曹圓圓，劉 宇，董德武，盧存龍(安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生態(tài)環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校重點實驗室 安徽省皖江城市帶退化生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)與重建協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 蕪湖 241000)

稻秸藍藻沼氣發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)解析

劉愛民，曹圓圓，劉 宇，董德武，盧存龍
(安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生態(tài)環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校重點實驗室 安徽省皖江城市帶退化生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)與重建協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 蕪湖 241000)

采用自行設(shè)計的可控恒溫厭氧發(fā)酵裝置，以水稻秸稈和銅綠微囊藻為發(fā)酵原料，分別對稻秸進行生物(平菇發(fā)酵液、沼渣)和化學(xué)(6% NaOH)方法預(yù)處理，在(35±1)℃的條件下進行厭氧發(fā)酵。每隔5 d，采取不同處理組的發(fā)酵液，提取DNA，進行PCR擴增，通過高通量測序技術(shù)分析不同處理組樣品的微生物群落組成、豐度和多樣性。結(jié)果顯示，各處理組的微生物群落結(jié)構(gòu)有所差異，在門水平上，以變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門為主，但僅平菇處理組的沼液中含有梭桿菌門。此外，平菇處理組的Shannon指數(shù)亦高于其他2組，具有較高的菌群豐度和多樣性。平菇處理組的稻秸產(chǎn)氣性能最穩(wěn)定，可能與其微生物群落多樣性豐度最高有很大關(guān)系。

稻秸； 預(yù)處理； 厭氧發(fā)酵； 微生物群落結(jié)構(gòu)； 16S rRNA； 高通量測序

我國是農(nóng)業(yè)大國，每年農(nóng)作物秸稈的產(chǎn)量約7億t[1]，主要為糧食作物秸稈、油料作物秸稈、棉花秸稈和麻類作物秸稈等。然而，我國秸稈的利用率極其低下，大部分自然腐爛或就地焚燒，不僅浪費資源，而且污染環(huán)境，由此造成的直接損失難以估計[2]。如果將這些“廢棄物”很好地加以利用，如利用厭氧消化技術(shù)將稻草秸稈轉(zhuǎn)化為清潔、高效的能源——沼氣，不但能在一定程度上解決農(nóng)村能源緊缺的問題，而且可以改善農(nóng)村生態(tài)環(huán)境[3- 4]。

有機物厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣主要分為水解發(fā)酵、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸以及產(chǎn)甲烷3個階段，每個階段都有不同的微生物發(fā)揮作用。其中：水解發(fā)酵與產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸階段主要由細菌參與，涉及一系列復(fù)雜的化學(xué)代謝過程，生成乙酸等揮發(fā)性有機酸；產(chǎn)甲烷階段主要由產(chǎn)甲烷古菌參與，將乙酸轉(zhuǎn)化為甲烷、氫氣和二氧化碳等[5]。秸稈的厭氧降解需要多種類型的微生物協(xié)同作用，但是目前人們對沼氣發(fā)酵微生物，尤其是厭氧微生物的生理生化特性及代謝特點的認(rèn)知程度極其有限[6]，導(dǎo)致發(fā)酵啟動周期長、底物降解率低和運行不穩(wěn)定，已成為秸稈發(fā)酵技術(shù)發(fā)展的瓶頸。盡早明確秸稈發(fā)酵過程的微生物群落結(jié)構(gòu)與功能，對于提高秸稈的降解率及增加產(chǎn)氣量具有重要的指導(dǎo)意義[7- 8]。

現(xiàn)有的微生物群落結(jié)構(gòu)研究方法主要包括分離培養(yǎng)和分子生物學(xué)方法。傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)不但操作煩瑣，費時費力，更重要的是環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，且自然界存在大量不可培養(yǎng)的微生物，導(dǎo)致該方法并不能全面客觀地反映環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)及其功能。隨著分子遺傳學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，許多新的生物學(xué)手段可被用于分析微生物群落結(jié)構(gòu)，常用的有：隨機擴增多態(tài)性DNA分析(RADP)，限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)(RFLP)，熒光原位雜交技術(shù)(FISH)，變性梯度凝膠電泳技術(shù)(DGGE)和溫度梯度凝膠電泳技術(shù)(TGGE)等。這些技術(shù)以復(fù)雜的環(huán)境樣品為研究對象，可以不經(jīng)培養(yǎng)，直接提取其中微生物的基因組DNA，利用分子生物學(xué)手段進行分離、鑒定和定量，克服了傳統(tǒng)的純培養(yǎng)技術(shù)的缺陷，直接從分子水平反映厭氧發(fā)酵過程中微生物種群的多樣性和結(jié)構(gòu)組成；但是，這些分子生物學(xué)方法普遍具有通量低、分辨率低和成本高等局限性，仍不能完全反映微生物群落的整體信息[9]。

高通量測序技術(shù)不僅可以對數(shù)百萬個DNA分子同時測序，而且可以同時對上百個樣本進行測序分析，是解析復(fù)雜環(huán)境中微生物群落組成和相對豐度的重要工具。與傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)相比，新一代高通量測序技術(shù)具有高通量、低成本、可以同時對多個單獨的DNA分子進行測序分析等優(yōu)點[10]。目前，高通量測序技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于不同自然環(huán)境條件下(如海洋、湖泊、土壤、垃圾填埋場以及人和動物的腸道等)微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的研究[11- 13]。據(jù)此，本研究擬應(yīng)用高通量測序技術(shù)分析稻草秸稈和藍藻沼氣發(fā)酵過程中的微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性，以期為秸稈沼氣發(fā)酵工程應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 發(fā)酵原料

試驗材料為稻草秸稈、銅綠微囊藻和活性污泥。稻草秸稈采自安徽省蕪湖市田間，剪短至2 cm以下待用；銅綠微囊藻(MicrocystisaeruginosaFACHB- 942)來自中國科學(xué)院武漢水生生物研究所；活性污泥采自蕪湖市某啤酒廠的污水凈化處理池。

1.1.2 稻秸預(yù)處理

試驗所用秸稈共設(shè)3種預(yù)處理：1)沼渣處理，將經(jīng)過稻草秸稈和藍藻厭氧共發(fā)酵30 d后的沼渣用清水沖洗干凈，除去里面的污泥，保留未完全降解的稻草秸稈，晾干備用。稱取上述發(fā)酵過的稻草秸稈300 g，備用；2)平菇發(fā)酵液處理，從活化好的平菇斜面培養(yǎng)基上取一塊5 mm2的菌塊，接入PDA液體培養(yǎng)基中[14]，28.5 ℃，170 r·min-1培養(yǎng)3 d，按10%的接種量再轉(zhuǎn)接到新鮮PDA液體培養(yǎng)基中，同上條件培養(yǎng)7 d備用。稱取300 g稻草秸稈裝入5 L發(fā)酵罐中，接種上述已培養(yǎng)好的平菇種子液1.5 L混勻，28.5 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后晾干備用；3)NaOH處理，稱取300 g稻草秸稈裝入5 L發(fā)酵罐中，用6%的NaOH溶液處理，28 ℃恒溫浸泡3 d，并水洗除去堿液，晾干備用。

1.1.3 銅綠微囊藻培養(yǎng)和處理

將銅綠微囊藻藻種以1∶1的比例接入BG11培養(yǎng)基中[15]，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：溫度25 ℃，光照強度2 000 lx，光暗周期12 h∶12 h。每天早中晚各搖瓶1次，以防止藻細胞黏附于瓶壁上[16- 17]。將培養(yǎng)好的藻液離心，除去90%(V/V)上清后待用。

1.1.4 活性污泥馴化

將活性污泥取回后厭氧保存在塑料容器中，加入適量的葡萄糖稀溶液，實驗室馴化7 d。馴化后的污泥質(zhì)地蓬松，呈絮狀，顏色為灰黑色，并夾帶少量氣泡，測定pH值7.0。

1.2試驗裝置

本試驗所使用的厭氧發(fā)酵罐為自行設(shè)計、工廠代加工器材，最大容積5 L，發(fā)酵容積4 L。罐的內(nèi)層進行發(fā)酵，外層連通循環(huán)水保溫；發(fā)酵罐的頂部有2個出氣孔，通過閥門控制以便放出沼氣，通過橡膠管連通集氣瓶，采用排水法收集沼氣；發(fā)酵罐的外層側(cè)部有2個閥門控制循環(huán)水的進出，通過循環(huán)水的暢通保證整個發(fā)酵過程在(35±1)℃的溫度下進行。整套厭氧發(fā)酵裝置如圖1所示。

圖1 厭氧發(fā)酵罐的裝置

1.3試驗方法

本試驗主要研究銅綠微囊藻協(xié)同秸稈處理下沼氣發(fā)酵過程中的微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性，以及沼氣發(fā)酵狀況。將經(jīng)沼渣處理、NaOH處理和平菇發(fā)酵液預(yù)處理過的秸稈，分別連同100 mL銅綠微囊藻濃縮液及1.5 L活性污泥加入5 L的厭氧發(fā)酵罐中，混合均勻后，調(diào)pH值至7.0，迅速封蓋，(35±1)℃恒溫水浴條件下發(fā)酵，分別標(biāo)記為處理1、處理2和處理3，每處理重復(fù)3次。

1.4產(chǎn)氣量測定

采用水壓式法收集發(fā)酵產(chǎn)生的氣體，根據(jù)排出飽和食鹽水的體積計算每日產(chǎn)生氣體的體積。從進行發(fā)酵的第1天開始，每天定時記錄各套裝置的產(chǎn)氣量，以3個平行樣品的平均產(chǎn)氣量作為最終產(chǎn)氣量。

1.5沼氣發(fā)酵過程微生物群落結(jié)構(gòu)分析

1.5.1 樣品采集和總DNA提取

從進行裝罐發(fā)酵的第1天開始，每5 d量取3 mL的發(fā)酵液樣品置于50 mL無菌的離心管中，加入13.5 mL CTAB提取緩沖液(100 mmol·L-1Tris，100 mmol·L-1EDTA，100 mmol·L-1Na3PO4，1.5 mol·L-1NaCl，1.0% CTAB，pH=8.0)和25 μL蛋白酶K(20 mg·mL-1)，混合均勻后，37 ℃，225 r·min-1振蕩30 min，然后加入1.5 mL 20%的SDS，65 ℃水浴加熱2 h。將上述樣品處理液3 000 r·min-1離心5 min，收集上清液，加入等體積的氯仿輕微振蕩混勻，稍微靜置后，9 000 r·min-1離心5 min取上清液，加入等體積的預(yù)冷的無水乙醇，4 ℃下過夜，促進DNA沉淀，9 000 r·min-1離心5 min，用TE緩沖液溶解沉淀即為所得的基因組DNA粗提液[18]。在1%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測提取到的DNA質(zhì)量。

樣品及其編號分別為：X1，處理1第5天樣品；X2，處理1第10天樣品；X3，處理1第20天樣品；X4，處理2第5天樣品；X5，處理2第10天樣品；X6，處理2第20天樣品；X7，處理3第5天樣品；X8，處理3第10天樣品；X9，處理3第20天樣品。

1.5.2 16S rRNA基因擴增和高通量測序

樣本DNA各50 μL，干冰條件下送往南京普東興生物科技有限公司，采用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳進行濃度及純度檢測。對合格樣本進行16S rRNA基因V3區(qū)擴增，通用引物分別為338F(5′- ACTCCTACGGGAGGCAGCAG- 3′)和518R(5′- ATTACCGCGGCTGCTGG- 3′)，PCR擴增產(chǎn)物用Ion Torrent Personal Genome Machine平臺進行高通量測序。

1.5.3 測序結(jié)果質(zhì)量控制及數(shù)據(jù)分析

對原始數(shù)據(jù)首先進行質(zhì)量控制，舍棄低質(zhì)量序列。將獲得的序列通過SolexaQA軟件去掉平均質(zhì)量值低于20的序列，去掉長度小于75 bp的序列，去掉包含N的序列，去掉不能完全比上barcode的序列，并去除barcode和引物序列，得到有效的序列文件。將相似度大于97%的DNA序列歸為1個操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)，利用QIIME軟件對優(yōu)質(zhì)序列進行OTU聚類，用于樣品間的相似性分析，繪制樣品的稀疏曲線圖，評估不同樣品的多樣性。從每個OTU序列中挑選出具有代表性的序列，與參考數(shù)據(jù)庫Greengene[19]進行比對，采用RDP進行分類信息劃分，得到每條序列的分類單元。物種分類單元通常分為6層(界、門、綱、目、科、屬)，并對樣品的物種分類進行比較，分析沼氣發(fā)酵過程的微生物菌群相對豐度。

2 結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)沼情況

如圖2所示，各處理組從啟動發(fā)酵的第1天即開始產(chǎn)氣。發(fā)酵初期，產(chǎn)氣量逐漸升高，產(chǎn)氣速率較快。處理1在第1天的產(chǎn)氣量高達832.5 mL，明顯高于其他處理，而在第2天產(chǎn)氣量出現(xiàn)較大的回落，在第4天產(chǎn)氣趨穩(wěn)后逐漸上升，并在第6天達到產(chǎn)氣高峰，之后逐漸回落。這可能是因為秸稈通過一次發(fā)酵后仍然有大量的有機物殘留在固體殘余物沼渣中，未被微生物降解，而且沼渣中仍含有較高的纖維素和半纖維素，是較好的發(fā)酵原料，具有很強的產(chǎn)氣潛力[20]。處理2的秸稈產(chǎn)氣含量一直保持上升狀態(tài)，在第5天達到產(chǎn)氣高峰，為1 170.3 mL，之后逐漸回落。這可能是由于NaOH中的氫氧根離子破壞了木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)，使被木質(zhì)素包裹的纖維素和半纖維素裸露出來，而且還破壞了細胞壁結(jié)構(gòu)，使得厭氧微生物和木質(zhì)素、纖維素、半纖維素的接觸面積大大提高[21]。處理3前2 d產(chǎn)氣很平穩(wěn)，然后逐漸上升，在第5天達到產(chǎn)氣高峰，并在這一水平上維持了一段時間后才緩慢下降。

圖2 各處理秸稈產(chǎn)氣量變化

處理1第1天的產(chǎn)氣量明顯高于其他處理，可能是因為秸稈已經(jīng)過一次厭氧發(fā)酵，在發(fā)酵微生物的作用下，殘留了很多未被完全利用的有機物質(zhì)，能夠直接為本次厭氧發(fā)酵所利用，產(chǎn)生大量氣體。各處理組在發(fā)酵初期產(chǎn)氣量逐漸升高，然后逐漸回落。這是由于在預(yù)處理后，水稻秸稈組分被降解，能很容易地被接種物中的產(chǎn)酸菌和產(chǎn)甲烷菌迅速利用，進而產(chǎn)生大量氣體，隨著反應(yīng)的進行，這些組分被大量消耗而減少，底物濃度也比開始時小，所以產(chǎn)氣量也逐漸減少。處理3產(chǎn)氣時間最長，累計產(chǎn)氣量最高，就穩(wěn)定性能來看，該處理厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣效果最為理想。這可能是因為采用平菇、稻秸和藍藻混合發(fā)酵，有利于應(yīng)用不同廢棄物中的營養(yǎng)成分和多種微生物的共同作用使發(fā)酵過程最優(yōu)化，刺激微生物的協(xié)同效應(yīng)，增加有機負荷從而提高產(chǎn)氣量[22]。

2.2微生物菌群多樣性

2.2.1 16S rDNA擴增

將擴增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示得到約150 bp的條帶(圖3)。

泳道編號1～9分別為樣品號X1～X9，M為分子量標(biāo)記圖3 16S rDNA PCR擴增結(jié)果

2.2.2 序列數(shù)目和多樣性指數(shù)

本試驗測序樣品數(shù)9個，經(jīng)過對焦磷酸測序所得序列進行質(zhì)量和長度篩選，結(jié)果得到716 284條高質(zhì)量的優(yōu)化序列，在97%水平上，一共得到14 490個OTU。

從圖4可以看出，稀疏曲線顯示序列較少時，OTU的數(shù)目劇增，隨著測序量的不斷增大，曲線最終趨于平緩，但仍然未達到飽和狀態(tài)。盡管隨著測序量的增大，新的物種不斷出現(xiàn)，但本次試驗的測序量已經(jīng)基本能夠反映樣本中微生物多樣性的組成。

圖4 各樣本的稀疏曲線

從圖5可以看出，處理3的Shannon指數(shù)最大，高于其他處理，表明其菌群多樣性最高。其次為處理2，處理1的最低。

圖5 各樣本的Shannon曲線

2.2.3 基于分類地位的群落特征

如圖6所示，在微生物分類門水平上，共出現(xiàn)了28個已知的細菌門，占微生物總量的83.1%～88.1%，未知細菌占11.9%～16.9%。各處理組的樣品共同擁有8個優(yōu)勢微生物類群(豐度>0.8%為優(yōu)勢類群)，分別為變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、熱袍菌門(Thermotogae)、螺旋體門(Spirochaetes)、互養(yǎng)菌門(Synergistetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)。其中，變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)與厚壁菌門(Firmicutes)為主要優(yōu)勢菌群，這與前人研究結(jié)果一致[8,23]。此外，處理3的沼氣發(fā)酵液中獨有梭桿菌門(Fusobacteria)，豐度約為0.1%。變形菌門在3組處理沼氣發(fā)酵罐中相對豐度均最高(19.9%～49.4%)，該門細菌已在厭氧消化污泥、土壤、糞便等環(huán)境中發(fā)現(xiàn)，具有水解發(fā)酵作用，可以利用淀粉、長鏈脂肪酸、氨基酸等，生成小分子物質(zhì)，以供產(chǎn)甲烷菌利用；擬桿菌門(Bacteroidetes)是第2大優(yōu)勢細菌種群(16.3%～27.4%)，該門細菌已在厭氧消化污泥、廢水處理反應(yīng)器、餐廚垃圾厭氧反應(yīng)器、腸道等厭氧環(huán)境中被發(fā)現(xiàn)，有降解大分子碳水化合物產(chǎn)酸的功能；厚壁菌門(Firmicutes)是第3大優(yōu)勢種群(7.1%～35.8%)，主要分離自土壤、厭氧活性污泥、人和動物糞便等，可以利用纖維素、葡萄糖、乳糖等物質(zhì)，最終生成丙酸、甲酸和氫等小分子物質(zhì)。

圖6 門水平上各樣本細菌群落組成的相對豐度

在屬水平上進行分類，可得到70個屬(圖7)。多度最高的前10屬分別為：Thiothrix、Kosmotogae、Treponema、Bacteroides、Clostridium、Phenylobacterium、Rhodobacter、Dok59、Paludibacter、Hyphomonas。其中，Thiothrix是最優(yōu)勢的屬，占總OTU數(shù)目的1.0%～4.7%，屬于Proteobacteria門、Gammaproteobacteria綱、Thiotrichales目、Thiotrichaceae科。其次是Kosmotogae，占0.8%～3.8%，屬于Thermotogae門、Thermotogae綱、Thermotogales目、Thermotogaceae科。Treponema占0.8%～2.2%，屬于Spirochaetes門、Spirochaetes綱、Spirochaetales目、Spirochaetaceae科。Bacteroides和Paludibacter同屬于Bacteroidetes門，Clostridium屬于Firmicutes門，Phenylobacterium、Rhodobacter、Dok59和Hyphomonas同屬于Proteobacteria門。

圖7 屬水平上各樣本中細菌群落組成的相對豐度

2.2.4 基于FastUniFrac的群落結(jié)構(gòu)

由圖8可看出，各處理組的樣品均比較分散，可以區(qū)分開，相同處理的樣品距離比較近，說明相同處理的樣品細菌群落比較相似，不同處理的樣品細菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。

圖8 基于FastUniFrac的群落結(jié)構(gòu)主成分分析

3 小結(jié)

通過對稻秸進行生物(平菇發(fā)酵液、沼渣)和化學(xué)(6% NaOH)方法預(yù)處理，并對稻秸藍藻厭氧發(fā)酵的沼液樣品16S rRNA基因的V3區(qū)進行高通量測序，發(fā)現(xiàn)平菇發(fā)酵液處理的菌群多樣性高于其他處理組，且產(chǎn)氣性能最穩(wěn)定，推測可能與其微生物群落多樣性豐度最高有很大關(guān)系。

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(責(zé)任編輯：高 峻)

S19

：A

：0528- 9017(2017)09- 1644- 06

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安徽省自然科學(xué)基金(1408085MC53)； 農(nóng)業(yè)部農(nóng)村可再生能源開發(fā)利用重點實驗室開放課題(2013006)；校級研究生創(chuàng)新與實踐項目(2015cxsj168zd)；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201410370220)；安徽高?？蒲袆?chuàng)新平臺團隊蛋白質(zhì)工程及生物制藥項目

劉愛民(1968—)，女，安徽太和人，副教授，博士，研究方向為應(yīng)用微生物，E- mail: amliu9393@163.com。

文獻著錄格式：劉愛民，曹圓圓，劉宇，等. 稻秸藍藻沼氣發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)解析[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(9)：1644- 1649.

10.16178/j.issn.0528- 9017.20170947