高學(xué)軍，劉麗杰，李冬，李姍姍，陳東瑩，于萌萌

牛mettl3基因的原核表達(dá)與蛋白純化

高學(xué)軍，劉麗杰，李冬，李姍姍，陳東瑩，于萌萌

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江省高校農(nóng)業(yè)生物功能基因重點實驗室，哈爾濱150030）

m6A甲基轉(zhuǎn)移酶（methyltransferase-like protein 3，METTL3）可調(diào)控mRNA的m6A甲基化水平，調(diào)節(jié)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成，實驗室前期發(fā)現(xiàn)METTL3為乳腺上皮細(xì)胞乳合成重要調(diào)節(jié)分子，發(fā)揮泌乳調(diào)節(jié)作用。目前尚不清楚METTL3分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及其參與的調(diào)節(jié)機(jī)制。為揭示METTL3結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，對METTL3蛋白作原核表達(dá)及純化。研究采用PCR方法擴(kuò)增牛mettl3基因完整CDS區(qū)，將CDS區(qū)插入原核表達(dá)載體pGEX-4T-1，異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)METTL3蛋白大量表達(dá)，用8 mol·L-1尿素裂解包涵體，利用GST蛋白純化試劑盒純化誘導(dǎo)獲得METTL3蛋白。SDS-PAGE證實GST-METTL3融合蛋白存在于包涵體內(nèi)，試驗獲得高純度GST-METTL3融合蛋白，為進(jìn)一步研究METTL3蛋白在奶牛泌乳中作用提供重要依據(jù)。

牛；METTL3；原核表達(dá)；純化

自然界中RNA最主要修飾形式為甲基化[1]。由于初期細(xì)胞中RNA含量較低、提取后易降解、保存過程中穩(wěn)定性差等因素限制，m6A功能未被發(fā)現(xiàn)，但m6A甲基轉(zhuǎn)移酶可為了解m6A功能提供依據(jù)。1992年，Martin首次將Hela細(xì)胞核提取物和mRNA孵育，短時間孵育后發(fā)現(xiàn)Hela細(xì)胞核提取物在體外可將一定量mRNA催化形成m6A，即刻提取Hela細(xì)胞核，初步分離細(xì)胞核成分，獲得兩種形式酶，后續(xù)試驗發(fā)現(xiàn)這兩種形式酶主要存在細(xì)胞核中，可催化mRNA中A堿基形成m6A，將其體外進(jìn)一步分離得到3個獨立組分，分別為MT-A1（30 ku）、MT-A2（200 ku）和MT-B（876 ku）[2]，Bokar等發(fā)現(xiàn)MT-A1是組成酶最小組分，不具有生物活性，MT-A2在70 ku處亞基被命名為METTL3[3]。Krug等報道，m6A甲基轉(zhuǎn)移酶在mRNA m6A修飾過程中起主要調(diào)控作用，主要作用酶有METTL3和METTL14（Methyltransferase like 14）[4-6]，且METTL3可催化RNA生成m6A[7-8]。

郝亞娟研究表明，將HeLa細(xì)胞中mettl3基因敲除可致m6A表達(dá)量降低30%[9]。Zheng等研究表明，METTL3集中存在富含剪切因子細(xì)胞核內(nèi)亞細(xì)胞器-核小斑（Nuclear speckle）上，說明RNA剪切和加工與m6A修飾密切相關(guān)[10]。敲除mettl3基因引起一些物種發(fā)生減數(shù)分裂，出現(xiàn)發(fā)育異常[11-13]。在癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)METTL3蛋白可促進(jìn)癌基因翻譯及增殖[14]，調(diào)控mRNA中與癌癥密切相關(guān)m6A甲基化水平[15-16]。朱琳娜等研究表明，超表達(dá)甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3可提高mRNA m6A甲基化水平，抑制脂肪沉積，RNA甲基化調(diào)控屬于轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控[17-19]。在mRNA轉(zhuǎn)錄、剪切、出核、翻譯等系列反應(yīng)過程中m6A起調(diào)控作用，mRNAm6A甲基化水平在一定程度上受METTL3調(diào)控。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)METTL3參與細(xì)胞信號調(diào)節(jié)過程，METTL3正向調(diào)控奶牛乳腺上皮細(xì)胞（Bovine mammary epithelial cells，BMECs）中乳脂、乳蛋白合成[20]。

目前METTL3蛋白結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系尚不清楚，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尚待揭示。本試驗旨在通過原核表達(dá)和純化獲得METTL3蛋白，闡明METTL3蛋白結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。構(gòu)建mettl3基因原核表達(dá)載體，將陽性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸埃希菌BL21中大量誘導(dǎo)表達(dá)，獲得蛋白通過GST融合蛋白純化試劑盒純化，得到純化后METTL3蛋白。為研究METTL3結(jié)構(gòu)及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 載體和細(xì)胞

載體pGEX-4T-1由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黑龍江省高校農(nóng)業(yè)生物功能基因重點實驗室提供。大腸埃希氏菌BL21購于哈爾濱博仕生物公司。原代培養(yǎng)奶牛乳腺組織，取自泌乳期健康中國荷斯坦奶牛。消化法獲得乳腺上皮細(xì)胞，擴(kuò)增培養(yǎng)，凍存前五代細(xì)胞于液氮中。消化法優(yōu)點為短時間內(nèi)可獲得乳腺上皮細(xì)胞。

1.2 試劑與儀器

TRIzol?Reagent購于Invitroge公司；Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）、DNA Marker（DL 5 000、DL 10 000）購于TaKaRa公司；GST MiniSpin Purification kit購于北京中科晨宇公司；Quick BlockTMWestern封閉液、GST抗體均購于北京碧云天公司；METTL3抗體購于Cell Signaling Technology CST公司；蛋白印記膜再生液Stripping buffer購于北京天根公司；牛血清、DMEM/F12干粉均購于PAN Bio-tech公司；HRP標(biāo)記二抗購于北京中杉公司；激光掃描顯微鏡購于Leica TCS SP2公司；DYY-5電泳儀購于北京六一公司；由哈爾濱博仕生物提供引物合成、核酸測序服務(wù)。

1.3 方法

1.3.1 BMEC原代培養(yǎng)與純化

消化法培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞，將健康中國荷斯坦奶牛宰殺后，立即以常規(guī)手術(shù)方法取乳腺組織，將離體組織快速放入75%酒精中浸泡2 min，初步對乳腺組織殺菌消毒。將組織放入含有10倍雙抗D-Hanks中浸泡2 min，此期間重復(fù)換掉DHanks，將組織塊清洗干凈后放入燒杯中，用含10倍雙抗D-Hanks清洗至液體澄清，氟康唑洗2遍。準(zhǔn)備2個小燒杯組織剪塊，將脂肪、結(jié)締組織、乳腺導(dǎo)管等去除掉，用剪子將實質(zhì)組織盡量剪碎，為后續(xù)消化液充分消化，剪切后用含10倍雙抗的D-Hanks清洗，將D-Hanks吸取倒掉，將剪好組織塊放入錐形瓶中，向錐形瓶中加入提前溶解消化液，37℃搖床中反應(yīng)4 h。400目銅網(wǎng)過濾組織液低速離心。用無血清培養(yǎng)液將離心后的沉淀吹起懸勻清洗，重復(fù)此步驟兩次。最后放入含有10%血清培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)，3 d后可獲得純化奶牛乳腺上皮細(xì)胞。

1.3.2 RNA提取以及鑒定

本試驗中BMECs用含12%血清DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，選取活力旺盛且細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶80%細(xì)胞。Trizol法提取細(xì)胞總RNA，按照Reverse Transcriptase M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

1.3.3 METTL3蛋白全長編碼區(qū)基因擴(kuò)增

設(shè)計一對mettl3特異性引物。上游引物：5' CGGAATTCGCCACGAGACTGAAATGT 3'，下游引物：5'GCGTCGACATAGATTCTTAGGTTTAGAGAT GAT 3'，引物由哈爾濱博仕生物公司設(shè)計合成。

1.3.4 原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-METTL3構(gòu)建

用EcoRⅠ和SalⅠ兩種限制酶，將空載體pGEX-4T-1和上述通過PCR擴(kuò)增獲得目的片段雙酶切，酶切產(chǎn)物用凝膠電泳檢測，膠回收目的片段。得到pGEX-4T-1載體和mettl3基因用T4DNA連接酶，16℃金屬浴連接過夜。次日將連接后產(chǎn)物轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)胞，37℃過夜，在超凈工作臺中挑取單菌落，次日提取質(zhì)粒，將雙酶切后正確質(zhì)粒外送測序。菌液與80%甘油混合，-80℃保存。

1.3.5 重組蛋白在原核細(xì)胞中的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

將pGEX-4T-1空載體及陽性重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-METTL3接種到含有100 μg·mL-1氨芐青霉素LB培養(yǎng)基中，37℃搖床過夜，次日取出1 mL菌液，加入500 mL錐形瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)。活化后菌液37℃搖床培養(yǎng)2 h至吸光度達(dá)0.6～0.9。試驗分四組：第一組為無IPTG誘導(dǎo)pGEX-4T-1空載體、第二組為IPTG誘導(dǎo)pGEX-4T-1空載體、第三組無IPTG誘導(dǎo)陽性菌液、第四組為IPTG誘導(dǎo)陽性菌液。將第二組和第四組加入IPTG終濃度至1 mmol·L-1，同時將第四組IPTG誘導(dǎo)的陽性菌液分4種方法誘導(dǎo)：28℃培養(yǎng)6 h、30℃培養(yǎng)4 h、30℃培養(yǎng)6 h、16℃過夜培養(yǎng)[21]。其余分組采取28℃培養(yǎng)6 h。4℃離心10 min，收集菌體棄上清，加入10 mL預(yù)冷的PBS重懸沉淀中菌體，重復(fù)2次。冰上超聲破碎[22]，4℃離心10 min，收集上清及粗包涵體沉淀。向粗包涵體沉淀中加入4 mL 8 mol·L-1尿素，4℃過夜，4℃離心10 min之后取上清。收集兩次分離得到上清液，凍存于-80℃冰箱中。分別取20 μL菌液上清及裂解沉淀后上清與上樣緩沖液1：1混合，90℃沸水煮10 min?；旌虾髽悠烦?次，每次15 s。配置8%SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后配置膠放入90℃水中煮10 min。重復(fù)3次，目的將背景洗脫干凈，取出配置膠清晰可見誘導(dǎo)蛋白條帶。

1.3.6 融合蛋白GST-METTL3純化

取200 μL誘導(dǎo)后蛋白樣品與100 μL重懸后液體充分混合，4℃搖床過夜。次日將孵育后液體全部加入離心層析柱內(nèi)，4℃低速離心收集結(jié)合樣品。向離心層析柱內(nèi)加入500 μL預(yù)冷PBS，4℃低速離心，重復(fù)兩次。除去未結(jié)合蛋白質(zhì)，向離心柱內(nèi)加入100～200 μL還原型GSH溶液，室溫作用10 min。4℃低速離心收集樣品。重復(fù)此步驟可增加回收量。取出少量純化后樣品作Western blotting初步檢測。

1.3.7 目的蛋白鑒定

將誘導(dǎo)后GST-METTL3作8%SDS-PAGE電泳檢測。將2次過柱得到的融合蛋白作8%SDSPAGE電泳，分別利用特異性GST抗體和METTL3抗體做Western blotting分析，鑒定純化后的蛋白是否為目的蛋白。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)載體pGEX-4T-1-METTL3構(gòu)建

PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1A。比對10 000的DNA Marker與產(chǎn)物，圖中2 300 bp處出現(xiàn)清晰條帶，與試驗預(yù)期mettl3片段大小一致，說明mettl3基因成功擴(kuò)增。

pGEX-4T-1-METTL3經(jīng)過EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切，在2 300 bp和5 300 bp處得到兩條清晰條帶，分別為目的片段mettl3和pGEX-4T-1載體（見圖1B），條帶出現(xiàn)位置與試驗預(yù)期相符。同時與NCBI中公布的mettl3基因mRNA序列CDS區(qū)完全匹配。證明重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-METTL3構(gòu)建成功。

2.2 GST-METTL3蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

由圖2可知，IPTG分別對pGEX-4T-1-METTL3重組載體和pGEX-4T-1空載體誘導(dǎo)表達(dá)，考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果表明，第二條泳道IPTG誘導(dǎo)空載體表達(dá)GST蛋白明顯多于第一條泳道未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)空載體表達(dá)GST蛋白。第三條泳道為IPTG誘導(dǎo)GST-METTL3上清中蛋白，在90 ku處無明顯條帶，第四條泳道為IPTG誘導(dǎo)的GST-METTL3包涵體上清中蛋白，90 ku處看到明顯條帶，表明METTL3蛋白成功誘導(dǎo)并主要以包涵體形式存在。電泳結(jié)果顯示，第二和第四泳道出現(xiàn)特異性條帶位置分別與GST蛋白和GST-METTL3融合蛋白分子質(zhì)量相符，結(jié)果表明GST蛋白和GST-METTL3融合蛋白成功大量誘導(dǎo)表達(dá)。

圖2 重組菌誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析結(jié)果Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant bacteria E.coli BL21

2.3 融合蛋白GST-METTL3純化

由圖3可知，純化樣品作Western blotting分析，第一條泳道為純化未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)GST蛋白，經(jīng)過GST標(biāo)簽單克隆抗體檢測在27 ku處出現(xiàn)特異性條帶，但條帶較淺，第二條泳道為純化IPTG誘導(dǎo)GST蛋白含量，顯著高于第一泳道GST蛋白。第三、四、五泳道為純化IPTG誘導(dǎo)GST-METTL3包涵體上清中蛋白，經(jīng)誘導(dǎo)包涵體上清中蛋白再經(jīng)過柱純化后洗脫液中蛋白在90 ku處可以被兔抗GST單抗特異性識別，表明純化后蛋白極可能為GST-METTL3融合蛋白。

2.4 目的蛋白鑒定

由圖4可知，純化后GST-METTL3融合蛋白由于雜帶較多，采用多次少量添加還原型GSH洗脫緩沖液，除去特異性結(jié)合蛋白，最終獲得高純度METTL3蛋白。利用METTL3特異性抗體作Westernblotting分析。從兩圖中可看出在90 ku處，純化后融合蛋白GST-METTL3與METTL3抗體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)，圖A雜帶較多，B圖只有目的條帶，表明誘導(dǎo)、純化得到融合蛋白為GST-METTL3蛋白。

圖3 Western blotting分析純化的融合蛋白GST-METTL3Fig.3 Western blotting analysis of the recombinant protein GST-METTL3 after purification

圖4 目的蛋白Western blotting鑒定結(jié)果Fig.4 Western blotting analysis of the fusion protein with anti-METTL3 antibody

3 討論

本試驗成功構(gòu)建含有GST標(biāo)簽pGEX-4T-1-METTL3載體，將陽性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸埃希菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，用IPTG（1 mmol·L-1，28℃，6 h）大量誘導(dǎo)表達(dá)，對包涵體蛋白用8 mol·L-1尿素作用24 h，得到蛋白通過GST融合蛋白純化試劑盒純化，經(jīng)Western blot驗證，獲得純化METTL3蛋白。

帶有GST標(biāo)簽原核表達(dá)載體廣泛用于蛋白原核表達(dá)。GST標(biāo)簽分子質(zhì)量約27 ku，具有可溶性高、可在不同宿主中表達(dá)、適合范圍廣、可很好保留蛋白抗原性和生物活性，提高外源蛋白穩(wěn)定性，可利用GST層析柱快速純化等優(yōu)點[23-24]。但GST標(biāo)簽分子較大，影響蛋白質(zhì)功能和下游試驗，因此純化后需去除標(biāo)簽。由于GST標(biāo)簽蛋白含有特殊剪切序列，純化后使用不同蛋白酶可簡單去除GST標(biāo)簽[25-26]。本試驗中將誘導(dǎo)后融合蛋白產(chǎn)物通過GST層析柱快速、簡單純化，經(jīng)Western blot檢測確定為METTL3蛋白。結(jié)果表明，GST標(biāo)簽載體構(gòu)建成功，表達(dá)蛋白可用GST融合蛋白純化試劑盒快速、簡單純化。本試驗未去除GST標(biāo)簽，主要考慮將GST標(biāo)簽用于METTL3蛋白分子標(biāo)記試驗。

原核表達(dá)重組蛋白關(guān)鍵在于蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，但每個蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件不同。本試驗利用IPTG對pGEX-4T-1-METTL3載體在大腸埃希菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中表達(dá)誘導(dǎo)。本課題組前期試驗確定IPTG濃度為1 mmol·L-1[25]。本試驗采用500 mL大容量錐形瓶培養(yǎng)菌液，為菌液提供足夠氧氣。在提高菌液量，優(yōu)化誘導(dǎo)溫度和時間。按以下四個條件誘導(dǎo)：28℃培養(yǎng)6 h；30℃培養(yǎng)4 h；30℃培養(yǎng)6 h；16℃過夜培養(yǎng)。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，28℃6 h誘導(dǎo)后效果最好，誘導(dǎo)獲得蛋白約占總蛋白30%，誘導(dǎo)溫度和時間達(dá)到理想效果。

本研究結(jié)果表明，在BL21中表達(dá)METTL3蛋白主要以包涵體形式存在，難以分離純化。包涵體是目的蛋白在原核表達(dá)過程中形成不具有生物學(xué)活性、非折疊狀態(tài)聚集體，有極強(qiáng)折光性[27]。在宿主體內(nèi)表達(dá)時因誘導(dǎo)過程中蛋白過高、過快、溫度較低，使表達(dá)蛋白未完成折疊等過程，形成包涵體。包涵體可去除細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白，避免蛋白水解酶降解表達(dá)產(chǎn)物并提高產(chǎn)量，但包涵體復(fù)性過程需加入變性劑，可引起蛋白質(zhì)不可逆修飾及性質(zhì)改變。Yang等指出在一步法變性和復(fù)性過程中，6 mol·L-1鹽酸胍或8 mol·L-1尿素變性劑用于溶解包涵體中蛋白[28]。鹽酸胍溶解能力高于尿素，但易造成SDS-PAGE電泳條帶變形，而尿素優(yōu)點為變性蛋白在堿性條件下可長期保存，尿素溶解具有蛋白不電離、成本低、蛋白復(fù)性后除去尿素不會造成大量蛋白質(zhì)沉淀等。為確認(rèn)GSTMETTL3經(jīng)誘導(dǎo)后產(chǎn)生蛋白是在上清還是沉淀中形成包涵體，設(shè)計四個分組：分別為無IPTG誘導(dǎo)GST蛋白、IPTG誘導(dǎo)GST蛋白、IPTG誘導(dǎo)GSTMETTL3上清中蛋白、IPTG誘導(dǎo)GST-METTL3包涵體上清中蛋白。上述蛋白經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色表明GST-METTL3經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)形成包涵體。本試驗采用尿素作為變性劑溶解包涵體，用8 mol·L-1尿素作用24 h后可獲得溶解蛋白，但此過程易造成目的蛋白降解甚至重組[29]，目的蛋白產(chǎn)生大小不同肽段，導(dǎo)致第一次通過GSH-Sepharose 4B柱純化蛋白雜帶較多。為獲得較高純度蛋白，需將上述誘導(dǎo)后蛋白再一次純化過柱。本試驗采用二次純化方法解決純化后蛋白雜帶較多問題。純化過程中仍存在主要問題為誘導(dǎo)蛋白不易與GSHSepharose 4B磁珠互相結(jié)合，造成目的蛋白在純化過程過早被PBS緩沖液洗脫，顯著降低蛋白回收率，呈現(xiàn)假陰性結(jié)果。為提高蛋白收率，本試驗將目的蛋白與GSH-Sepharose磁珠4℃孵育過夜，通過延長作用時間，目的蛋白和GSH-Sepharose磁珠充分結(jié)合，多次過柱純化，顯著提高蛋白回收率，200 μL菌液可獲得300 μL純度較高蛋白用于后續(xù)試驗。

4 結(jié)論

本試驗成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-METTL3，陽性質(zhì)粒誘導(dǎo)時，通過多次改變IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度、液體培養(yǎng)基體積等條件實現(xiàn)重組蛋白高水平表達(dá)。試驗結(jié)果表明誘導(dǎo)后融合蛋白，在低溫誘導(dǎo)過程中形成包涵體并以包涵體形式存在，為獲得融合蛋白，用8 mol·L-1尿素溶解包涵體，獲得大量GST-METTL3蛋白，GST蛋白純化試劑盒對其多次過柱純化，最終獲得純度較高M(jìn)ETTL3蛋白。METTL3蛋白可為研究RNA甲基化及METTL3蛋白功能及其機(jī)制提供試驗材料。

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Prokaryotic expression and protein purification of dairy cowmettl3 gene/

GAO Xuejun,LIU Lijie,LI Dong,Li Shanshan,Chen Dongying,Yu Mengmeng
(Key Laboratory of Agricultural Biological Functional Gene Labotatory of Heilongjiang Province,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

m6A methyltransferase(methyltransferase-like protein 3,METTL3)can regulate m6A methylation levels in mRNA,thus plays an important role in regulating protein synthesis in cells.The previous laboratory study found that METTL3 was one of the important regulatory molecules for milk synthesis in bovine mammary epithelial cells,regulating the lactation.It was still unknown the molecular basis and regulation mechanism of METTL3.To reveal the relationship between the protein structure and function of METTL3,METTL3 were expressed inE.coli,and purified this protein for further study.In this study,dairy cowmettl3 coding sequence was amplified by PCR and was cloned into pGEX-4T-1 vector.Protein expression was induced by IPTG and the inclusion bodies was cracked with 8 mol·L-1urea,then GST-METTL3 was purified by protein purified kit,identified by SDS-PAGE and Western blotting analysis.SDS-PAGE confirmed that fusion protein Gst-METTL3 existed in inclusion bodies. Western blotting and SDS-PAGE confirmed the recombinant protein GST-METTL3 was successfully expressed and purified.In summary,this study provided the experimental materials for the furtherresearches on the effect of METTL3 in dairy cow lactation.

dairy cow;METTL3;prokaryotic expression;purification

Q786

A

1005-9369（2017）08-0001-07

時間2017-9-12 11:34:37[URL]http://kns.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20170912.1134.002.html

高學(xué)軍,劉麗杰,李冬,等.牛mettl3基因的原核表達(dá)與蛋白純化[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2017,48(8):1-7.

Gao Xuejun,Liu Lijie,Li Dong,et al.Prokaryotic expression and protein purification of dairy cowmettl3 gene[J].Journal of Northeast Agricultural University,2017,48(8):1-7.(in Chinese with English abstract)

2017-06-22

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2013AA102504-03）

高學(xué)軍（1969-），男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為乳業(yè)生物技術(shù)。E-mail:gaoxj53901@163.com