付偉超 梁昊岳 王 楠 于文穎 程雪蓮 任怡然 楊晚竹 陳 婷 白 楊 董 芳*

兩種流式細(xì)胞術(shù)分析軟件用于檢測小鼠骨髓造血干祖細(xì)胞的方法比較*

付偉超①梁昊岳①王 楠①于文穎①程雪蓮①任怡然①楊晚竹①陳 婷①白 楊①董 芳①*

目的：探討流式細(xì)胞術(shù)中兩種不同分析軟件在小鼠造血干細(xì)胞(HSC)分析中的特點(diǎn)和差異。方法：使用小鼠骨髓細(xì)胞懸液作為實(shí)驗(yàn)材料，采用BD Aria Ⅲ流式細(xì)胞儀檢測小鼠造血干祖細(xì)胞(HSPCs)，分別應(yīng)用BD FACSDiva Software v6.1.3和FlowJo 7.6.1軟件對(duì)檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并對(duì)比分析其數(shù)據(jù)結(jié)果。結(jié)果：FACSDiva與FlowJo軟件在數(shù)據(jù)導(dǎo)入、數(shù)據(jù)顯示、圈門、補(bǔ)償調(diào)節(jié)、數(shù)據(jù)導(dǎo)出和特色分析等存在細(xì)微差異，各項(xiàng)檢測指標(biāo)均可實(shí)現(xiàn)多色流式細(xì)胞分析功能。結(jié)論：FACSDiva和FlowJo軟件分析同一樣本所得結(jié)果具有較高的一致性。

流式細(xì)胞術(shù)；造血干祖細(xì)胞；FACSDiva軟件；FlowJo軟件

造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell，HSC)存在于哺乳動(dòng)物不同階段造血器官，如胎肝、臍血和骨髓中，被特定的造血微環(huán)境包圍[1]。HSC可以具體分為長周期造血干細(xì)胞(long term-haematopoietic stem cell，LT-HSC)和短周期造血干細(xì)胞(short term-hematopoietic cell，ST-HSC)，在造血系統(tǒng)發(fā)生過程及造血穩(wěn)態(tài)的維持中發(fā)揮著十分重要的作用。小鼠HSC常用的表面標(biāo)記有系列抗原Lin、Sca-l和c-Kit等，其余表面標(biāo)記如Flk2、CD34和CD61常與LSK聯(lián)合使用[2-4]。LT-HSC是Flk2陰性，而Flk2+HSC主要是擁有短期造血重建功能的STHSC[5]。應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)分析小鼠骨髓造血干祖細(xì)胞(hematopoietic stem and progenitor cells，HSPCs)，是進(jìn)行骨髓移植重建等科研實(shí)驗(yàn)工作的基礎(chǔ)，具有重要的科學(xué)意義。

近年來，隨著流式細(xì)胞術(shù)的不斷發(fā)展，流式分析軟件的功能也在不斷優(yōu)化，以滿足流式細(xì)胞術(shù)使用者在細(xì)胞周期、凋亡和表型等多方面的應(yīng)用需求。FACSDiva軟件和FlowJo軟件是目前科學(xué)研究中最常用的兩款流式分析軟件，但目前對(duì)上述兩款軟件的使用分析方法的對(duì)比研究尚無報(bào)道。為此，本研究對(duì)不同流式分析軟件的使用方法進(jìn)行對(duì)比分析，并對(duì)應(yīng)用不同軟件檢測小鼠骨髓HSPCs的分析結(jié)果進(jìn)行比較，旨在能夠?yàn)榱魇椒治鲕浖氖褂谜咛峁┙梃b。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

BD Aria Ⅲ型流式細(xì)胞儀(美國Becton Dickinson公司)，Rainbow Beads。APC-Cy7標(biāo)記的抗小鼠Lineage抗體、APC標(biāo)記的抗小鼠c-kit抗體、FITC標(biāo)記的抗小鼠CD34抗體、PE-Cy7標(biāo)記的抗小鼠Sca-1抗體和PE標(biāo)記的抗小鼠CD16/32抗體(美國eBioscience公司)；1×磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffer solution，PBS)鞘液(無錫傲銳東源生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

將Rainbow Beads用無菌鞘液稀釋備用，取小鼠骨髓細(xì)胞，使用流式抗體染色，避光30 min后用2 ml磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞，離心后重懸于PBS溶液，溶液中細(xì)胞濃度水平在107個(gè)細(xì)胞/ml以下，2 h內(nèi)上機(jī)進(jìn)行流式分析。

1.2.2 樣品檢測

開啟BD Aria Ⅲ型流式細(xì)胞儀，用Rainbow Beads檢測儀器各通道，應(yīng)用FACSDiva檢測軟件。在前向角散射光(forward scatter，F(xiàn)SC)和側(cè)向角散射光(side scatter，SSC)散點(diǎn)圖中顯示細(xì)胞群，調(diào)節(jié)熒光電壓等參數(shù)，記錄總細(xì)胞數(shù)≥200 000個(gè)，保存實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(.FCS格式)。

1.2.3 小鼠骨髓HSC流式分析

分別應(yīng)用BD FACSDiva Software v6.1.3和FlowJo 7.6.1分析軟件，對(duì)小鼠骨髓HSC進(jìn)行流式分析，圈選表型為Lin-CD34-c-kit+sca-1+的小鼠骨髓HSC，分析細(xì)胞群比例。

2 結(jié)果

2.1 FACSDiva和FlowJo軟件總觀

FACSDiva分析軟件總觀主要由文件導(dǎo)入、數(shù)據(jù)列表、流式圖顯示、補(bǔ)償調(diào)節(jié)及數(shù)據(jù)保存等模塊組成，如圖1所示。

圖1 FACSDiva軟件總觀界面圖

FlowJo軟件總觀主要由文件導(dǎo)入、數(shù)據(jù)列表、流式圖顯示、補(bǔ)償調(diào)節(jié)及數(shù)據(jù)保存等模塊組成，如圖2所示。

圖2 FlowJo軟件總觀界面圖

兩款軟件都可以完成多色的流式分析并確定細(xì)胞群比例，二者在總觀方面有如下區(qū)別：①FACSDiva軟件為界面式操作軟件，可全屏顯示于兩個(gè)電腦顯示器，操作較為方便，顯示空間較大，各模塊顯示可不重疊，而FlowJo軟件為窗口式操作軟件，每使用一個(gè)模塊的功能需要打開一個(gè)新的對(duì)話框，各模塊顯示具有重疊性，但節(jié)省成本和空間；②FACSDiva軟件具備流式分析結(jié)果圖顯示界面，可以將所有流式圖完整地展現(xiàn)在一個(gè)界面內(nèi)，而FlowJo軟件未設(shè)計(jì)顯示界面，需將流式圖逐級(jí)打開。

2.2 FACSDiva和FlowJo軟件數(shù)據(jù)導(dǎo)入比較

FACSDiva和FlowJo兩款軟件均可導(dǎo)入FCS格式的流式檢測數(shù)據(jù)并顯示流式結(jié)果圖，二者主要區(qū)別如下。

(1)FACSDiva通過先建立experiment，然后點(diǎn)擊File界面下的Import選項(xiàng)導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(FCS文件)，而FlowJo通過拖拽式文件導(dǎo)入模式，可直接將完整的數(shù)據(jù)文件夾一次性拖拽進(jìn)入軟件內(nèi)，完成流式數(shù)據(jù)的導(dǎo)入，如圖3、圖4所示。

圖3 FACSDiva軟件數(shù)據(jù)導(dǎo)入界面圖

圖4 FlowJo軟件數(shù)據(jù)導(dǎo)入界面圖

(2)在數(shù)據(jù)導(dǎo)入方面，F(xiàn)lowJo軟件操作更加簡易便捷。向FlowJo中導(dǎo)入數(shù)據(jù)時(shí)，儲(chǔ)存實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(FCS文件)的各層文件夾要求不能有中文字符，否則會(huì)導(dǎo)致流式圖無法正常顯示，而向FACSDiva中導(dǎo)入數(shù)據(jù)時(shí)則無此要求。

2.3 FACSDiva和FlowJo軟件數(shù)據(jù)顯示比較

FACSDiva和FlowJo兩款軟件均可顯示流式單參數(shù)直方圖、雙參數(shù)散點(diǎn)圖、密度圖和等高線圖等常見流式結(jié)果圖，顯示圖形結(jié)果具有一致性，如圖5、圖6所示。

圖5 FACSDiva軟件數(shù)據(jù)顯示界面圖

圖6 FlowJo軟件數(shù)據(jù)顯示界面圖

FACSDiva和FlowJo兩款軟件差別為：①FACSDiva軟件改變橫縱坐標(biāo)表示方式(線性或?qū)?shù))需要在Inspector對(duì)話框中調(diào)節(jié)，而FlowJo軟件可以直接通過坐標(biāo)旁邊的按鈕調(diào)節(jié)；②FACSDiva軟件需新建“Show Population Hierarchy”對(duì)話框來顯示不同等級(jí)的細(xì)胞群比例，而FlowJo軟件會(huì)自動(dòng)隨著圈門步驟的進(jìn)行，在各窗口中直接顯示細(xì)胞群比例；③FACSDiva軟件可以通過選擇“Create Statistic View”選項(xiàng)，顯示包括Max、Min、Mean、Median、SD、rSD、%CV和%rCV等在內(nèi)的多項(xiàng)參數(shù)。

FACSDiva和FlowJo軟件變換熒光通道顯示界面主要區(qū)別在于，F(xiàn)lowJo軟件可以直接顯示各熒光通道是否已經(jīng)調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償，調(diào)過補(bǔ)償后各通道標(biāo)識(shí)前面會(huì)加入“Comp-”標(biāo)記，同時(shí)在主界面流式管左側(cè)加圖標(biāo)，給予使用者提示和方便，F(xiàn)ACSDiva軟件沒有這一顯示，如圖7、圖8所示。2.4 FACSDiva和FlowJo軟件圈門比較

圖7 FACSDiva軟件變換熒光通道顯示界面圖

圖8 FlowJo軟件變換熒光通道顯示界面圖

FACSDiva和FlowJo兩款軟件都可以運(yùn)用不同的設(shè)門工具對(duì)流式數(shù)據(jù)結(jié)果中目的細(xì)胞群進(jìn)行圈門操作并顯示下一級(jí)流式門內(nèi)的細(xì)胞群比例，如圖9、圖10所示。

圖9 FACSDiva軟件圈門界面圖

圖10 FlowJo軟件圈門界面圖

通過FACSDiva和FlowJo軟件顯示下一級(jí)流式門界面顯示，二者主要區(qū)別為：FACSDiva軟件通過先建立流式圖，然后右鍵選擇“Show Populations”來選擇所要顯示的目的細(xì)胞群，這一操作也可以在“Inspector”中的“Population”選項(xiàng)中完成，而FlowJo軟件可以通過直接單擊上一級(jí)流式門內(nèi)區(qū)域，軟件自動(dòng)彈出此流式門內(nèi)圖形的方式來完成下一級(jí)流式圖的顯示，如圖11、圖12所示。

圖11 FACSDiva軟件顯示下一級(jí)流式圖界面圖

圖12 FlowJo軟件顯示下一級(jí)流式圖界面圖

2.5 FACSDiva和FlowJo軟件熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)比較

由于在流式細(xì)胞檢測中，熒光素的發(fā)射光譜存在重疊現(xiàn)象，單個(gè)熒光通道中的信號(hào)會(huì)部分滲漏到其他通道中，造成信號(hào)誤差，所以通過流式分析軟件進(jìn)行補(bǔ)償調(diào)節(jié)對(duì)數(shù)據(jù)分析具有重要的意義。兩款流式分析軟件都具有將其他通道滲漏到當(dāng)前通道的信號(hào)扣除的功能，保證流式細(xì)胞分析的準(zhǔn)確性和細(xì)胞群比例的可靠性，F(xiàn)ACSDiva和FlowJo軟件熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)界面如圖13、圖14所示。

圖13 FACSDiva軟件熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)界面圖

圖14 FlowJo軟件熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)界面圖

FACSDiva和FlowJo軟件主要區(qū)別為：①FACSDiva軟件在“Cytometer Settings”界面下的“Compensation”對(duì)話框中調(diào)節(jié)補(bǔ)償，而FlowJo軟件在“Windows”界面下的“Open Compensation Editor”對(duì)話框中調(diào)節(jié)補(bǔ)償，F(xiàn)ACSDiva軟件以列表方式顯示補(bǔ)償參數(shù)，而FlowJo軟件以矩陣方式顯示補(bǔ)償參數(shù)；②FACSDiva軟件在完成補(bǔ)償調(diào)節(jié)后，可通過單擊“Enable Compensation”使補(bǔ)償結(jié)果應(yīng)用于流式數(shù)據(jù)，而FlowJo軟件則通過“Compensation”界面下的“Add To Group”選項(xiàng)應(yīng)用補(bǔ)償值于數(shù)據(jù)組，如圖15所示。

圖15 FlowJo軟件熒光補(bǔ)償應(yīng)用于數(shù)據(jù)組界面圖

FACSDiva和FlowJo軟件熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)完成后，流式散點(diǎn)圖符合“橫平豎直”原則，補(bǔ)償調(diào)節(jié)結(jié)果理想，如圖16、圖17所示。

圖16 FACSDiva軟件熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)后流式界面圖

圖17 FlowJo軟件熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)后流式界面圖

2.6 FACSDiva和FlowJo軟件分析小鼠骨髓HSC造血干祖細(xì)胞比例比較

分別使用FACSDiva和FlowJo軟件分析小鼠骨髓HSPCs造血干祖細(xì)胞流式比例數(shù)據(jù)，P7門內(nèi)為小鼠骨髓LT-HSC，其表型為Lin-c-kit+sca-1+CD34-CD16/32；P5門內(nèi)為小鼠骨髓ST-HSC，其表型為Lin-c-kit+sca-1+CD34+CD16/32-；P6門內(nèi)為小鼠骨髓多能祖細(xì)胞(multiple potential pro-genitor，MPP)，其表型為Lin-c-kit+sca-1+CD34+CD16/32+。FACSDiva和FlowJo軟件分析小鼠骨髓HSPCs群比例結(jié)果：LT-HSC為6.7%和6.09%，ST-HSC為32.6%和32.2%，MPP為57.4%和58.4%，分析結(jié)果具有較高的一致性(如圖18、圖19所示)。

圖18 FACSDiva分析小鼠骨髓HSPCs造血干祖細(xì)胞比例

圖19 FlowJo軟件分析小鼠骨髓HSPCs造血干祖細(xì)胞比例

2.7 FACSDiva和FlowJo軟件分析結(jié)果導(dǎo)出比較

FACSDiva和FlowJo兩款軟件均可將流式圖通過“Copy”或“Copy Picture”的方式導(dǎo)出到畫圖軟件中，完成圖片格式的保存，兩款軟件分析流式圖導(dǎo)出界面如圖20、圖21所示。

值得注意的是，F(xiàn)ACSDiva軟件可以將完整的流式結(jié)果保存為.pdf文件，也可以將多個(gè)流式分析結(jié)果通過“Batch Analysis”的方式一鍵保存；而FlowJo軟件可以將流式分析得到的不同門內(nèi)的細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞群比例導(dǎo)出為Excel格式的數(shù)據(jù)，方便后續(xù)的統(tǒng)計(jì)分析。兩款軟件在數(shù)據(jù)保存方面各有優(yōu)勢，各具特色，其數(shù)據(jù)導(dǎo)出界面如圖22、圖23所示。

圖20 FACSDiva軟件分析流式圖導(dǎo)出界面圖

圖21 FlowJo軟件分析流式圖導(dǎo)出界面圖

圖22 FACSDiva軟件分析數(shù)據(jù)導(dǎo)出界面圖

圖23 FlowJo軟件分析數(shù)據(jù)導(dǎo)出界面圖

2.8 FlowJo軟件特色分析功能

(1)在常規(guī)流式分析中，一般采用直方圖和散點(diǎn)圖顯示流式數(shù)據(jù)結(jié)果，分別顯示一維和二維的數(shù)據(jù)信息，而FlowJo軟件完成了對(duì)流式數(shù)據(jù)的三維分析，即在一幅流式圖中顯示三個(gè)流式參數(shù)，實(shí)現(xiàn)了數(shù)據(jù)呈現(xiàn)方式的多樣化，促進(jìn)了流式軟件分析功能的進(jìn)步和發(fā)展。同時(shí)，F(xiàn)lowJo軟件還設(shè)計(jì)了細(xì)胞周期、增殖和細(xì)胞動(dòng)力學(xué)等分析功能，拓展了流式分析軟件的綜合分析功能，F(xiàn)lowJo軟件分析三維顯示功能和高級(jí)分析功能如圖24、圖25所示。

圖24 FlowJo軟件分析三維顯示功能界面圖

圖25 FlowJo軟件高級(jí)分析功能界面圖

(2)對(duì)于細(xì)胞周期分析，實(shí)現(xiàn)了與Modfit軟件向媲美的分析功能，可以通過函數(shù)模擬，實(shí)現(xiàn)對(duì)檢測樣本G0/G1、S、G2/M各期的細(xì)胞群比例分析，集合軟件自動(dòng)分析和人工手動(dòng)分析兩種方式，最大程度的保證了分析的準(zhǔn)確性和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性。兩種流式分析軟件主要功能比較見表1。

3 討論

近年來，流式細(xì)胞術(shù)獲得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，在血液學(xué)等領(lǐng)域有著更為廣泛的應(yīng)用[6-10]。流式細(xì)胞儀的發(fā)展趨勢是向多激光多色、小型化和高速分析分選方面發(fā)展。此外，流式細(xì)胞儀聚焦原理多樣化和與其他生物學(xué)技術(shù)密切結(jié)合也是流式細(xì)胞儀發(fā)展的一大特色。在傳統(tǒng)的應(yīng)用流體力學(xué)聚焦原理的流式細(xì)胞儀基礎(chǔ)上，發(fā)展出了應(yīng)用聲波聚焦原理的流式細(xì)胞儀、微毛細(xì)管技術(shù)為核心的流式細(xì)胞儀、將流式細(xì)胞檢測與熒光顯微成像相結(jié)合的顯微成像流式細(xì)胞儀和采用金屬元素標(biāo)記物識(shí)別細(xì)胞信號(hào)分子的質(zhì)譜流式細(xì)胞儀等[11-13]。然而，目前部分流式細(xì)胞儀仍存在操作復(fù)雜、軟件友好程度低的情況，因此，不斷開發(fā)流式分析軟件功能、優(yōu)化軟件設(shè)計(jì)、使軟件使用更加便捷具有重要的意義。

表1 兩種流式分析軟件主要功能比較

FACSDiva軟件是美國BD公司開發(fā)的一款集操作和分析于一體的流式軟件，廣泛應(yīng)用于包括BD LSRⅡ、BD LSRFortessa、BD CantoⅡ和BD Aria系列在內(nèi)的流式細(xì)胞儀中。FlowJo軟件是由美國斯坦福大學(xué)設(shè)計(jì)研發(fā)的一款功能強(qiáng)大的流式數(shù)據(jù)分析軟件，可以分析任何流式細(xì)胞儀收集的流式數(shù)據(jù)，是流式領(lǐng)域最受推薦的一款專業(yè)分析軟件之一。FACSDiva軟件和FlowJo軟件在分析細(xì)胞周期、凋亡和表型等方面具有高度的可信性，兩種流式分析軟件的主要功能比較見表1，二者在數(shù)據(jù)導(dǎo)入、數(shù)據(jù)顯示及補(bǔ)償調(diào)節(jié)等方面略具差異[14-15]。同時(shí)，F(xiàn)lowJo軟件具備部分獨(dú)特的高級(jí)分析功能，如三維顯示、周期分析等，極大擴(kuò)展了該軟件的應(yīng)用范圍。

4 結(jié)語

通過分析和比較了兩款常用的流式細(xì)胞分析軟件和小鼠骨髓HSPCs流式結(jié)果，為流式分析軟件的使用提供了借鑒。流式分析軟件是解讀流式數(shù)據(jù)不可或缺的工具，未來在FACSDiva和FlowJo軟件的幫助下，流式細(xì)胞儀在臨床和科研領(lǐng)域的應(yīng)用范圍會(huì)更加廣闊、更為深入，不斷為人類認(rèn)識(shí)疾病、治療疾病提供科學(xué)依據(jù)。

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Comparison of two analysis softwares of flow cytometry for the detected results of mice bone marrow hematopoietic stem and progenitor cells/

FU Wei-chao, LIANG Hao-yue, WANG Nan, et al//
China Medical Equipment,2017,14(9):161-166.

Objective: To explore the characteristics and differences of two analysis softwares used in flow cytometric analysis of mice bone marrow hematopoietic stem and progenitor cell. Methods: Mice bone marrow cells were used as experimental materials, and BD Aria III flow cytometer was used to detect HSPCs, and FACSDiva Software v6.1.3 and Flow Jo 7.6.1 software were used to analyze the detected data, respectively, and then these data were compared and further analyzed. Results: There were slightly differences between FACS Diva and FlowJo in data import, data display, gating, compensation regulation, data export and special analysis and so on. Besides, both of the two softwares could achieve the function of multicolor flow analysis in these indicators. Conclusion: Results of the same sample analyzed, respectively, by FACS Diva and Flow Jo are highly consistent.

Flow cytometry; Hematopoietic stem and progenitor cell; FACSDiva software; FlowJo software

State Key Laboratory of Experimental Hematology, Institute of Hematology & Blood Disease Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Tianjin 300020, China.

1672-8270(2017)09-0161-06

R-331

A

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2017.09.046

2017-03-24

國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(81500085)“p18在造血干細(xì)胞向B細(xì)胞分化中的作用及機(jī)制研究”；北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院協(xié)和青年基金(332015125)“Puma基因缺陷對(duì)造血干細(xì)胞擴(kuò)增的影響及其機(jī)制研究”

①中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液病醫(yī)院(血液學(xué)研究所) 實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津 300020

*通訊作者：dongfang@ihcams.ac.cn

付偉超,男,(1992- ),本科學(xué)歷，技師。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液病醫(yī)院(血液學(xué)研究所)從事流式細(xì)胞測試工作。