曾 榮 劉宇甄 童建波 何艷艷 林 彤 徐浩翔 李 岷

遺傳性對(duì)稱性色素異常癥一家系A(chǔ)DAR1基因新突變

曾 榮1,2劉宇甄1,2童建波1,2何艷艷1,2林 彤1,2徐浩翔1,2李 岷1,2

目的： 確定一遺傳性對(duì)稱性色素異常癥家系A(chǔ)DAR1基因的突變位點(diǎn)。方法： 提取家系中2例患者、2名表型正常者及50名與本家系無(wú)關(guān)的正常對(duì)照外周血DNA，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增ADAR1基因所有編碼區(qū)并進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果： 該家系中2例患者均存在ADAR1基因錯(cuò)義突變(c.662C>T)，導(dǎo)致p.P211R改變，家系中2名未患病的個(gè)體和50名健康對(duì)照均未發(fā)現(xiàn)上述突變。結(jié)論： ADAR1基因c.662C>T錯(cuò)義突變是導(dǎo)致該家系發(fā)生DSH的致病性突變，在國(guó)內(nèi)外屬首次報(bào)道。

遺傳性對(duì)稱性色素異常癥； ADAR1； 基因突變

遺傳性對(duì)稱性色素異常癥(dyschromatosis symmerica hereditaria, DSH)，亦稱為土肥肢端色素沉著癥，是一種少見(jiàn)的常染色體顯性遺傳皮膚病[1]。典型的臨床表現(xiàn)為肢端伸側(cè)尤其是手背/足背部出現(xiàn)對(duì)稱性色素減退斑和色素沉著斑，面部的皮損類似于雀斑，可不伴色素減退斑[2]。2003年，日本學(xué)者M(jìn)iyamura等采用全基因組掃描和候選基因測(cè)序，確定本病的致病基因?yàn)殡p鏈RNA特異性腺苷脫氨酶(adenosine deaminase acting on RNA1，ADAR1)基因[3]。目前國(guó)內(nèi)外均有散發(fā)或家族性DSH的報(bào)道。我們對(duì)一個(gè)DSH家系進(jìn)行了臨床資料的收集和分子遺傳性檢測(cè)。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 先證者,男，20歲，漢族。因四肢末端色素沉著、色素減退斑10年就診于我院。10歲開(kāi)始雙手背和足背出現(xiàn)散在針尖至粟粒大色素沉著斑和色素減退斑，隨著年齡增長(zhǎng)皮疹逐漸增多擴(kuò)大，并蔓延至雙前臂、雙踝關(guān)節(jié)，皮損表現(xiàn)為深淺不一的圓形、不規(guī)則形色素沉著、色素減退斑，境界清楚，部分融合成網(wǎng)狀，無(wú)瘢痕(圖1)，無(wú)自覺(jué)癥狀。日曬后手背、前臂皮損可加重。父母否認(rèn)近親結(jié)婚(圖2)。

圖1 雙手背、足背不規(guī)則色素沉著斑和色素減退斑

圖2 遺傳性對(duì)稱性色素異常癥患者家系圖

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取 經(jīng)過(guò)知情同意后，分別采集家系成員靜脈血各3 mL，其中2例患者和非患者1人；同時(shí)提取50名與本家系無(wú)關(guān)的正常人DNA作為對(duì)照。采用美國(guó)promega公司DNA提取試劑盒提取基因組DNA.

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)ADAR1基因的mRNA序列設(shè)計(jì)15對(duì)PCR引物擴(kuò)增ADAR1基因所有外顯子編碼區(qū)和側(cè)翼序列。其中第14/15外顯子引物為：上游引物：5'-AGGTTTCCATCTTTCTCCCG-3'，下游引物：5'-ACACCCTAGTATGACACACC-3'，所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min后，94℃變性45 s，56℃～62℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)。72℃后延伸10 min，擴(kuò)增結(jié)束后用15g/L瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化后直接在ABI 377型全自動(dòng)測(cè)序儀(美國(guó)Applied Biosystem公司)上測(cè)序，所有測(cè)序結(jié)果與NCBI blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析比對(duì)。

2 結(jié)果

以家系中2例患者和2名非患者的基因組DNA為模板，15對(duì)引物在各自條件下分別擴(kuò)增出各自的產(chǎn)物，產(chǎn)物純化后測(cè)序，將患者全部外顯子直接測(cè)序結(jié)果與上述數(shù)據(jù)庫(kù)中所公布的序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該家系中2例患者ADAR1基因的第662位堿基胞嘧啶(C)突變?yōu)?G)，引起ADAR1基因的第2外顯子221位密碼子由CAA變成CGA(圖3)，導(dǎo)致正常的脯氨酸被精氨酸替代。家系中非患者及50名無(wú)親緣關(guān)系的正常人對(duì)照未見(jiàn)該改變。

圖3 ADAR1基因測(cè)序圖 a：先證者，b：正常對(duì)照。ADAR1基因發(fā)生c.662C>T錯(cuò)義突變，導(dǎo)致第221位氨基酸由脯氨酸變?yōu)榫彼?/p>

3 討論

DSH是一種少見(jiàn)的常染色體顯性遺傳性皮膚病?？梢?jiàn)于各個(gè)種族，但是以亞洲人居多，其中中國(guó)和日本病例報(bào)道較多[4]。該病由日本學(xué)者Toyama在1929年報(bào)道。約73%患者在6歲前發(fā)病，該病極少累及其他系統(tǒng)。主要臨床表現(xiàn)為手、足部對(duì)稱性色素沉著、色素減退斑，面部皮損類似于雀斑樣損害，可不伴有色素減退。患者一般無(wú)自覺(jué)癥狀，色素沉著日曬后加重，夏重冬輕，可持續(xù)終生。組織病理表現(xiàn)為色素沉著區(qū)黑色素細(xì)胞減少，但分泌黑素的活性增強(qiáng)，大量的黑素沉積于基底層。在色素減少區(qū)幾乎無(wú)色素沉積，黑素細(xì)胞數(shù)量也減少，并且這些細(xì)胞中有很多的退化細(xì)胞質(zhì)空泡形成[4,5]。隨著Miyamura等確定ADAR1基因?yàn)楸静〉闹虏』?，?duì)于不同的散發(fā)或家系DSH患者致病基因的突變檢測(cè)成為了一個(gè)研究熱點(diǎn)。

人類的ADAR1基因全長(zhǎng)30 kb，相對(duì)分子量為39000Da，包含15個(gè)外顯子，編碼1226個(gè)氨基酸序列的雙鏈RNA特異性腺苷脫氨酶[3]。該酶至少包括6個(gè)功能域，依次為2個(gè)Z-alpha 區(qū)(覆蓋2號(hào)外顯子前半部分編碼)，引導(dǎo)該蛋白靠近正在轉(zhuǎn)錄的DNA，以便對(duì)底物RNA發(fā)生作用；3個(gè)dsRNA結(jié)合區(qū)(DRBM)(覆蓋2～7號(hào)外顯子)，主要進(jìn)行底物識(shí)別并結(jié)合底物的作用；1個(gè)酶催化結(jié)構(gòu)域(ADEAMc區(qū))(包含9～15號(hào)外顯子)，實(shí)現(xiàn)腺苷的脫氨基作用[6]。迄今為止，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)共報(bào)道該基因突變約150余種，其中主要是錯(cuò)義突變，不少于60%的出現(xiàn)在第9～15號(hào)外顯子[7，8]。

我們通過(guò)研究該家系發(fā)現(xiàn)ADAR1基因的第2外顯子221位密碼子由CCA變成CGA(c.622C>T)，導(dǎo)致脯氨酸被精氨酸取代(p.P211R)。而家系中正常人及50名無(wú)關(guān)正常對(duì)照者未發(fā)現(xiàn)此改變。發(fā)生此突變后，由于氨基酸化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同，則可能會(huì)引起所編碼蛋白質(zhì)功能域的改變，進(jìn)而成為導(dǎo)致DSH發(fā)病的分子機(jī)制之一。查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)未發(fā)現(xiàn)有該突變的報(bào)道，證實(shí)為新的突變。

總之，我們通過(guò)對(duì)1個(gè)DSH家系的研究，發(fā)現(xiàn)了ADAR1基因的一個(gè)錯(cuò)義突變(c.622C>T)，導(dǎo)致p.P211R改變。經(jīng)查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)為首次報(bào)道的新突變。我們的結(jié)果豐富了ADAR1基因的突變譜，可為深入研究DSH發(fā)病分子遺傳學(xué)機(jī)制提供一定的理論依據(jù)，同時(shí)也可為該家系進(jìn)行產(chǎn)前診斷和遺傳咨詢提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(收稿：2017-04-28)

IdentificationofanovelmutationofADAR1geneinafamilywithdyschromatosissymmetricalhereditaria

ZENGRong1,2,LIUYuzhen1,2,TONGJianbo1，2,HEYanyan1,2,LINTong1,2,XUHaoxiang1,2,LIMin1,2.

1.InstituteofDermatology,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Nanjing210042,China; 2.JiangsuKeyLaboratoryofMolecularBiologyforSkinDiseases&STDs,Nanjing210042,China

s:XUHaoxiang,E-mail:xbpipi@163.comLIMin,E-mail:drlimin@sina.cn

Objective: To identify the mutation of ADAR1 gene in a family with dyschromatosis symmetrical hereditaria (DSH).Methods: Genomic DNA was extracted from the peripheral blood of the family members (including 2 patients and 2 unaffected members) and 50 healthy controls. All the exons of ADAR1 gene and their flanking intronic sequences were amplified by PCR and direct sequencing was performed to screen the mutations in gene.Results: A missense mutation (c.662C>T) in ADAR1 gene was identified in the two patients and none mutation was found in 2 normal family members and healthy controls.Conclusion: The missense mutation (c.662C>T) in the ADAR1 gene probably underlies the DSH in this family, which is the first report in the date base.

dyschromatosis symmetrica hereditaria; ADAR1; gene mutation

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目(編號(hào)：2016-I2M-1-003) 江蘇省自然科學(xué)基金(編號(hào)：BK20150068) 國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：81673087) 國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(編號(hào)：81502739) 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院青年基金項(xiàng)目(編號(hào)：3332016108)

1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所,2100422江蘇省皮膚性病學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,210042

徐浩翔, E-mail: xbpipi@163.com 李 岷, E-mail: drlimin@sina.cn