后俊生 張學(xué)軍

·論著·

GPR78與ETS1基因交互作用與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的相關(guān)性研究

后俊生1張學(xué)軍2,3,4

目的： 明確GPR78和ETS1基因的交互作用對系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)發(fā)病的影響。方法：在前期GWAS的基礎(chǔ)上，選擇可能存在共同生物學(xué)效應(yīng)的GPR78(SNP rs3103074)和ETS1(SNP rs6590330)，在中國漢族人群4199例SLE和8255名對照中基因分型。通過logistic回歸模式檢驗這兩者之間可能存在的交互作用。結(jié)果： GPR78和ETS1基因在中國漢族人SLE發(fā)病中存在顯著的交互作用(Pcombined=1.4×10-4,OR=1.27)。單個SNP與SLE的關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)GPR78(SNP rs3103074)是提示點(P=6.2×10-4,OR=1.22,95%CI:1.12～1.32)，與SLE中度關(guān)聯(lián)。結(jié)論： GPR78與ETS1基因之間存在著顯著的交互作用，可能在SLE的發(fā)病中發(fā)揮作用。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡； ETS1； GPR78； 交互作用

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一個自身免疫性疾病，以累及多器官、多系統(tǒng)、產(chǎn)生自身抗體為特征。其發(fā)病機制目前認(rèn)為和遺傳、環(huán)境、雌激素等因素相關(guān)。其中遺傳因素是一個主要的致病因素[1]，隨著全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome-wide Association Study，GWAS)在尋找疾病易感基因上的應(yīng)用，找到了至少30多個明確的，與SLE關(guān)聯(lián)顯著的易感位點和基因，比如TNFAIP3、ETS1、TNIP1、BLK、ITGAM等[2-6]。但是這些基因或位點只能解釋不到15%的遺傳風(fēng)險[7]。復(fù)雜疾病的致病往往是由很多基因或位點共同作用所致，一些位點或基因的作用很弱，它們對疾病的貢獻(xiàn)很弱，被稱為微效基因，在GWAS單點分析中容易被忽略。許多微效基因的作用可以累積起來產(chǎn)生累加效應(yīng)，進(jìn)而形成較為明顯的性狀，要尋找到這些缺失的遺傳，基因與基因之間的交互作用研究是一個很好的方法。基因與基因交互作用由Fisher首次定義，也稱上位性作用，是對不同基因互相疊加后對疾病表型表達(dá)影響的一種分析[8],基因與基因之間的交互作用可用來補充說明疾病的遺傳性。前期GWAS結(jié)果提示GPR78 rs3103074與SLE可能相關(guān)(圖1)。GPR78是G蛋白偶聯(lián)受體家族中的一員[9]，GPRs是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最大的受體超家族，介導(dǎo)很多的生物學(xué)效應(yīng)，G蛋白偶聯(lián)受體相關(guān)的信號通路有cAMP/PKA, IP3/DAG這兩個信號通路。考慮這個基因在細(xì)胞中可能發(fā)揮的功能，被選出來做進(jìn)一步的交互作用研究。 ETS1 rs6590330這個點在不同的研究小組中均被報道和SLE顯著相關(guān)[3,10]。ETS-1是ETS轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，有特有的ETS DNA結(jié)合區(qū)域，它們調(diào)控了很多的細(xì)胞進(jìn)程，包括細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化，ETS1是多個基因的轉(zhuǎn)錄激活因子[11]，故而被選出來做交互作用的研究。本研究利用SLE的前期GWAS數(shù)據(jù)，分析GPR78和ETS1基因交互作用對SLE發(fā)病的影響。

SNP rs3103074(大紅色鉆石性狀)在4p16.1上，位于GPR78基因上游大約19.6 kb。物理位置是8613568 bp，在8613～8633 kb大約200 kb的這個連鎖不平衡區(qū)域內(nèi)，只包含GPR78一個基因，所以SNP rs3103074這個點對應(yīng)到這個基因

圖1 LD結(jié)構(gòu)和4p16.1區(qū)域關(guān)聯(lián)結(jié)果

1 資料與方法

1.1 研究對象 所有SLE的病例和對照樣本均從全國各地的醫(yī)院收集而來，均系漢族人群。初篩階段使用樣本量是1047例SLE患者和1205名對照；驗證樣本根據(jù)地域分布分成2個驗證人群(來自中國中部的1643例SLE患者和5930名對照；來自中國南部的1509例SLE患者和1120名對照)。病例共計4199例(男312例，女3887例，平均年齡34.12歲，平均發(fā)病年齡29.65歲)，對照組共計8255例(男3817例，女4438例，平均年齡30.74歲)。研究對象之間無血緣關(guān)系，并且病例與對照之間經(jīng)過性別和年齡匹配。所有患者均符合SLE的診斷標(biāo)準(zhǔn)，參考1997年美國風(fēng)濕病學(xué)會修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)過兩位副主任醫(yī)師以上的專家確診。所有病例均使用統(tǒng)一的調(diào)查表，所有正常對照樣本均為健康人，排除SLE、其他自身免疫性疾病和其他系統(tǒng)性疾病，以及排除自身免疫病家族史(包括一、二、三級親屬)。所有研究對象均簽署了知情同意書，該項研究經(jīng)過安徽醫(yī)科大學(xué)倫理委員會同意，按照赫爾辛基宣言的條款執(zhí)行。

1.2 SNPs的選擇 用于交互作用研究SNPs的選擇是建立在之前SLE的GWAS基礎(chǔ)上，ETS1 rs6590330這個點在不同的研究小組中均被報道和SLE顯著相關(guān)[3,10]。前期GWAS結(jié)果提示GPR78 rs3103074與SLE可能相關(guān)(圖1)。為進(jìn)一步研究這兩者在SLE發(fā)病中所起的作用，選取前期GWAS數(shù)據(jù)庫中這兩個SNPs位點的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，做交互作用研究。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用PLINK1.07計算P值，OR值，95%置信區(qū)間，等位基因頻率估算及差異使用卡方檢驗，SNPs之間的交互作用在Epistasis部分完成。使用以性別和年齡做為協(xié)變量的logistic回歸分析研究SNPs之間的交互作用及每個SNP與SLE的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SNP rs3103074和rs6590330的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果 基因關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)GPR78 rs3103074與SLE呈現(xiàn)中度的關(guān)聯(lián)性(P=6.2×10-4,OR=1.22, 95%CI1.12～1.32)見表1。將這個SNP做基因分型，GG、AG和AA，在病例與對照人群中分別計算出這三個基因型的比例，發(fā)現(xiàn)GG這個基因型在患者人群中的比例小于正常人群，AA和AG這兩個基因型在患者人群中比例大于正常對照人群，所以AA和AG這兩個基因型是風(fēng)險基因型。使用風(fēng)險的基因型比非風(fēng)險的基因型，得到OR值，使用logistic回歸分析計算這些基因型P值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AA和AG這兩個基因型均會導(dǎo)致SLE的發(fā)病風(fēng)險增加,相應(yīng)P值和OR值分別是P=0.00014,OR=1.63和P=0.0075,OR=1.20,見表2。在之前的GWAS數(shù)據(jù)中顯示，SNP rs6590330與SLE呈現(xiàn)出顯著的相關(guān)性(P=1.77×10-25,OR=1.37,95%CI1.29～1.45)[3]。將這個SNP做基因分型，發(fā)現(xiàn)AG和AA在患者中的比例大于在正常對照中的比例，GG在患者中的比例小于正常對照，所以AG和AA是風(fēng)險基因型。同樣使用上述方法計算出P值和OR值，發(fā)現(xiàn)AA基因型顯著增加SLE的發(fā)病風(fēng)險(P=0.019,OR=1.84),見表2。

表1 rs3103074與SLE的相關(guān)性分析

注：OR和P值使用線性logistic回歸模式計算，校正了性別、年齡。A1：最小等位基因；A2：主要等位基因；F_A：病例中此等位基因頻率；F_U：對照中此等位基因頻率；OR:優(yōu)勢比，對于A1來說，A2是參照；CI：置信區(qū)間

2.2 交互作用的分析 在初篩階段，發(fā)現(xiàn)GPR78 rs3103074和ETS1 rs6590330 這兩個基因之間存在著顯著的交互作用(PGWAS=1.4×10-2,OR=1.43)，驗證之后再聯(lián)合的樣本中交互作用更顯著(Pcombined=1.36×10-4,OR=1.27)。本次研究做了基因型的交互作用，四種不同的交互模式下，發(fā)掘這兩個SNPs之間更深層次的交互作用。在四種交互模式下發(fā)現(xiàn)，rs3103074-AA或AG和rs6590330-AA存在著顯著的交互作用(P=0.005),rs3103074-AA或AG和rs6590330-AA或AG存在著更顯著的交互作用(P=0.0003),見表2。

注：OR和P值使用線性logistic回歸模式計算，校正了性別、年齡。交互作用的分析建立在這樣一個假設(shè)的基礎(chǔ)上：這兩個SNPs無任何的交互作用，比如協(xié)同效應(yīng)，拮抗效應(yīng)等

3 討論

SLE是一個復(fù)雜的自身免疫性疾病，臨床和試驗依據(jù)顯示SLE是一個典型的多因子疾病，如數(shù)目眾多的基因、環(huán)境、壓力和醫(yī)療因素等。然而復(fù)雜疾病的遺傳并不遵循孟德爾的遺傳模式，受到很多基因與環(huán)境因素的影響。為進(jìn)一步探索基因與基因之間的交互作用在SLE發(fā)病中的影響，本研究建立在前期GWAS基礎(chǔ)上，對發(fā)現(xiàn)的相關(guān)基因做進(jìn)一步的交互作用的研究。

GPR78目前只發(fā)現(xiàn)在人類的腦垂體和胎盤上表達(dá)[9]，雌激素與SLE發(fā)病相關(guān)，雌激素會使NZB/NZW小鼠病情加重[12]，妊娠會誘發(fā)或加重SLE患者的病情，而終止妊娠會減輕SLE患者的病情。因此，GPR78可能在妊娠和下丘腦-腦垂體-性腺軸中起到調(diào)節(jié)作用，繼而推測GPR78可能通過調(diào)節(jié)下丘腦-腦垂體-性腺軸進(jìn)而調(diào)節(jié)雌激素的生成或分泌，從而影響到SLE患者的病情。

本研究最主要的發(fā)現(xiàn)是GPR78和ETS1這兩個基因之間存在著顯著的交互作用， GPR78和ETS1這兩個基因可能介導(dǎo)著相同的信號通路。GPR78是G蛋白偶聯(lián)受體超家族中的一員[9]，當(dāng)配體與G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合后，激活質(zhì)膜上的磷脂酶C(PLC-β)，使質(zhì)膜上4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)水解成1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)和二酰基甘油(DAG)兩個第二信使，IP3與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3受體(IP3R)結(jié)合，觸發(fā)IP3R介導(dǎo)的鈣通道(IP3R/Ca++)，使胞內(nèi)Ca2+濃度升高，從而引起不同的生物學(xué)效應(yīng)[13]。在小鼠不成熟的CD4 T細(xì)胞里表達(dá)三種受體，分別是IP3R1，IP3R2，IP3R3。表達(dá)IP3R3這個受體的基因受到轉(zhuǎn)錄激活因子ETS-1調(diào)節(jié)[14]，因此推測GPR78和ETS1這兩個基因在IP3R/Ca++這個信號通路上存在著某種聯(lián)系。IP3R/Ca++這個通道的激活抑制了CD4 T細(xì)胞IL-17的表達(dá)[16]，IL-17在SLE患者中表達(dá)異常增高，在SLE患者血漿中的濃度異常增高[15]。IL-17與SLE的疾病嚴(yán)重性和活動性相關(guān)[16,17]。IL-17在SLE患者中的異常增高表達(dá)主要是由于雙陰性CD4 T細(xì)胞亞型和CD4+T細(xì)胞的過度表達(dá)造成[18]。所以以上這些證據(jù)表明IP3R/Ca++這個通道可能是通過上調(diào)IL-17的表達(dá)參與SLE的疾病發(fā)病。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了GPR78這個基因與SLE相關(guān)聯(lián)，且和ETS1基因存在著顯著的交互作用。這兩個基因可能通過IP3R/Ca++信號通路在SLE的發(fā)病中共同發(fā)揮效應(yīng)，導(dǎo)致SLE的發(fā)病或加重。GPR78這個基因的功能還不清楚，暫時還不能從基因功能的角度揭示這個基因和SLE的關(guān)聯(lián)性。本研究有助于進(jìn)一步了解SLE的發(fā)病機制，為研發(fā)更高效安全的藥物提供基礎(chǔ)，但這些結(jié)果應(yīng)用臨床尚需更多的研究。

[1] Wang J, Yang S, Chen JJ, et al. Systemic lupus erythematosus: a genetic epidemiology study of 695 patients from China[J]. Arch Dermatol Res,2007,298(10):485-491.

[2] Chang YK, Yang W, Zhao M, et al. Association of BANK1 and TNFSF4 with systemic lupus erythematosus in Hong Kong Chinese[J]. Genes Immun,2009,10(5):414-420.

[3] Han JW, Zheng HF, Cui Y, et al. Genome-wide association study in a Chinese Han population identifies nine new susceptibility loci for systemic lupus erythematosus[J]. Nat Genet,2009,41(11):1234-1237.

[4] Jarvinen TM, Hellquist A, Zucchelli M, et al. Replication of GWAS-identified systemic lupus erythematosus susceptibility genes affirms B-cell receptor pathway signalling and strengthens the role of IRF5 in disease susceptibility in a Northern European population[J]. Rheumatology (Oxford),2012,51(1):87-92.

[5] Musone SL, Taylor KE, Lu TT, et al. Multiple polymorphisms in the TNFAIP3 region are independently associated with systemic lupus erythematosus[J]. Nat Genet,2008,40(9):1062-1064.

[6] Harley JB, Alarcon-Riquelme ME, Criswell LA, et al. Genome-wide association scan in women with systemic lupus erythematosus identifies susceptibility variants in ITGAM, PXK, KIAA1542 and other loci[J]. Nat Genet,2008,40(2):204-210.

[7] Zhou XJ, Lu XL, Nath SK, et al. Gene-gene interaction of BLK, TNFSF4, TRAF1, TNFAIP3, and REL in systemic lupus erythematosus[J]. Arthritis Rheum,2012,64(1):222-231.

[8] Cordell HJ. Detecting gene-gene interactions that underlie human diseases[J]. Nat Rev Genet,2009,10(6):392-404.

[9] Lee DK, Nguyen T, Lynch KR, et al. Discovery and mapping of ten novel G protein-coupled receptor genes[J]. Gene,2001,275(1):83-91.

[10] Yang W, Shen N, Ye DQ, et al. Genome-wide association study in Asian populations identifies variants in ETS1 and WDFY4 associated with systemic lupus erythematosus[J]. PLoS Genet,2010,6(2):e1000841.

[11] Dittmer J. The biology of the Ets1 proto-oncogene[J]. Mol Cancer,2003,2:29.

[12] Talal N. Natural history of murine lupus. Modulation by sex hormones[J]. Arthritis Rheum,1978,21(5 Suppl):S58-63.

[13] Kiselyov K, Shin DM, Muallem S. Signalling specificity in GPCR-dependent Ca2+ signalling[J]. Cell Signal,2003,15(3):243-253.

[14] Nagaleekar VK, Diehl SA, Juncadella I, et al. IP3 receptor-mediated Ca2+ release in naive CD4 T cells dictates their cytokine program[J]. J Immunol,2008,181(12):8315-8322.

[15] Wong CK, Ho CY, Li EK, et al. Elevation of proinflammatory cytokine (IL-18, IL-17, IL-12) and Th2 cytokine (IL-4) concentrations in patients with systemic lupus erythematosus[J]. Lupus,2000,9(8):589-593.

[16] Wong CK, Lit LC, Tam LS, et al. Hyperproduction of IL-23 and IL-17 in patients with systemic lupus erythematosus: implications for Th17-mediated inflammation in auto-immunity[J]. Clin Immunol,2008,127(3):385-393.

[17] Doreau A, Belot A, Bastid J, et al. Interleukin 17 acts in synergy with B cell-activating factor to influence B cell biology and the pathophysiology of systemic lupus erythematosus[J]. Nat Immunol,2009,10(7):778-785.

[18] Crispin JC, Oukka M, Bayliss G, et al. Expanded double negative T cells in patients with systemic lupus erythematosus produce IL-17 and infiltrate the kidneys[J]. J Immunol,2008,181(12):8761-8766.

(收稿：2017-04-17 修回：2017-06-24)

InteractionsbetweenGPR78andETS1geneassociatewithsystemiclupuserythematosus

HOUJunsheng1,ZHANGXuejun2,3,4.

1.DepartmentofDermatology,NanjingLishuiPeople'sHospital,Nanjing211200,China; 2.DepartmentofDermatology,TheFirstAffiliatedHospital,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China; 3.InstituteofDermatology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China; 4.KeyLaboratoryofDermatology,MinistryofEducation,Hefei230032,China

ZHANGXuejun,E-mail:ayzxj@vip.sina.com

Objective: To determine the potential effects of the interaction of GPR78 (rs3103074) and ETS1 (rs6590330) on systemic lupus erythematosus (SLE).Methods: Based on our previous GWAS of SLE, GPR78 (SNP rs3103074) and ETS1 (SNP rs6590330) (maybe have an interaction in the pathogenesis of SLE) were chosen. In total, 4199 patients and 8255 controls from Chinese Han population were genotyped for GPR78 rs3103074 and ETS1 rs6590330. Pair-wise interactions between SNPs were evaluated from likelihood ratio tests utilizing logistic regression models.Results: A significant interactive effect between GPR78 rs3103074 and ETS1 rs6590330 on SLE susceptibility (Pcombined=1.4×10-4,OR=1.27) was found through logistic regression analysis. GPR78 rs3103074 was suggestive of SNP, showed medium association with SLE (Pcombined=6.2×10-4,OR=1.22, 95%CI:1.12-1.32) through single SNP association analyses.Conclusion: There is a significant interaction between gene GPR78 and ETS1, which may play a role in the pathogenesis of SLE.

SLE; ETS1; GPR78; interaction

1南京市溧水區(qū)人民醫(yī)院皮膚科，江蘇南京，211200 2安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科，安徽合肥，230032 3安徽醫(yī)科大學(xué)皮膚病研究所，安徽合肥，230032 4皮膚病學(xué)教育部重點實驗室，安徽合肥，230032

張學(xué)軍，E-mail：ayzxj@vip.sina.com