楊維華， 張清芬， 王 剛， 周敬群△

(1三峽大學(xué)附屬仁和醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北 宜昌 443001； 2武漢大學(xué)中南醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北 武漢 430000)

藏紅花素促進(jìn)頸動(dòng)脈損傷小鼠體內(nèi)EPCs動(dòng)員及損傷血管的再內(nèi)皮化*

楊維華1， 張清芬1， 王 剛2， 周敬群1△

(1三峽大學(xué)附屬仁和醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北 宜昌 443001；2武漢大學(xué)中南醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北 武漢 430000)

目的： 研究藏紅花素對(duì)頸動(dòng)脈損傷小鼠外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells, EPCs)動(dòng)員的影響及其作用機(jī)制。方法: 利用導(dǎo)絲損傷的方法構(gòu)建C57BL/6小鼠頸動(dòng)脈損傷模型，動(dòng)物分為假手術(shù)組(sham組)、生理鹽水處理模型組(model組)和藏紅花素低、中、高劑量(10、50和100 μmol·kg-1·L-1)處理組。在3 d時(shí)，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組頸動(dòng)脈損傷小鼠體內(nèi)外周血中EPCs動(dòng)員情況；7 d時(shí)，利用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)各組頸動(dòng)脈損傷小鼠外周血血清中促血管修復(fù)因子——血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(stromal-derived factor-1, SDF-1)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor, EGF)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)的含量變化；14 d時(shí)，利用依文思藍(lán)和蘇木精-伊紅染色分別檢測(cè)各組頸動(dòng)脈損傷小鼠損傷血管再內(nèi)皮化和內(nèi)膜增生情況；同時(shí)采用real-time PCR檢測(cè)各組頸動(dòng)脈損傷小鼠損傷段血管中促修復(fù)因子相關(guān)受體——血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR-2)、CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor-4, CXCR4)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(basic fibroblast growth factor receptor, bFGFR)和表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果: 與sham組相比，model組頸動(dòng)脈損傷小鼠外周血中EPCs動(dòng)員量和促血管修復(fù)因子VEGF、SDF-1、bFGF、EGF、MMP-9的含量上升(P<0.05)；損傷血管再內(nèi)皮化面積下降而增生內(nèi)膜面積和增生內(nèi)膜與中層膜面積比顯著升高(P<0.05)；損傷段血管中促修復(fù)因子相關(guān)受體VEGFR-2、CXCR4、bFGFR和EGFR的表達(dá)水平亦上升(P<0.05)。而與model組相比，不同濃度藏紅花素處理組頸動(dòng)脈損傷小鼠外周血中EPCs動(dòng)員量和促血管修復(fù)因子VEGF、SDF-1、bFGF、EGF、MMP-9含量均顯著上升(P<0.05)；損傷血管再內(nèi)皮化面積逐漸上升而增生內(nèi)膜面積和增生內(nèi)膜與中層膜面積比逐漸下降(P<0.05)；損傷段血管中促修復(fù)因子相關(guān)受體基因VEGFR-2、CXCR4、bFGF-R和EGFR的表達(dá)水平隨之逐漸上升(P<0.05)。結(jié)論: 藏紅花素能夠促進(jìn)頸動(dòng)脈損傷小鼠體內(nèi)EPCs細(xì)胞動(dòng)員及損傷血管的再內(nèi)皮化，從而對(duì)損傷血管發(fā)揮修復(fù)作用。

藏紅花素； 內(nèi)皮祖細(xì)胞； 血管損傷； 細(xì)胞動(dòng)員； 再內(nèi)皮化； 血管修復(fù)

經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈成形術(shù)(percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA)是治療冠心病的主要手段之一，但由于PTCA術(shù)中易造成血管內(nèi)皮損傷，從而影響相關(guān)心血管疾病的治愈和康復(fù)率[1]。同時(shí)其它因素所致的血管內(nèi)皮損傷均容易導(dǎo)致粥樣斑塊的形成，是血管損傷性疾病發(fā)生、發(fā)展的重要病理生理基礎(chǔ)[2]。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是一種能夠直接分化成內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，主要來(lái)源于骨髓、外周血等，能夠在血管損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用[3]。

藏紅花素(crocin, Cro)又名番紅花甙，屬于糖苷類，是從傳統(tǒng)中藥藏紅花中提取的主要有效活性成分之一[4]。近來(lái)研究表明藏紅花素具有舒經(jīng)活絡(luò)、通經(jīng)化瘀、散瘀開(kāi)結(jié)、消腫止痛等功效，能夠全面提高人體免疫力，并改善心肌供血，明顯增加冠狀動(dòng)脈的血流量[5]。藏紅花素可用于防治心血管以及衰老相關(guān)疾病，但目前關(guān)于藏紅花素能否促進(jìn)血管內(nèi)皮損傷修復(fù)的研究尚未見(jiàn)。因此，本研究利用導(dǎo)絲損傷C57BL/6小鼠頸動(dòng)脈血管構(gòu)建血管損傷模型，探討藏紅花素通過(guò)促進(jìn)EPCs動(dòng)員對(duì)損傷血管進(jìn)行修復(fù)的機(jī)制。

材料和方法

1主要材料試劑

8周齡的SPF級(jí)健康雄性C57BL/6小鼠100只，購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(鄂)2011-2014]，在本科室實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

藏紅花素購(gòu)自Sigma；FITC標(biāo)記的單克隆兔抗鼠CD34和APC標(biāo)記的單克隆兔抗鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2)流式細(xì)胞術(shù)抗體購(gòu)自美國(guó)B&D公司；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(stromal-derived factor-1，SDF-1)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix me-talloproteinase-9, MMP-9) ELISA試劑盒購(gòu)自北京博奧生物公司；依文思藍(lán)染色液和HE染色液購(gòu)自北京鼎國(guó)生物公司；總RNA提取液、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和real-time PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1頸動(dòng)脈損傷小鼠模型的構(gòu)建 按照參考文獻(xiàn)[6]中方法，利用導(dǎo)絲損傷C57BL/6小鼠頸總動(dòng)脈建立頸動(dòng)脈損傷模型。隨機(jī)選擇80只小鼠以0.3%的戊巴比妥腹腔注射麻醉。手術(shù)打開(kāi)頸右側(cè)動(dòng)脈鞘，在頸總動(dòng)脈近心端和頸內(nèi)動(dòng)脈遠(yuǎn)心端用絲線活結(jié)結(jié)扎阻斷血流，結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，用醫(yī)用彈性導(dǎo)絲經(jīng)頸外動(dòng)脈插入頸總動(dòng)脈，旋轉(zhuǎn)來(lái)回抽送3次，使頸總動(dòng)脈內(nèi)皮剝落。結(jié)扎頸外動(dòng)脈穿刺段，松開(kāi)結(jié)扎活結(jié)使血流恢復(fù)，縫合小鼠頸部切口。術(shù)后隨機(jī)挑選5只頸動(dòng)脈損傷小鼠損傷段血管，切片后HE染色確保損傷段頸總動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞剝落，小鼠頸動(dòng)脈損傷模型構(gòu)建成功。

2.2小鼠分組處理 將構(gòu)建成功的頸動(dòng)脈損傷模型C57BL/6小鼠分成4組，每組20只。第1組每只小鼠尾靜脈注射0.2 mL生理鹽水作為模型(model)組；其它3組分別尾靜脈注射低、中、高劑量(10、50和100 μmol·kg-1·L-1)的藏紅花素(每只0.2 mL)，分別為Cro-LD、Cro-MD和Cro-HD組；同時(shí)提前選擇20只C57BL/6小鼠作為假手術(shù)(sham)組(與模型組小鼠操作相同但不用導(dǎo)絲損傷頸動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞)。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組小鼠中EPCs動(dòng)員情況 各組小鼠連續(xù)處理3 d后，隨機(jī)選取5只，麻醉后手術(shù)經(jīng)心臟取血約1 mL，用D-Hanks液同體積稀釋。加入1.5倍的Percol分離液，1 200×g，離心30 min，取中間細(xì)胞層，再用D-Hanks液洗滌。用M199細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞分別加入FITC標(biāo)記的單克隆抗鼠CD34和APC標(biāo)記的單克隆抗鼠VEGFR-2流式抗體各10 μL，室溫避光孵育20 min后，0.01 mol/L PBS (pH 7.4)洗滌1遍后，經(jīng)BD cantoⅡ流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組小鼠外周血中動(dòng)員的EPCs細(xì)胞(CD34+/VEGFR-2+)含量。

2.4ELISA檢測(cè)各組小鼠血清中促血管修復(fù)因子 各組小鼠在連續(xù)處理7 d后，每組隨機(jī)選擇5只，按照上述方法麻醉，手術(shù)取心臟循環(huán)外周血于1 mL EP管中。不加肝素室溫靜置30 min，3 000×g離心20 min，取血清備用。按照參考文獻(xiàn)[7]方法并分別根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明，檢測(cè)各組頸動(dòng)脈損傷小鼠外周血血清中血管損傷促修復(fù)相關(guān)因子VEGF、SDF-1、EGF、bFGF和MMP-9的含量變化。

2.5小鼠頸動(dòng)脈損傷段血管再內(nèi)皮化和內(nèi)膜增生情況的檢測(cè) 各組小鼠連續(xù)處理14 d時(shí)，隨機(jī)選擇5只。麻醉后經(jīng)過(guò)尾靜脈注射Evans blue 染液(25 mg/kg)。10 min后取小鼠損傷側(cè)頸總動(dòng)脈近頸動(dòng)脈分叉處血管約5 mm。切開(kāi)小鼠頸總動(dòng)脈可見(jiàn)未內(nèi)皮化血管呈藍(lán)色，而再內(nèi)皮化血管不著色。采用Lucia軟件測(cè)量染色血管和總血管面積，計(jì)算各組小鼠頸動(dòng)脈損傷再內(nèi)皮化情況=內(nèi)皮化面積/損傷血管總面積。同時(shí)對(duì)所取血管切片后HE染色，血管HE染色增生內(nèi)膜層為血管內(nèi)皮膜層向管腔中延伸層，外膜層為松散結(jié)締組織層，中膜層為內(nèi)膜和外膜層中間主要為彈性膜層，使用Olympus BX53在固定視野和放大倍數(shù)下拍照和Image-Pro Plus軟件自動(dòng)區(qū)分血管增生內(nèi)膜和中膜層并計(jì)算中膜和新生內(nèi)膜面積，以評(píng)估血管內(nèi)膜增生情況。

2.6Real-time PCR檢測(cè)小鼠頸動(dòng)脈損傷段血管促修復(fù)因子相關(guān)受體mRNA的表達(dá) 各組小鼠在連續(xù)處理14 d時(shí)，每組隨機(jī)挑選5只。麻醉后處死，取頸動(dòng)脈損傷段血管于勻漿器內(nèi)研磨均勻，并加入1 mL的總RNA提取試劑提取各組小鼠損傷段血管的總RNA。每組取500 ng的總RNA按照逆轉(zhuǎn)錄方法反轉(zhuǎn)得到cDNA模板。分別根據(jù)小鼠促血管修復(fù)因子VEGF的受體VEGFR-2、SDF-1的受體CXCR4、EGF的受體EGFR、bFGF的受體bFGFR及內(nèi)參照GAPDH的cDNA序列設(shè)計(jì)real-time PCR引物(由上海生工公司合成，具體序列見(jiàn)表1)。利用Bio-Rad的IQ5實(shí)時(shí)熒光定量RCR系統(tǒng)檢測(cè)各組小鼠頸動(dòng)脈損傷段血管中促血管修復(fù)因子相關(guān)受體VEGFR-2、CXCR4、EGFR和bFGFR mRNA的表達(dá)情況。

表1 促血管修復(fù)因子相關(guān)受體的real-time PCR引物序列

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。所有數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性分析后，多組間比較采用單因素方差(one-way ANOVA)分析，組間均數(shù)間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1藏紅花素促進(jìn)頸動(dòng)脈損傷小鼠體內(nèi)EPCs動(dòng)員

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)藏紅花素可以顯著促進(jìn)頸動(dòng)脈損傷小鼠體內(nèi)外周血中EPCs動(dòng)員，結(jié)果見(jiàn)圖1。各組小鼠外周血中動(dòng)員的EPCs能夠經(jīng)CD34和VEGFR-2共同標(biāo)記，而經(jīng)藏紅花素處理組小鼠外周血中標(biāo)記的EPCs動(dòng)員量逐漸上升。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，與sham組相比，model組頸動(dòng)脈損傷小鼠生理鹽水處理后外周血中EPCs動(dòng)員量有所上升(P<0.05)；而與model組相比，經(jīng)不同濃度藏紅花素處理組頸動(dòng)脈損傷小鼠外周血中動(dòng)員的EPCs含量均上升更顯著(P<0.05)。

Figure 1. The effect of crocin on EPCs mobilization in peripheral blood of mice with carotid artery injury. Mean±SD.n=5.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group.

圖1藏紅花素對(duì)頸動(dòng)脈損傷小鼠體內(nèi)外周血中EPCs動(dòng)員的影響

2藏紅花素促進(jìn)頸動(dòng)脈損傷小鼠血清中促血管修復(fù)因子水平

ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)不同濃度藏紅花素連續(xù)誘導(dǎo)處理7 d后能夠顯著促進(jìn)頸動(dòng)脈損傷小鼠血清中促血管修復(fù)因子VEGF、SDF-1、bFGF和EGF的含量。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，與sham組相比，model組頸動(dòng)脈損傷小鼠血清中VEGF、SDF-1、bFGF和EGF含量均有所上升(P<0.05)；而與model組相比，不同濃度藏紅花素處理的頸動(dòng)脈損傷小鼠血清中VEGF、SDF-1、bFGF和EGF含量逐漸上升，并具有一定濃度依賴效應(yīng)(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2藏紅花素對(duì)頸動(dòng)脈損傷小鼠外周血清中促血管修復(fù)因子含量的影響

Table 2. The effect of crocin on the content of vascular repair factors in peripheral blood of mice with carotid artery injury (ng/L. Mean±SD.n=5)

GroupVEGFSDF-1bFGFEGFMMP-9Sham22±684±894±946±523±6Model55±9*116±10*133±11*98±9*48±9*Cro-LD96±11#146±9#180±12#128±8#97±8#Cro-MD138±10#198±12#235±11#186±9#147±9#Cro-HD189±12#273±16#305±12#212±12#195±12#

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group.

3藏紅花素促進(jìn)頸動(dòng)脈損傷小鼠內(nèi)皮化

通過(guò)伊文思藍(lán)染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠頸動(dòng)脈損傷段再內(nèi)皮化較少，而經(jīng)過(guò)不同濃度藏紅花素處理14 d后，小鼠頸動(dòng)脈損傷段再內(nèi)皮化均逐漸增加。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，與sham組相比，model組小鼠血管再內(nèi)皮化面積顯著下降(P<0.05)；而與model組相比，不同濃度藏紅花素處理組小鼠血管再內(nèi)皮化面積逐漸上升(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

4藏紅花素降低頸動(dòng)脈損傷小鼠內(nèi)膜增生

通過(guò)HE染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)不同濃度的藏紅花素能夠抑制頸動(dòng)脈損傷小鼠損傷段血管內(nèi)膜增生(紅色箭頭標(biāo)示增生內(nèi)膜層)。與sham組相比，model組小鼠頸動(dòng)脈損傷后血管增生內(nèi)膜面積和血管增生內(nèi)膜與中層膜面積比顯著升高(P<0.05)；而與model組相比，不同濃度藏紅花素處理后的小鼠頸動(dòng)脈損傷后血管增生內(nèi)膜面積和血管增生內(nèi)膜與中層膜面積比均逐漸減少(P<0.05),見(jiàn)圖3。

5藏紅花素促進(jìn)頸動(dòng)脈損傷小鼠損傷段血管促修復(fù)因子相關(guān)受體基因的表達(dá)

Real-time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)藏紅花素能夠顯著促進(jìn)頸動(dòng)脈損傷小鼠損傷段血管促修復(fù)因子VEGF的受體VEGFR-2、SDF-1的受體CXCR4、EGF的受體EGFR和bFGF的受體bFGFR表達(dá)水平，見(jiàn)圖4。

Figure 2. The effect of crocin on vascular re-endothelialization in mice with carotid artery injury. Mean±SD.n=5.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group.

圖2藏紅花素對(duì)頸動(dòng)脈損傷小鼠血管再內(nèi)皮化的影響

Figure 3. Effect of crocin on intimal hyperplasia in mice with carotid artery injury. A: HE staining (×200); B: vascular intimal hyperplasia area; C: vascular proliferation intima and media area ratio. Mean±SD.n=5.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group.

圖3藏紅花素對(duì)頸動(dòng)脈損傷小鼠血管內(nèi)膜增生的影響

Figure 4. The effect of crocin on the mRNA expression of vascular repair factor-related receptors in the injured segments of carotid artery in mice. Mean±SD.n=5.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group.

圖4藏紅花素對(duì)頸動(dòng)脈損傷小鼠損傷段血管中促修復(fù)因子相關(guān)受體mRNA表達(dá)的影響

經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)，與sham組相比，model組小鼠頸動(dòng)脈損傷后損傷段血管中VEGFR-2、CXCR4、EGFR和bFGFR mRNA的表達(dá)水平均上升(P<0.05)；而與model組相比，不同濃度藏紅花素處理后的小鼠頸動(dòng)脈損傷段血管中VEGFR-2、CXCR4、EGFR和bFGFR mRNA的表達(dá)水平均顯著上升(P<0.05)。

討 論

血管損傷性疾病如動(dòng)脈粥樣硬化等容易導(dǎo)致心力衰竭、肢體壞死、癱瘓等后果，是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病[8]。同時(shí)臨床上廣泛開(kāi)展PTCA治療冠心病，往往由于手術(shù)對(duì)血管內(nèi)皮的損傷，容易發(fā)生冠狀動(dòng)脈再狹窄現(xiàn)象，影響心血管疾病治療成功和康復(fù)率[9]。因此，如何促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)和再生是治療血管損傷疾病的關(guān)鍵。研究表明[10]，當(dāng)機(jī)體血管發(fā)生損傷時(shí)，可通過(guò)藥物刺激，使EPCs從骨髓動(dòng)員到外周血中，并循環(huán)至血管損傷區(qū)域分化成內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)損傷血管進(jìn)行修復(fù)[11]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)促進(jìn)EPCs動(dòng)員并加快其從骨髓進(jìn)入體循環(huán)到達(dá)損傷部位分化成內(nèi)皮細(xì)胞，能夠利于抑制損傷血管的內(nèi)膜增生、血栓形成，并降低血管再狹窄率[12]。藏紅花素是少見(jiàn)的水溶性的類胡蘿卜素，是傳統(tǒng)藏藥藏紅花的主要色素成分，具有多種活性作用[13]。研究表明藏紅花素除了抗腫瘤外，還發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，其主要藥理作用包括抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧化、抗炎癥等[14]。藏紅花素因其較好的水溶性和兼具的抗腫瘤、促進(jìn)細(xì)胞保護(hù)的作用，成為研究最廣、最具應(yīng)用前景的新藥物之一。最新研究揭示藏紅花素能夠促進(jìn)骨髓造血干細(xì)胞集落形成，但關(guān)于其能否促進(jìn)骨髓中EPCs動(dòng)員，發(fā)揮血管損傷修復(fù)作用尚未知[15]。本研究中采用導(dǎo)絲損傷C57BL/6小鼠頸動(dòng)脈構(gòu)建血管損傷模型，利用不同濃度藏紅花素誘導(dǎo)處理后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)藏紅花素處理組小鼠外周血中CD34+和VEGFR+的EPCs動(dòng)員量均顯著增加，并具有一定濃度效應(yīng)，直接說(shuō)明藏紅花素能夠促進(jìn)頸動(dòng)脈損傷小鼠體內(nèi)EPCs從骨髓動(dòng)員至外周血。

為進(jìn)一步揭示藏紅花素能否發(fā)揮促進(jìn)頸動(dòng)脈損傷小鼠血管修復(fù)作用，本研究利用依文思藍(lán)染色法對(duì)藏紅花素誘導(dǎo)處理后的頸動(dòng)脈損傷端血管，直接觀察血管內(nèi)皮化修復(fù)情況。研究中發(fā)現(xiàn)藏紅花素能夠顯著增加損傷段頸動(dòng)脈血管的再內(nèi)皮化面積，說(shuō)明藏紅花素對(duì)損傷血管再內(nèi)皮化修復(fù)具有積極作用。臨床開(kāi)展PTCA時(shí)，血管內(nèi)支架植入及球囊擴(kuò)張時(shí)會(huì)對(duì)血管內(nèi)皮造成剝落損傷，而血管內(nèi)皮損傷后容易發(fā)生增生性再狹窄現(xiàn)象[16]。而相關(guān)研究證實(shí)，損傷血管的再內(nèi)皮化能夠抑制血管中膜平滑肌增殖造成的內(nèi)膜增生情況[17]。本研究中不同濃度藏紅花素誘導(dǎo)處理頸動(dòng)脈損傷小鼠后取出血管HE染色，檢測(cè)新生內(nèi)膜面積、新生內(nèi)膜與中膜層相對(duì)面積比來(lái)評(píng)價(jià)損傷血管內(nèi)膜增生及修復(fù)情況。結(jié)果顯示藏紅花素處理組小鼠損傷段頸動(dòng)脈血管新生內(nèi)膜面積和內(nèi)中膜面積比均逐漸降低，說(shuō)明藏紅花素能夠有效抑制內(nèi)皮損傷血管的內(nèi)膜增生，并可能通過(guò)促進(jìn)EPCs動(dòng)員對(duì)血管損傷修復(fù)以維持血管功能。

但藏紅花素是如何促進(jìn)EPCs動(dòng)員發(fā)揮修復(fù)血管作用的呢？有研究表明SDF-1、bFGF、EGF、VEGF等細(xì)胞因子參與到血管的損傷修復(fù)中，它們通過(guò)促進(jìn)EPCs細(xì)胞增殖、遷移、黏附至血管損傷處而誘導(dǎo)血管新生和修復(fù)[18]。VEGF是目前所知的最強(qiáng)的誘導(dǎo)血管損傷修復(fù)和血管生成因子，同時(shí)SDF-1、bFGF、EGF等因子均能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮中VEGF的生成，并具有協(xié)同作用，在EPCs動(dòng)員、分化中發(fā)揮作用[19]。MMP-9是作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞基質(zhì)的主要膠原蛋白酶，研究認(rèn)為其在血管細(xì)胞的增殖和遷移中發(fā)揮作用，同時(shí)可通過(guò)EPCs動(dòng)員促進(jìn)血管新生和損傷修復(fù)[20]。本研究中利用ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)不同濃度藏紅花素能夠顯著促進(jìn)各組頸動(dòng)脈損傷小鼠血清中VEGF、SDF-1、bFGF、EGF和MMP-9等促血管修復(fù)因子的含量并具有濃度效應(yīng)，說(shuō)明藏紅花素可通過(guò)促進(jìn)外周血中VEGF、SDF-1、bFGE、EGF和MMP-9水平而發(fā)揮刺激EPCs動(dòng)員修復(fù)損傷血管的作用。一般細(xì)胞因子在體內(nèi)可通過(guò)旁分泌、自分泌或內(nèi)分泌等方法發(fā)揮作用，本研究中經(jīng)藏紅花素處理后的頸動(dòng)脈損傷小鼠外周血中VEGF、SDF-1、bFGF、EGF和MMP-9水平顯著上升，其可能來(lái)自損傷血管的自分泌，也可能來(lái)自其它受刺激細(xì)胞的旁分泌，但這些血管損傷促修復(fù)因子的具體來(lái)源需要進(jìn)一步驗(yàn)證分析。為了探究頸動(dòng)脈損傷小鼠外周血血清中VEGF、SDF-1、bFGF、EGF和MMP-9等促血管修復(fù)因子如何發(fā)揮作用，本研究同時(shí)檢測(cè)了各組小鼠損傷段血管促修復(fù)因子相關(guān)受體VEGFR-2、CXCR4、bFGFR和EGFR mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在不同濃度藏紅花素作用下，受體基因表達(dá)水平均隨之顯著上升，說(shuō)明頸動(dòng)脈損傷小鼠外周血中增加的VEGF、SDF-1、bFGF、EGF等因子可能循環(huán)至損傷血管處與其受體結(jié)合發(fā)揮作用。但關(guān)于藏紅花素具體對(duì)損傷血管發(fā)揮修復(fù)作用的分子機(jī)制和信號(hào)通路有必要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)中藥藏紅花中有效成分藏紅花素能夠通過(guò)增加VEGF、SDF-1、bFGF、EGF和MMP-9等促血管修復(fù)因子水平，促進(jìn)EPCs動(dòng)員和血管再內(nèi)皮化作用，進(jìn)而對(duì)損傷血管進(jìn)行修復(fù)。本研究對(duì)于臨床防治血管內(nèi)皮損傷性心血管疾病具有重要指導(dǎo)價(jià)值。

[1] Gori T, Münzel T. Endothelial dysfunction after stenting and scaffolding of coronary arteries[J]. Clin Hemorheol Microcirc, 2014, 58(1):175-181.

[2] 萬(wàn) 強(qiáng)， 楊玉萍， 劉中勇. 丹參酮ⅡA通過(guò)抑制p38 MAPK通路減輕PM2.5對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2016, 32(4):597-601.

[3] 崔 斌， 黃 嵐， 武曉靜， 等. 內(nèi)皮祖細(xì)胞移植對(duì)血管內(nèi)膜修復(fù)的影響[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2007, 23(4):625-628.

[4] 楊武韜. 中藥藏紅花的鑒別方法及有效成分的藥理作用[J]. 中國(guó)醫(yī)藥指南, 2014, 12(25):302-303.

[5] 吳 揚(yáng)， 潘瑞蓉， 王玉琴. 藏紅花素對(duì)大鼠缺氧心肌的保護(hù)作用及其機(jī)制研究[J]. 中國(guó)循環(huán)雜志, 2011, 26(1):61-64.

[6] 代文靜， 張 軍， 周敬群， 等. 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α 在小鼠頸動(dòng)脈損傷血管修復(fù)中的作用[J]. 中國(guó)循環(huán)雜志, 2015, 30(4):384-389.

[7] 常鵬宇， 崔 爽， 姜 新， 等. 脂肪干細(xì)胞修復(fù)輻射誘導(dǎo)的腸血管損傷研究[J]. 中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志, 2014, 34(9):652-657.

[8] Riegler J, Liew A, Hynes SO, et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticle targeting of MSCs in vascular injury[J]. Biomaterials, 2013, 34(8):1987-1994.

[9] Moon HE, Byun K, Park HW, et al. COMP-Ang1 potentiates EPC treatment of ischemic brain injury by enhancing angiogenesis through activating AKT-mTOR pathway and promoting vascular migration through activating Tie2-FAK pathway[J]. Exp Neurobiol, 2015, 24(1):55-70.

[10] Ke X, Shu XR, Wu F, et al. Overexpression of the β2AR gene improves function and re-endothelialization capacity of EPCs after arterial injury in nude mice[J]. Stem Cell Res Ther, 2016, 7(1):1-9.

[11] Li X, Chen C, Wei L, et al. Exosomes derived from endothelial progenitor cells attenuate vascular repair and accelerate reendothelialization by enhancing endothelial function[J]. Cytotherapy, 2016, 18(2):253-262.

[12] Lacquaniti A, Giardina M, Lucisano S, et al. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) and endothelial progenitor cells (EPCs) evaluation in aortic aneurysm repair[J]. Curr Vasc Pharmacol, 2013, 11(6):1001-1010.

[13] 吳 揚(yáng)， 潘瑞蓉， 耿 鵬. 藏紅花素抗心肌細(xì)胞低氧損傷作用及其機(jī)制研究[J]. 中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志, 2010, 26(4):453-457.

[14] 潘瑞蓉， 吳 揚(yáng)， 耿 鵬， 等. 藏紅花素對(duì)大鼠心肌細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用[J]. 江蘇大學(xué)學(xué)報(bào): 醫(yī)學(xué)版, 2011, 21(2):131-134.

[15] 丁雯雯. 藏紅花素對(duì)骨髓造血干/祖細(xì)胞集落形成的影響[D]. 青島: 青島大學(xué), 2013.

[16] King TF, McDermott JH. Endothelial progenitor cells and cardiovascular disease[J]. J Stem Cell, 2014, 9(2):93-99.

[17] Bakogiannis C, Tousoulis D, Androulakis E, et al. Circulating endothelial progenitor cells as biomarkers for prediction of cardiovascular outcomes[J]. Curr Med Chem, 2012, 19(16):2597-2604.

[18] Karazizi C, Onerup A, Larsson P, et al. The effect of exercise on angiogenic factors in the healthy mouse heart: a short report[J]. Exp Clin Cardiol, 2014, 20(1):2332-2341.

[19] Paczkowska E, Go b-Janowska M, Bajer-Czajkowska A, et al. Increased circulating endothelial progenitor cells in patients with haemorrhagic and ischaemic stroke: the role of endothelin-1[J]. J Neurol Sci, 2013, 325(1-2):90-99.

[20] 李玉明， 李海濤， 王新芳， 等. ISO通過(guò)ADPRC、PI3K-Akt和FOXO3a上調(diào)MMP-9促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖與遷移[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2015, 31(10):1801-1802.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Crocin promotes mobilization of EPCs and re-endothelialization of damaged blood vessels in mice with carotid artery injury

YANG Wei-hua1, ZHANG Qing-fen1, WANG Wang2, ZHOU Jing-qun1

(1Department of Cardiology, Affiliated Renhe Hospital of China Three Gorges University, Yichang 443001, China;2Department of Cardiology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430000, China. E-mail: zhoujingqun-1@medmail.com.cn)

AIM: To study the effect of crocin on the mobilization of endothelial progenitor cells (EPCs) in the peripheral blood of the mice with carotid arterial injury and its mechanism.METHODS: The carotid artery injury model of the C57BL/6 mice was established by the method of wire injury. The animals were divided into sham operation group, saline-treated model group， and low dose, medium dose and high dose (10, 50 and 100 μmol·kg-1·L-1， respectively) of crocin treatment groups. The mobilization of the EPCs in peripheral blood of the mice with carotid artery injury was detected by flow cytometry at 3 d. The changes of vascular endothelial growth factor (VEGF), stromal-derived factor-1 (SDF-1), basic fibroblast growth factor (bFGF), epidermal growth factor (EGF) and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) in the peripheral blood of the mice with carotid artery injury were detected by enzyme-linked immunosorbent assay at 7 d. The vascular re-endothelialization and intimal hyperplasia of the mice with carotid artery injury were detected by Evans blue and hematoxylin-eosin staining. At the same time, real-time PCR was used to detect the mRNA expression of vascular repair factor-related receptors， vascular endothelial growth factor receotor-2 (VEGFR-2), CXC chemokine receptor-4 (CXCR4), basic fibroblast growth factor receptor (bFGFR) and epidermal growth factor receptor (EGFR)， in the injured segments of carotid arteries.RESULTS: Compared with sham group, the EPCs mobilization and the content of vascular repair factors VEGF, SDF-1, bFGF, EGF and MMP-9 in peripheral blood were increased in model group (P<0.05). The area of vascular endothelium was decreased， while the area of intimal hyperplasia and the ratio of intimal to medial membrane area were increased significantly (P<0.05). The expression levels of VEGFR-2, CXCR4, bFGFR and EGFR were also increased in the injured segments of carotid arteries (P<0.05). Compared with model group, the EPCs mobilization and the content of vascular repair factors VEGF, SDF-1, bFGF, EGF and MMP-9 in peripheral blood were significantly increased in different concentrations of crocin-treated mice with carotid artery injury (P<0.05). The area of vascular endothelium was gradually increased， while the area of intimal hyperplasia and the ratio of intimal to medial membrane area were gradually decreased (P<0.05). The expression levels of VEGFR-2, CXCR4, bFGFR and EGFR were also gradually increased in the injured segments of cartid arteries (P<0.05).CONCLUSION: Crocin promotes the mobilization of EPCs and the re-endothelialization of damaged blood vessels in the mice with carotid artery injury, thus repairing the injured vasculature.

Crocin; Endothelial progenitor cells; Vascular injury; Cell mobilization; Re-endothelialization; Vascular repair

1000- 4718(2017)09- 1574- 07

2016- 10- 19 [

] 2017- 05- 02

湖北省教育廳自然科學(xué)研究計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(No. D20091308)

R285.5; R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.006

△通訊作者 Tel: 0717-6555530; E-mail： zhoujingqun-1@medmail.com.cn