王阿磊， 丁 菁， 王凌霄， 張 倩， 黃 華， 姜君財(cái)， 陸德琴

(貴州醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室，貴州 貴陽 550025)

AngⅡ/AT1R通路通過激活人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞PP2A導(dǎo)致eNOS Ser1177磷酸化水平下調(diào)*

王阿磊， 丁 菁， 王凌霄， 張 倩， 黃 華， 姜君財(cái)， 陸德琴△

(貴州醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室，貴州 貴陽 550025)

血管緊張素Ⅱ; 血管緊張素Ⅱ1型受體; 蛋白磷酸酶2A; 內(nèi)皮型一氧化氮合酶; 磷酸化

諸多研究表明，腎素-血管緊張素系統(tǒng)(rennin-angiotensin system，RAS)的激活與高血壓、心血管結(jié)構(gòu)重塑、動(dòng)脈粥樣硬化等密切相關(guān)[1-2]。血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)作為RAS的主要遞質(zhì)，通過作用于其特異性血管緊張素Ⅱ1型受體(angiotensin II type 1 receptor，AT1R)可以導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙(vascular endothelial dysfunction，VED)。而VED發(fā)生時(shí)，內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)活性降低，一氧化氮(nitric oxide，NO)合成減少[3]。目前已公認(rèn)，eNOS/NO功能障礙是VED的重要表現(xiàn)之一。因此，eNOS/NO常被作為反映血管內(nèi)皮功能的一個(gè)重要指標(biāo)。蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)是一種絲/蘇氨酸殘基蛋白磷酸酶，其通過可逆性的磷酸化使已經(jīng)磷酸化的蛋白質(zhì)去磷酸化，從而在多種生物學(xué)事件中起著負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用[4]。有文獻(xiàn)報(bào)道PP2A是使磷酸化eNOS (Ser1177)去磷酸化的主要蛋白磷酸酶[5-6]。本課題組在前期雙腎單夾腎血管性高血壓大鼠的研究中也曾發(fā)現(xiàn)，腎血管性高血壓大鼠血清AngⅡ水平升高， PP2A活性增強(qiáng)， eNOS Ser1177磷酸化水平下降， eNOS/NO功能障礙。但是關(guān)于AngⅡ/AT1R通路激活血管內(nèi)皮PP2A的分子機(jī)制目前尚不清楚。因此，本研究以體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，應(yīng)用AngⅡ刺激，并給予AT1R特異性阻斷劑坎地沙坦(candesartan，CAN)進(jìn)行干預(yù)，初步探討AngⅡ/AT1R通路激活PP2A的可能分子機(jī)制，為臨床防治內(nèi)皮功能障礙相關(guān)性心腦血管疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

2主要方法

2.1HUVECs細(xì)胞的培養(yǎng) 在超凈工作臺(tái)中將HUVECs接種于培養(yǎng)瓶中，用含有10% FBS的高糖培養(yǎng)基在CO2孵育箱中培養(yǎng)，每隔2 d更換1次培養(yǎng)基以維持細(xì)胞良好的生長狀態(tài)，待細(xì)胞生長融合至70%～90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞傳代，待細(xì)胞生長到約70%融合時(shí)，用含1% FBS的高糖培養(yǎng)基靜止培養(yǎng)12 h，使細(xì)胞達(dá)到同步化后分組用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)用傳15代以內(nèi)的細(xì)胞。

2.2細(xì)胞鑒定 在6孔板中進(jìn)行細(xì)胞爬片后，待細(xì)胞融合至40%～50%時(shí)，用含1% FBS的高糖培養(yǎng)基靜止12 h，PBS洗3次，用4%多聚甲醛固定，用兔抗人VIII因子相關(guān)抗原抗體和兔抗人CD34抗體作為I抗，按1∶100比例稀釋，SABC法進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。PBS孵育作為陰性對(duì)照。鏡下胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒即為陽性細(xì)胞。200倍顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞率(%)=陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

2.3實(shí)驗(yàn)分組 待HUVECs生長融合至70%～80%左右時(shí)，使用含1% FBS的高塘培養(yǎng)基靜止培養(yǎng)12 h。將HUVECs隨機(jī)分為control組、AngⅡ組(AngⅡ終濃度為1×10-7mol/L和1×10-6mol/L，處理12 h)、單純CAN組和CAN+AngⅡ組。其中單純CAN組，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[7-8]采用對(duì)AT1R具有明顯阻斷作用的CAN，終濃度為1×10-6mol/L。CAN+AngⅡ組中CAN的使用濃度同單純CAN組，預(yù)處理3 h，AngⅡ的使用濃度和時(shí)間同AngⅡ組。

2.4Western blot檢測蛋白水平 提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度，余蛋白熱變性后用SDS-PAGE分離，恒流電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5%脫脂牛奶常溫封閉1 h，TBST洗膜，加入相應(yīng)Ⅰ抗4 ℃孵育過夜。第2 d，TBST洗膜，常溫孵育相應(yīng)Ⅱ抗1 h，TBST洗膜，ECL顯影曝光。Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集圖片并分析灰度值，以β-tubulin為內(nèi)參照，結(jié)果以目的條帶和β-tubulin條帶積分吸光度比值表示，以正常對(duì)照組積分吸光度值為100%。以上結(jié)果至少重復(fù)3批獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每批重復(fù)檢測3次。

2.5各組培養(yǎng)基中NO含量檢測 收集培養(yǎng)基后，按照NO檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測樣品中硝酸鹽及亞硝酸鹽的含量，通過比色法在全波長酶標(biāo)儀上測A值。培養(yǎng)基中NO的含量(μmol/L)=(測定A值-空白A值)/(標(biāo)準(zhǔn)品A值-空白A值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(20 μmol/L)×稀釋倍數(shù)(4倍)。

3統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。多組樣本均數(shù)比較進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齊者兩兩比較采用SNK-q法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1細(xì)胞鑒定結(jié)果

免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，VIII因子相關(guān)抗原和CD34表達(dá)陽性的HUVECs細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量棕黃色顆粒，而陰性對(duì)照組HUVECs細(xì)胞質(zhì)內(nèi)未出現(xiàn)棕黃色顆粒。經(jīng)計(jì)算陽性細(xì)胞率為100%，見圖1。

Figure 1. The expression of factor VIII-related antigen and CD34 in the HUVECs (SABC, ×200). A: negative control; B: the positive expression of factor VIII-related antigen; C: negative control; D: the positive expression of CD34.

圖1VIII因子相關(guān)抗原和CD34在HUVECs中的表達(dá)

2CAN預(yù)處理對(duì)AngⅡ刺激HUVECs后eNOS蛋白表達(dá)和eNOSSer1177磷酸化水平的影響

給予 1×10-7mol/L和1×10-6mol/L的AngⅡ分別處理HUVECs 12 h后，與control組比較，AngⅡ組eNOS Ser1177磷酸化水平下調(diào)(P<0.05)；與同一濃度的AngⅡ組比較，CAN預(yù)處理組eNOS Ser1177磷酸化水平上調(diào)(P<0.05)。各組間eNOS蛋白表達(dá)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖2。

3各組培養(yǎng)基中NO的含量

給予1×10-7mol/L和1×10-6mol/L的AngⅡ分別處理HUVECs 12 h后，與control組比較，AngⅡ組培養(yǎng)基中的NO含量減少(P<0.05)；與同一濃度的AngⅡ組比較，CAN預(yù)處理組培養(yǎng)基中的NO含量增加(P<0.05)，見圖3。

4CAN預(yù)處理對(duì)AngⅡ刺激HUVECs后PP2Ac蛋白表達(dá)和PP2AcTyr307磷酸化水平的影響

給予1×10-7mol/L和1×10-6mol/L的AngⅡ分別處理HUVECs 12 h后，與control組比較，AngⅡ組PP2Ac Tyr307磷酸化水平下調(diào)(P<0.05)；與同一濃度的AngⅡ組比較，CAN預(yù)處理組的PP2Ac Tyr307磷酸化水平上調(diào)(P<0.05)。各組間PP2Ac蛋白表達(dá)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖4。

Figure 2. The protein levels of eNOS and p-eNOS (Ser1177) in the HUVECs treated with AngⅡ and/or CAN for 12 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAngⅡ (10-7) group；△P<0.05vsAngⅡ (10-6) group.

圖2CAN預(yù)處理對(duì)AngⅡ刺激HUVECs后eNOS蛋白表達(dá)和eNOSSer1177磷酸化水平的影響

Figure 3. NO content in the culture medium in each group. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAng II (10-7)group;△P<0.05vsAng II (10-6) group.

圖3各組培養(yǎng)基中NO含量的變化

Figure 4. The protein levels of PP2Ac and p-PP2Ac (Tyr307) in the HUVECs treated with AngⅡ and/or CAN for 12 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAngⅡ (10-7) group;△P<0.05vsAngⅡ (10-6) group.

圖4CAN預(yù)處理對(duì)AngⅡ刺激HUVECs后PP2Ac蛋白表達(dá)和PP2AcTyr307磷酸化水平的影響

討 論

本研究中所使用的HUVECs經(jīng)SABC法鑒定為高純度的內(nèi)皮細(xì)胞，該細(xì)胞株已經(jīng)被廣泛用于內(nèi)皮細(xì)胞的相關(guān)研究，因此可用于本研究觀察內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)AngⅡ刺激后eNOS磷酸化和PP2A活性的改變及可能的機(jī)制。

1AngⅡ下調(diào)eNOSSer1177磷酸化水平由AT1R介導(dǎo)

eNOS的活性調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜過程，包括基因轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后水平的調(diào)控。目前已知eNOS Ser1177是eNOS在翻譯后多個(gè)磷酸化調(diào)控位點(diǎn)中非常重要的位點(diǎn)之一，該位點(diǎn)磷酸化可顯著上調(diào)eNOS活性。大量研究已表明，心血管疾病發(fā)病過程中內(nèi)皮依賴的血管舒張功能受損的表現(xiàn)之一為eNOS Ser1177磷酸化水平下調(diào)，eNOS活性降低，NO合成減少[9-11]。特異性AT1R阻斷劑如CAN、洛沙坦等，能減輕高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病所引起的內(nèi)皮功能障礙。有研究報(bào)道AngⅡ可通過作用于AT1R，引起內(nèi)皮細(xì)胞中eNOS Ser1177磷酸化水平下調(diào)，NO合成減少，而eNOS蛋白表達(dá)無明顯變化[12]。而CAN可上調(diào)eNOS蛋白表達(dá)，增加eNOS活性，從而發(fā)揮內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用[13]。但也有研究報(bào)道CAN可上調(diào)eNOS Ser1177磷酸化水平，增強(qiáng)eNOS活性，促進(jìn)NO釋放，但對(duì)eNOS蛋白表達(dá)無明顯影響[8]。本研究對(duì)HUVECs中eNOS蛋白表達(dá)、eNOS Ser1177磷酸化水平和培養(yǎng)基中NO含量進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，AngⅡ處理組eNOS蛋白表達(dá)無明顯變化，eNOS Ser1177磷酸化水平明顯下調(diào)，NO產(chǎn)量減少，CAN預(yù)處理雖未改變eNOS蛋白的表達(dá)水平，但可明顯上調(diào)eNOS Ser1177磷酸化水平。這提示在HUVECs中AngⅡ可通過AT1R介導(dǎo)的信號(hào)通路下調(diào)eNOS Ser1177磷酸化水平，降低eNOS活性，減少NO的合成，AngⅡ和CAN均對(duì)eNOS蛋白表達(dá)水平無明顯影響。

2AngⅡ/AT1R通路激活HUVECs中PP2A可能的分子機(jī)制

Michell等[5]已報(bào)道PP2A能使eNOS的Ser1177位點(diǎn)發(fā)生去磷酸化。本課題組在前期雙腎單夾腎血管性高血壓大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，腎血管性高血壓大鼠血清AngⅡ水平升高，PP2A活性增強(qiáng)，eNOS Ser1177磷酸化水平下降，eNOS/NO功能障礙。那么，在AngⅡ/AT1R通路導(dǎo)致eNOS Ser1177磷酸化水平降低的過程中，PP2A活性增強(qiáng)的分子機(jī)制如何，目前尚未完全闡明。

文獻(xiàn)報(bào)道，神經(jīng)酰胺可激活PP2A，后者調(diào)控eNOS活性，即可以通過去磷酸化蛋白激酶B (Akt)，進(jìn)一步下調(diào)eNOS Ser1177磷酸化水平，也可以直接使磷酸化eNOS (Ser1177)去磷酸化，從而使eNOS活性降低[6]。在全反式維甲酸誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙的研究中發(fā)現(xiàn)，給予PP2Ac亞基 siRNA可降低PP2A活性，導(dǎo)致eNOS Ser1179磷酸化水平上調(diào)[18]，表明PP2A可直接使eNOS Ser1177位點(diǎn)去磷酸化。本實(shí)驗(yàn)所觀察的AngⅡ通過AT1R通路下調(diào)eNOS Ser1177磷酸化水平，是PP2A活性增強(qiáng)后的直接去磷酸化作用，還是通過其它蛋白激酶如Akt的間接作用，還有待進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

AngⅡ/AT1R pathway activates PP2A to down-regulate p-eNOS (Ser1177) in human umbilical vein endothelial cells

WANG A-lei, DING Jing, WANG Ling-xiao, ZHANG Qian, HUANG Hua, JIANG Jun-cai, LU De-qin

(Department of Pathophysiology, Guizhou Medical University, Guiyang 550025, China. E-mail: dqlu91@hotmail.com)

Angiotensin II; Angiotensin II type 1 receptor; Protein phosphatase 2A; Endothelial nitric oxide synthase; Phosphorylation

1000- 4718(2017)09- 1558- 06

2017- 03- 28 [

] 2017- 06- 01

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.31460267)； 貴州省科學(xué)基金資助項(xiàng)目(黔科合LH字[2014]7088)

R363； R543

A

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△通訊作者 Tel: 0851-86910068; E-mail: dqlu91@hotmail.com