戴瑋，付淑軍，常新全，王鵬，郝彧，左臣強(qiáng)，石小娜,何新

[1.中國(guó)中藥公司，北京 100195；2.天津中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，天津 300193；3.天津市創(chuàng)新藥物早期成藥性評(píng)價(jià)企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(籌)，天津 300457；4.瀚盟測(cè)試科技(天津)有限公司，天津 300457；5.天津國(guó)際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院，天津 300457]

·基礎(chǔ)研究·

UPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定比格犬血漿中表兒茶素與4β-(2-氨基乙硫基)表兒茶素△

戴瑋1，付淑軍2，3，4，常新全1，王鵬3，4，5，郝彧2，左臣強(qiáng)5，石小娜4,何新2

[1.中國(guó)中藥公司，北京 100195；2.天津中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，天津 300193；3.天津市創(chuàng)新藥物早期成藥性評(píng)價(jià)企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(籌)，天津 300457；4.瀚盟測(cè)試科技(天津)有限公司，天津 300457；5.天津國(guó)際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院，天津 300457]

目的：建立UPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定比格犬血漿中表兒茶素(EC)與4β-(2-氨基乙硫基)表兒茶素(Cya-EC)的濃度，研究比格犬口服威麥寧膠囊后體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)。方法：血漿樣品經(jīng)鹽酸巰乙胺衍生化處理后，以乙腈-水(0.1%甲酸)為流動(dòng)相梯度洗脫，Waters BEH Shield RP18(100 mm×2.11 mm，1.7 μm)色譜柱分離，采用電噴霧電離源，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式進(jìn)行正離子檢測(cè)，定量分析所用的離子反應(yīng)分別為m/z291.1138.9(EC)、m/z366.1288.9(Cya-EC)和m/z260.2116.3(內(nèi)標(biāo)：普萘洛爾)。結(jié)果：測(cè)定血漿中EC及Cya-EC的線性范圍均為10 ～ 2000 ng·mL-1，日內(nèi)、日間精密度均小于14.82%，準(zhǔn)確度均在±4.86%以內(nèi)；使用DAS3.0藥代動(dòng)力學(xué)軟件對(duì)血藥濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，EC及Cya-EC的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)t1/2分別為66.3和90.4 h，AUC0-∞分別為2 114.7和12 909.5 ng·h·mL-1。結(jié)論：本文建立的UPLC-MS/MS法運(yùn)行時(shí)間短、選擇性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、血漿用量少，適用于比格犬口服威麥寧膠囊后體內(nèi)EC及Cya-EC的藥代動(dòng)力學(xué)研究。

表兒茶素；4β-(2-氨基乙硫基)表兒茶素；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；比格犬血漿；威麥寧膠囊

威麥寧膠囊是由蓼科(Polygonaceae)蕎麥屬(Fagopyrum)多年生草本植物金蕎麥Fagopyrumdibotrys(D.Don)Hara中提取出的抗癌活性物質(zhì)制成的原國(guó)家二類中藥新藥，具有活血化瘀、清熱解毒、祛邪扶正的功效，配合放、化療治療腫瘤有增效、減毒作用，單獨(dú)使用可用于不適宜放、化療的肺癌患者的治療，能夠改善晚期肺癌患者生活質(zhì)量及免疫功能[1]等。威麥寧膠囊的有效成分威麥寧為縮合鞣質(zhì)類化合物，該類化合物以黃烷-3-醇為結(jié)構(gòu)單元通過碳-碳鍵聚合而成，其分子結(jié)構(gòu)受黃烷-3-醇單元的類型、單元之間的連接方式、聚合單元數(shù)量、空間構(gòu)型等因素的影響，差異較大。由于威麥寧組成結(jié)構(gòu)復(fù)雜，目前尚無有效方法對(duì)威麥寧膠囊在生物體內(nèi)的代謝情況進(jìn)行表征評(píng)價(jià)。研究表明，威麥寧經(jīng)巰乙胺硫解后，硫解產(chǎn)物分別為4β-(2-氨基乙硫基)兒茶素、4β-(2-氨基乙硫基)表兒茶素、兒茶素、4β-(2-氨基乙硫基)表兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素、4β-(2-氨基乙硫基)兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯、兒茶素沒食子酸酯，其中主要為4β-(2-氨基乙硫基)表兒茶素，即表兒茶素為威麥寧最主要的結(jié)構(gòu)單元[2]。本研究采用巰乙胺硫解法結(jié)合超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)，建立了同時(shí)測(cè)定比格犬口服威麥寧膠囊后血漿中的4β-(2-氨基乙硫基)表兒茶素和表兒茶素的分析方法，該方法操作簡(jiǎn)便、快速、選擇性強(qiáng)，為威麥寧組分體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究提供方法。

1 材料

1.1 儀器

Waters UPLC-Quattro Premier XE 三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀，含Binary Solvent manager，Sample manager，Quattro Premier XE MS，Masslynx V4.1色譜工作站，ESI和APCI接口離子源；Qilinbeier旋渦混合器；Heraeus multifuge X3R高速冷凍離心機(jī)。

1.2 試劑

表兒茶素(Epicatechin，EC，上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%，批號(hào)：YA0402SC13)；4β-(2-氨基乙硫基)表兒茶素(Cya-EC，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)毒物藥物研究所，純度≥98%)；鹽酸普萘洛爾(Propranolol hydrochloride，Pro，購(gòu)于美國(guó)Sigma Aldrich公司，純度≥99%，批號(hào)：16524AH)；威麥寧膠囊(北京華頤藥業(yè)有限公司，批號(hào)：130401)；鹽酸巰乙胺(美國(guó)Sigma Aldrich公司，純度≥98%，批號(hào)：MKBQ8406V)；甲醇、乙腈和甲酸為色譜純，其他試劑為分析純。

1.3 動(dòng)物

Beagle比格犬，體重9～10 kg，購(gòu)自北京金牧陽(yáng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司?？瞻妆雀袢獫{由天津國(guó)際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院新藥毒理評(píng)價(jià)平臺(tái)提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及質(zhì)譜條件

色譜柱：Waters BEH Shield RP18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：A-水(含0.1%甲酸，V/V)，B-乙腈(含0.1%甲酸，V/V)梯度洗脫。梯度洗脫程序：0～1.0 min，95%～95% A；1.0～4.8 min，90%～84% A；4.8～6.3 min，84%～60% A；6.3～6.5 min，60%～5% A ；6.5～7.5 min，5%～5% A；7.5～7.51 min，5%～95% A ；7.51～10.0 min，95%～95% A。流速：0.3 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

離子源：電噴霧離子源；毛細(xì)管電壓：-3.2 kV；離子源溫度：120 ℃；脫溶劑氣溫度：350 ℃；脫溶劑氣流速：800 L·h-1；錐孔氣流速：50 L·h-1；正離子方式檢測(cè)；掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；EC、Cya-EC和Pro的錐孔電壓(Cone)分別為：22、15、35 V；碰撞能量(Collision)分別為：16、10、18 V；用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m/z291.1138.9(EC)、m/z366.1288.9(Cya-EC)和m/z260.2116.3(Pro)，見圖1。

注：A.EC；B.Cya-EC；C.普萘洛爾。圖1 EC、Cya-EC和普萘洛爾[M+H]+的產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖

2.2 樣品來源

選取健康Beagle比格犬8只(雄性)，體重(9±1.0) kg，實(shí)驗(yàn)前1天禁食12 h以上，不禁水，給予威麥寧膠囊8粒(每粒含威麥寧200 mg)。實(shí)驗(yàn)前抽取空白血，給藥后分別于0、10、20、30 min及1、2、4、6、8、12、24、36、48、60、72、84 h共16個(gè)時(shí)間點(diǎn)取前肢靜脈血1 mL，置于含肝素的離心管中，冰浴中放置，4 ℃下于0.5 h內(nèi)3000 r·min-1離心10 min收集上層血漿，-80℃冰凍保存待測(cè)。

2.3 血漿樣品處理

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)驗(yàn)證

3.1.1 方法的專屬性 分別取6只比格犬的空白血漿50 μL，除不加內(nèi)標(biāo)外，其余按2.3項(xiàng)下操作，進(jìn)樣5 μL，得空白樣品色譜圖2A；將一定濃度的EC標(biāo)準(zhǔn)溶液、Cya-EC標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)普萘洛爾溶液加入空白血漿中，依同法操作，得相應(yīng)色譜圖2B；將一定濃度的威麥寧提取物溶液和內(nèi)標(biāo)普萘洛爾溶液加入空白血漿中，依同法操作，得相應(yīng)色譜圖2C；取比格犬給藥后收集的血漿樣品，依同法操作，得相應(yīng)色譜圖2D。結(jié)果表明，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾EC、Cya-EC和內(nèi)標(biāo)普萘洛爾的測(cè)定。

3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限 取空白血漿50 μL，依次加入EC和Cya-EC的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液10L，配制成相當(dāng)于血漿濃度為10、20、50、100、200、500、1000、2000 ng·mL-1的血漿樣品，按2.3項(xiàng)下操作，取5 μL進(jìn)樣，進(jìn)行LC-MS/MS分析，記錄色譜圖；以待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)，用加權(quán)(W=1/x2)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得的直線回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。典型的回歸方程分別為：EC，Y=0.002 65X-0.006 21，r=0.990；Cya-EC，Y=0.001 79X+0.003 41，r=0.997。測(cè)定EC和Cya-EC的線性范圍均為10 ～ 2000 ng·mL-1。

取空白血漿50 μL，配制成相當(dāng)于EC和Cya-EC血漿濃度均為10 ng·mL-1的樣品，將其進(jìn)行6個(gè)樣本分析，并根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每一樣本測(cè)定濃度，求得該濃度下EC和Cya-EC的日內(nèi)精密度(RSD)分別為12.0%和7.5%；準(zhǔn)確度(RE)分別為-3.8%和-4.6%。該結(jié)果表明LC-MS/MS法測(cè)定血漿中EC和Cya-EC的定量下限均可達(dá)10 ng·mL-1。

3.1.4 回收率與基質(zhì)效應(yīng)考察 取空白血漿50 μL，依次加入EC和Cya-EC的混合QC溶液10L，配制成相當(dāng)于血漿濃度為20、200、1600 ng·mL-1的QC樣品，每個(gè)濃度3個(gè)樣本，進(jìn)行LC-MS/MS分析，得到峰面積A。另取空白血漿50L，置1.5 mL 塑料EP管中，50L鹽酸巰乙胺溶液，渦流混勻后，60 ℃水浴20 min，待反應(yīng)結(jié)束后，加入50L甲醇，渦流混勻，離心10 min(15 000 r·min-1，4℃)，取上清液50L加入EC和Cya-EC的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液3.3L、內(nèi)標(biāo)溶液6.7L和60L甲醇-水(50∶50，V/V)，配制成相應(yīng)濃度，渦流混合，取5L進(jìn)行LC-MS/MS分析，獲得相應(yīng)峰面積B。再另取50L超純水，加入10L標(biāo)準(zhǔn)溶液、20L內(nèi)標(biāo)和50L鹽酸巰乙胺溶液，加入50L甲醇，渦流混勻后，取上清液50L并用50L甲醇-水(50∶50，V/V)稀釋后制備低、中、高3個(gè)濃度的無血漿基質(zhì)樣品，取5L進(jìn)行LC-MS/MS分析，獲得相應(yīng)峰面積C。以峰面積A與峰面積B進(jìn)行比較來評(píng)價(jià)EC、Cya-EC與內(nèi)標(biāo)回收率(R)，計(jì)算公式為R=A/B×100%；以峰面積B與峰面積C進(jìn)行比較來評(píng)價(jià)EC、Cya-EC與內(nèi)標(biāo)基質(zhì)效應(yīng)(M)，計(jì)算公式為M=B/C×100%。

注：A.空白血漿；B.空白血漿中加入EC、Cya-EC(20 ng·mL-1)和Pro(100 ng·mL-1)；C.空白血漿中加入威麥寧提取物(20 g·mL-1)和Pro(100 ng·mL-1)；D.受試動(dòng)物服用威麥寧膠囊后2 h的血漿樣品圖2 測(cè)定血漿中Cya-EC、EC和內(nèi)標(biāo)普萘洛爾的典型MRM色譜圖

EC低、中、高3個(gè)濃度的提取回收率分別為(97.5±6.6)%、(94.4±8.3)% 、(89.5±6.7)%，Cya-EC低、中、高3個(gè)濃度的提取回收率分別為(83.8±7.3)%、(82.5±4.4)%、(88.5±2.4)%。EC、Cya-EC和內(nèi)標(biāo)基質(zhì)效應(yīng)和回收率結(jié)果見表2。

表1 EC、Cya-EC在比格犬血漿中方法學(xué)考察的準(zhǔn)確度、精密度(n=6)

表2 EC、Cya-EC在比格犬血漿中方法學(xué)考察的基質(zhì)效應(yīng)和回收率

3.1.5 穩(wěn)定性考察

3.1.5.1 室溫放置2 h穩(wěn)定性考察 取空白血漿50L，依次加入威麥寧提取物標(biāo)準(zhǔn)系列溶液10L，配制成相當(dāng)于血漿濃度為0.2、2、20g·mL-1的威麥寧血漿樣品，樣品室溫放置2 h后，依據(jù)2.4項(xiàng)下方法制備樣品，室溫放置2 h，每個(gè)濃度進(jìn)行3個(gè)樣本分析，測(cè)定樣品質(zhì)譜響應(yīng)，并與新配制的同濃度威麥寧血漿樣本質(zhì)譜響應(yīng)進(jìn)行比較。結(jié)果表明所有室溫放置2 h試驗(yàn)測(cè)定值與添加值的相對(duì)偏差RE在5.3% 之內(nèi)。即血漿樣品可以在室溫放置2 h，保障了整個(gè)分析過程中的數(shù)據(jù)真實(shí)、可靠。

3.1.5.2 3次冷凍、解凍循環(huán)穩(wěn)定性考察 取空白血漿50L，依次加入威麥寧提取物標(biāo)準(zhǔn)系列溶液10L，配制成相當(dāng)于血漿濃度為0.2、2、20g·mL-1的威麥寧血漿樣品，經(jīng)反復(fù)3次-80 ℃冰凍，室溫溶解后，依據(jù)2.4項(xiàng)下方法制備穩(wěn)定性樣品，每個(gè)濃度進(jìn)行3個(gè)樣本分析，測(cè)定樣品質(zhì)譜響應(yīng)，并與新配制的同濃度威麥寧血漿樣本質(zhì)譜響應(yīng)進(jìn)行比較。結(jié)果表明所有3次凍融試驗(yàn)測(cè)定值與添加值的相對(duì)偏差RE在15%之內(nèi)。即血漿樣品可以進(jìn)行反復(fù)3次凍融，保障了整個(gè)分析過程中的數(shù)據(jù)真實(shí)、可靠。

3.1.5.3 長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察 取空白血漿50L，依次加入威麥寧提取物標(biāo)準(zhǔn)系列溶液10L，配制成相當(dāng)于血漿質(zhì)量濃度為0.2、2、20g·mL-1的威麥寧血漿樣品，-80 ℃冰凍放置兩個(gè)月后，依據(jù)2.4項(xiàng)下方法制備穩(wěn)定性樣品，每個(gè)濃度進(jìn)行3個(gè)樣本分析，測(cè)定樣品質(zhì)譜響應(yīng)，并與新配制的同濃度威麥寧血漿樣本質(zhì)譜響應(yīng)進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，所有長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn)測(cè)定值與添加值的相對(duì)偏差RE在12.3% 之內(nèi)，表明長(zhǎng)期冰凍放置血漿樣品，不影響本方法對(duì)樣品濃度進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定。

3.1.5.4 處理后樣品4 ℃放置24 h穩(wěn)定性考察 取空白血漿50L，按3.1.2項(xiàng)下操作，制備低、中、高3個(gè)濃度的QC樣品(每濃度3個(gè)樣本)，4 ℃放置24 h后進(jìn)行穩(wěn)定性考察，結(jié)果顯示測(cè)定值與添加值的相對(duì)偏差RE在15%之內(nèi)，說明分析測(cè)試過程中的樣品穩(wěn)定。

3.2 藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)

3.2.1 藥時(shí)曲線 比格犬口服威麥寧膠囊后，根據(jù)EC和Cya-EC的血藥濃度及計(jì)算得到的表兒茶素總血藥濃度繪制藥時(shí)曲線。EC、Cya-EC及表兒茶素總濃度的血藥濃度-時(shí)間曲線分別見圖3、4。

圖3 比格犬口服威麥寧膠囊后表兒茶素及表兒茶素巰代物血藥濃度-時(shí)間曲線(n=6)

圖4 比格犬口服威麥寧膠囊后表兒茶素總血藥濃度-時(shí)間曲線(n=6)

3.2.2 藥動(dòng)學(xué)參數(shù) 根據(jù)血漿-藥物濃度數(shù)據(jù)，采用生物利用度研究數(shù)據(jù)處理通用程序(DAS3.0.2)計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，采用梯形法計(jì)算AUC0-t值，以半對(duì)數(shù)作圖法，由消除相的末端4個(gè)濃度點(diǎn)計(jì)算t1/2，Tmax和Cmax采用實(shí)測(cè)值，所得表兒茶素、表兒茶素巰代物及表兒茶素總量的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表3。

4 討論

威麥寧是以中藥金蕎麥中提取得到的鞣質(zhì)部位為原料制成的中成藥制劑，其主要活性成分是縮合鞣質(zhì)。目前有關(guān)鞣質(zhì)的研究多是針對(duì)其結(jié)構(gòu)、含量測(cè)定方法和生物活性等方面[3]，對(duì)其在動(dòng)物體內(nèi)吸收、代謝的研究甚少。程小桂等[4-5]采用HPLC測(cè)定了原花青素B2和表兒茶素的含量，并采用同位素標(biāo)記法研究了原花青素B2在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)；亦有報(bào)道涉及血漿中表兒茶素和兒茶素的含量測(cè)定[6-8]。但威麥寧的活性成分縮合鞣質(zhì)是一類聚合物，無法按常規(guī)方法對(duì)其體內(nèi)行為進(jìn)行定量研究，所以本研究借鑒了劉剛等[2]報(bào)道的鹽酸巰乙胺硫解法對(duì)威麥寧進(jìn)行降解，對(duì)降解產(chǎn)物的主要成分表兒茶素和4β-(2-氨基乙硫基)表兒茶素在體內(nèi)的代謝情況進(jìn)行初步的研究。

表3 比格犬口服威麥寧膠囊后表兒茶素、4β-(2-氨基乙硫基)表兒茶素及表兒茶素總量的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

本研究采用巰乙胺硫解法結(jié)合超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，首次建立了同時(shí)測(cè)定比格犬口服威麥寧膠囊后，血漿中的表兒茶素和4β-(2-氨基乙硫基)表兒茶素的分析方法。在采用鹽酸巰乙胺硫解的過程中，對(duì)鹽酸巰乙胺加入體積、濃度及硫解反應(yīng)溫度、時(shí)間進(jìn)行了考察，最后確定采用50L鹽酸巰乙胺溶液(50 mg·mL-1)、60 ℃水浴20 min的效果最好。在UPLC液相條件優(yōu)化過程中流動(dòng)相采用乙腈-水(含0.1%甲酸)，比使用純甲醇和乙腈分離效果好，進(jìn)一步采用梯度洗脫優(yōu)化分離效果并使峰形良好。因鹽酸巰乙胺溶液配制采用濃鹽酸-甲醇(1∶9)，酸性較強(qiáng)，對(duì)血漿中的蛋白沉淀也有一定作用，故采用了蛋白沉淀的方法對(duì)血漿樣品進(jìn)行前處理，簡(jiǎn)單易行。

在穩(wěn)定性的考察試驗(yàn)中，給藥后的血漿需經(jīng)過鹽酸巰乙胺硫解才能得到4β-(2-氨基乙硫基)表兒茶素，而血漿穩(wěn)定性考察的是比格犬給藥后待測(cè)組分在血漿中的穩(wěn)定性，故只能加入威麥寧提取物，以模擬真實(shí)的血漿去考察待測(cè)物在血漿中的穩(wěn)定性。

[1] 陸海波，姜慧杰，趙長(zhǎng)宏，等.中藥威麥寧改善晚期肺癌患者生活質(zhì)量及免疫功能的作用[J].中國(guó)臨床康復(fù)，2006，10(23)：22-24.

[2] 劉剛，孫磊，喬善義，等.巰乙胺硫解法分析縮合鞣質(zhì)組成單元及硫解產(chǎn)物高效液相色譜行為分析[J].國(guó)際藥學(xué)研究雜志，2013，40(6)：801-806.

[3] 朱玥，金哲雄.鞣質(zhì)類化合物的研究進(jìn)展[J].黑龍江醫(yī)藥，2015，28(10)，23-25.

[4] 程小桂，居文政，戴國(guó)梁，等.HPLC法測(cè)定威麥寧膠囊中原花青素B2 和表兒茶素的含量[J].藥學(xué)與臨床研究，2013，21(1)：39-41.

[5] 程小桂，居文政，戴國(guó)梁，等.威麥寧中原花青素B2藥代動(dòng)力學(xué)及臨床應(yīng)用[J].中國(guó)藥物與臨床，2013，13(2)：192-193.

[6] Selga A，Vinardell M P，Venegas R M，et al.Absorption and Metabolization of Cytoprotective Epicatechin Thio Conjugates in Rats[J].Drug Metabolism Disposition，2010，38(12)：2188-2194.

[7] Yang Ch S，Chen L S，Lee M J，et al.Blood and Urine Levels of Tea Catechins after Ingestion of Different Amounts of Green Tea by Human Volunteers[J].Cancer Epidemiology，Blomarkers & Prevention，1998，7：351-354.

[8] Lee M J，Maliakal P，Chen L S，et al.Pharmacokinetics of Tea Catechins after Ingestion of Green Tea and(-)-Epigallocatechin-3-gallate by Humans：Formation of Different Metabolites and Individual Variability[J].Cancer Epidemiology，Biomarkers & Prevention，2002，11：1025-1032.

SimultaneousDeterminationofEpicatechinand4β-2(aminoethylthio)EpicatechininDogPlasmabyUPLC-MS/MS

DAIWei1，F(xiàn)UShujun，CHANGXinquan1，WANGPeng3，4，5，HAOYu2，ZUOChenqiang5，SHIXiaona4，HEXin2

(1.ChinaNationalTraditionalChineseMedicineCorpo.，Beijing100195，China；2.FacultyofChineseMateriaMedica,TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine，Tainjin300193，China；3.TianjinKeyLaboratoryofearlydrugevaluationofinnovativedrugs，Tianjin300457，China；4.HarmoniaTestandTechnology(Tianjin)Co.，Ltd.，Tianjin300457，China；5.TianjinInternationalJointAcademyofBiomedicine，Tianjin300457，China)

Objective：To establish a sensitive and rapid liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)method to simultaneously determinate epicatechin(EC)and 4β-2(aminoethylthio)epicatechin(Cya-EC)in plasma of beagle dogs after oral administration of WeiMaiNing capsule.Method：Chromatographic separation was achieved on an Waters BEH Shield RP18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)using a step gradient program with the mobile phase of 0.1% formic acid aqueous solution and acetonitrile with 0.1% formic acid，at a flow-rate of 0.30 mLmin-1.Electrospray ionization(ESI)source was applied and operated in the positive ion mode.Multiple reaction monitoring mode with the transitions ofm/z291.1138.9(EC)，m/z366.1288.9(Cya-EC)andm/z260.2116.3(IS，propranolol)was performed to quantify，respectively.Results：The linear concentration ranges of calibration curves for EC and Cya-EC were 10-2000 ng·mL-1.The inter- or intra-day precision(RSD)was less than 14.82%，and the accuracy(RE)was within±4.86%.The pharmacokinetic parameters were calculated by DAS3.0.Thet1/2of EC and Cya-EC were 66.3 and 90.4 h.And the AUC0-∞of EC and Cya-EC were 2 114.7 and 12 909.5 ng·h·mL-1in beagle dog plasma after oral administration of WeiMaiNing capsules.Conclusion：The method was sensitive，rapid，convenient，using less plasma and was proved to be suitable for preclinical pharmacokinetic studies of EC and Cya-EC in beagle dog after oral administration of Wei MaiNing capsules.

Epicatechin；4β-2(aminoethylthio)epicatechin；UPLC-MS/MS；dog plasma

2016-06-30)

中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)新產(chǎn)品開發(fā)基金(2011ZY01)

*

付淑軍，工程師，研究方向：藥物代謝與藥物動(dòng)力學(xué)；Tel：(022)65378888，E-mail：fushujun90@aliyun.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.3.015