李 鵬

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江大慶 163319）

STMN2的表達(dá)對(duì)顆粒細(xì)胞Ras-MAPK信號(hào)通路的影響

李 鵬

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江大慶 163319）

目的：分析STMN2的表達(dá)對(duì)顆粒細(xì)胞Ras-MAPK信號(hào)通路的影響。方法：對(duì)雌性海蘭褐殼蛋雞顆粒細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，使用腺病毒載體將STMN2過表達(dá)載體、STMN2-RNAi載體及空載體轉(zhuǎn)染至顆粒細(xì)胞中，并設(shè)定對(duì)照組，提取轉(zhuǎn)染后顆粒細(xì)胞的總RNA及總蛋白，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blot分別檢測(cè)Ras-MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵因子erk1、erk2、ras、elk-1、p-erk1、p-erk2的mRNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與空載體組和對(duì)照組相比，STMN2過表達(dá)組中erk1、erk2和ras mRNA表達(dá)水平均極顯著增加（p＜0.01），elk-1 mRNA表達(dá)水平差異顯著（p＜0.05）。STMN2低表達(dá)組中erk1、elk-1 mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組和空載體組，且差異極顯著（p＜0.01），ras和erk2 mRNA表達(dá)水平差異顯著（p＜0.05），過表達(dá)組中，erk1、erk2、p-erk1、p-erk2和ras蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組和空載體組，且差異極顯著（P＜0.01），elk-1蛋白表達(dá)水平差異不顯著。STMN2低表達(dá)組中erk1、erk2、p-erk1、p-erk2，elk-1、ras蛋白表達(dá)低于對(duì)照組和空載體組，且差異顯著（p＜0.05）。結(jié)論STMN2具有促進(jìn)Ras-MAPK信號(hào)途徑中各關(guān)鍵因子表達(dá)的作用，進(jìn)一步促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞增殖。

STMN2 顆粒細(xì)胞 Ras-MAPK

有研究人員經(jīng)過研究后發(fā)現(xiàn)，顆粒細(xì)胞在多種動(dòng)物卵泡發(fā)育的過程中均發(fā)揮重要的促進(jìn)和調(diào)節(jié)作用，所以很多研究人員也就對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育與顆粒細(xì)胞之間的關(guān)系進(jìn)行了更多的深入研究，有研究人員發(fā)現(xiàn)Stathmin家族蛋白在促卵母細(xì)胞成熟方面具有重要的介導(dǎo)作用，而STMN2即為其中之一，STMN2蛋白具有高度的保守性，但其與細(xì)胞周期的調(diào)控顯示出密切的關(guān)系，其通過磷酸化和去磷酸化對(duì)細(xì)胞的有絲分裂進(jìn)行調(diào)控[2，3]。有研究人員發(fā)現(xiàn)，當(dāng)顆粒細(xì)胞中STMN2蛋白的表達(dá)量有所升高后，會(huì)促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖，并且會(huì)對(duì)卵泡的發(fā)育發(fā)揮促進(jìn)作用，而對(duì)細(xì)胞的增殖發(fā)揮重要調(diào)控作用的即為Ras-MAPK信號(hào)通路，為若STMN2在顆粒細(xì)胞中高度表達(dá)，可能會(huì)促進(jìn)顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育從而進(jìn)一步促進(jìn)卵泡的發(fā)育[4，5]。本研究對(duì)STMN2的表達(dá)對(duì)Ras-MAPK信號(hào)通路的影響進(jìn)行研究，以探索和闡述卵泡發(fā)育的機(jī)理，為闡明卵泡發(fā)育與顆粒細(xì)胞的關(guān)系提供研究基礎(chǔ)和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（由長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司生產(chǎn)）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（由GS Laboratory Equipment公司生產(chǎn)）；BHC-1360ⅡA/ B3型生物安全柜（由北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司生產(chǎn)）；紫外分光光度計(jì)（由北京普西通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)）；生物安全柜（由蘇州蘇凈安泰有限公司生產(chǎn)）；SmartSpecTMPlus核酸蛋白測(cè)定儀（由美國(guó)Bio-rad公司生產(chǎn)）。

1.1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒（由北京博凌科為生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）；熒光定量PCR試劑盒（由北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）；SDS-PAGE 凝膠電游試劑盒（由上海生工生物有限公司生產(chǎn)）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（由Thermo scientific公司生產(chǎn)）；培養(yǎng)液（Hyclone M199）（賽默飛世爾科技公司）；胎牛血清（由浙江碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）；Rabbit Anti-CDKN1A antibody、Rabbit Anti-ERK1 + ERK2 antibody、Rabbit Anti-phospho-ERK1 + 2（Thr183/185）antibody、Rabbit Anti-ELK-1 antibody；HRP標(biāo)記羊抗兔二抗（由美國(guó)Bioworld公司生產(chǎn)）；STMN2過表達(dá)腺病毒載體（由漢恒生物有限公司構(gòu)建）；STMN2-RNAi腺病毒載體（由上海生工生物有限公司構(gòu)建）；腺病毒空載體（由漢恒生物有限公司提供）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由黑龍江大慶某養(yǎng)雞場(chǎng)提供，為健康的海蘭褐殼蛋雞，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均為8月齡的雌雞，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共5只。

1.2 方法

1.2.1 蛋雞卵泡顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)

對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行頸靜脈放血致死，取卵巢后觀察卵泡形態(tài)和級(jí)別，選取選F1級(jí)卵泡進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，參考Gillbert等人[6]采取的顆粒細(xì)胞層剝離方法對(duì)卵泡顆粒細(xì)胞膜進(jìn)行剝離。然后放置于0.75% NaCl溶液中進(jìn)行清洗，用眼科手術(shù)剪將顆粒細(xì)胞膜充分的剪碎。將碎塊加入到15 ml離心管中，并加入終濃度為12.5 μg/ml的Ⅰ型膠原酶，將離心管放置在37 ℃培養(yǎng)箱中5 min對(duì)顆粒細(xì)胞層進(jìn)行消化。使用200目濾網(wǎng)對(duì)消化后的溶液進(jìn)行過濾，將濾液加入到新的15 ml離心管中，放入臺(tái)式離心機(jī)后以1000 g的離心力離心8 min，將上清液吸棄后，加入0.75% Nacl溶液再清洗3次，然后加入適量細(xì)胞培養(yǎng)基震蕩重懸，將重懸后的溶液加入至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 腺病毒轉(zhuǎn)染蛋雞卵泡顆粒細(xì)胞

將狀態(tài)良好的顆粒細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，然后接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔中加入1 ml的細(xì)胞懸液，將6孔細(xì)胞培養(yǎng)板放置于5%的CO2，37 ℃恒溫的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。48 h后使用顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，將6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞更換無血清培養(yǎng)液，以感染復(fù)數(shù)值（MOI）350 pfu/cell轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的蛋雞卵泡顆粒細(xì)胞。于轉(zhuǎn)染48 h后，在熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況及腺病毒轉(zhuǎn)染情況。

實(shí)驗(yàn)分為五組，分別為對(duì)照組、過表達(dá)空載體組、RNAi空載體組、STMN2過表達(dá)組，STMN2-RNAi組。

1.2.3 熒光定量PCR檢測(cè)Ras-MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵因子mRNA表達(dá)

使用RNA提取試劑盒提取腺病毒轉(zhuǎn)染48 h后蛋雞卵泡顆粒細(xì)胞的總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)獲得的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后選GAPDH為內(nèi)參，利用熒光定量PCR檢測(cè)腺病毒轉(zhuǎn)染后erk1、erk2、ras、elk-1、p-erk1、p-erk2的表達(dá)情況。

1.2.4 Western blot 檢測(cè)Ras-MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵因子蛋白表達(dá)

采用Western blot 檢測(cè)Ras-MAPK信號(hào)通路erk1、erk2、ras、elk-1、p-erk1、p-erk2的蛋白表達(dá)情況，首先進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，切下有目的條帶的凝膠后，進(jìn)行電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉后加入一抗作用8h，沖洗后加入二抗作用2h。沖洗后使用顯色試劑盒進(jìn)行顯色。采用Bandscan軟件對(duì)獲得的圖片進(jìn)行灰度值分析，以評(píng)價(jià)Ras-MAPK信號(hào)通路各關(guān)鍵因子的蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

將實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)使用SPASS19.0軟件進(jìn)行處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，運(yùn)用ANOVN對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 腺病毒轉(zhuǎn)染后的顆粒細(xì)胞

熒光倒置顯微鏡下觀察，如圖1。腺病毒轉(zhuǎn)染48 h后，顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好，且轉(zhuǎn)染率較高，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。詳細(xì)情況見圖1。

圖1 腺病毒轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞（100×）

2.2 Ras-MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵因子mRNA表達(dá)情況

應(yīng)用熒光定量PCR儀對(duì)對(duì)照組、空載體組、過表達(dá)組、低表達(dá)組、空載體組的erk1、erk2、ras、elk-1 mRNA表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示；與空載體組和對(duì)照組相比，STMN2過表達(dá)組中erk1、erk2和ras mRNA表達(dá)水平均極顯著增加（p＜0.01），elk-1 mRNA表達(dá)水平差異顯著（p＜0.05）。STMN2低表達(dá)組中erk1、elk-1 mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組和空載體組，且差異極顯著（p＜0.01），ras和erk2 mRNA表達(dá)水平差異顯著（p＜0.05），詳細(xì)結(jié)果見圖2和圖3。

圖2 不同組目的基因mRNA的表達(dá)情況

圖3 不同組目的基因mRNA的表達(dá)情況

2.3 Ras-MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵因子蛋白表達(dá)情況

使用Western blot 檢測(cè)對(duì)照組、過表達(dá)空載體組、STMN2過表達(dá)組、STMN2低表達(dá)組、RNAi空載體組中目的蛋白與β-actin蛋白表達(dá)結(jié)果。過表達(dá)組中，erk1、erk2、p-erk1、p-erk2和ras蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組和空載體組，且差異極顯著（P＜0.01），elk-1蛋白表達(dá)水平差異不顯著。STMN2低表達(dá)組中erk1、erk2、p-erk1、p-erk2，elk-1、ras蛋白表達(dá)低于對(duì)照組和空載體組，且差異顯著（p＜0.05），詳細(xì)結(jié)果見圖4、圖5、表1和表2。

圖4 Western blot檢測(cè)目的蛋白erk1、erk2、ras、p-erk1、p-erk2和elk-1表達(dá)結(jié)果

表1 不同目的蛋白過表達(dá)組表達(dá)數(shù)據(jù)分析結(jié)果

表2 不同目的蛋白R(shí)NAi組表達(dá)數(shù)據(jù)分析結(jié)果

3 討論

有研究人員經(jīng)過研究后發(fā)現(xiàn)，發(fā)育良好的卵母細(xì)胞卵泡液中BMP15的表達(dá)水平也較高，認(rèn)為其與促進(jìn)卵母細(xì)胞核質(zhì)成熟呈現(xiàn)密切的相關(guān)性[3，4]。有很多相關(guān)研究表明，顆粒細(xì)胞對(duì)卵母細(xì)胞的質(zhì)量具有重要的影響，而將顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞去除后，卵母細(xì)胞相對(duì)于有顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞包圍的細(xì)胞相比，凋亡率明顯增加，當(dāng)在培養(yǎng)液中加入BMP15后即可緩解卵母細(xì)胞凋亡的情況。并且有研究BMP15 伴隨著卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)卵母細(xì)胞及其周圍的體細(xì)胞發(fā)揮著重要的作用[5，6]。

顆粒細(xì)胞在卵泡發(fā)育的過程中發(fā)揮重要的促進(jìn)和調(diào)節(jié)作用，也是卵母細(xì)胞成熟的重要標(biāo)志物，其與內(nèi)膜細(xì)胞的增殖分化共同作為促進(jìn)卵泡發(fā)育和生長(zhǎng)的重要因素，而STMN2蛋白對(duì)顆粒細(xì)胞及卵母細(xì)胞的細(xì)胞周期均發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，STMN2調(diào)控增殖能力強(qiáng)的細(xì)胞的有絲分裂，而一些增殖較慢或分化程度較高的細(xì)胞中STMN2蛋白的表達(dá)量卻較低，例如一些癌細(xì)胞中STMN2即呈現(xiàn)高表達(dá)，所以很多研究人員希望通過STMN2蛋白攻克癌癥[7]。所以我們認(rèn)為STMN2蛋白對(duì)顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育同樣具有調(diào)控作用。

當(dāng)細(xì)胞所處的環(huán)境發(fā)生變化時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的很多信號(hào)通路即被激活，在細(xì)胞內(nèi)及各細(xì)胞間傳遞各種相關(guān)信息。而當(dāng)很多動(dòng)物受到某些因素的刺激后，機(jī)體內(nèi)的MAPK通路即被激活。MAPK家族主要包括四條信號(hào)通路[8]，Ras-MAPK是MAPK家族中最具有代表意義的信號(hào)通路，在多種生物和細(xì)胞中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

本研究中STMN2過表達(dá)后，會(huì)增加顆粒細(xì)胞中ras的mRNA和蛋白表達(dá)量，表明STMN2表達(dá)量提高后會(huì)促進(jìn)Ras-MAPK通路中ras 的活化，從而激活通路下游的靶基因，對(duì)下游靶通路發(fā)揮調(diào)控作用。

本研究中，STMN2表達(dá)量升高后，會(huì)相應(yīng)地提高erk1、erk2、p-erk1、p-erk2、elk-1的 mRNA表達(dá)水平及erk1、erk2、p-erk1、p-erk2的蛋白表達(dá)水平，從而表明，STMN2會(huì)激活下游ras-MAPK信號(hào)通。機(jī)體內(nèi)不同的信號(hào)通路會(huì)存在不同的傳導(dǎo)途徑，如果幾個(gè)通路中均包括同一基因或蛋白，那么幾個(gè)通路會(huì)以這個(gè)基因或蛋白為連接點(diǎn)，相互交織成信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，而ras 即為這種在多個(gè)信號(hào)通路中均發(fā)揮關(guān)鍵性信息傳導(dǎo)作用的蛋白。當(dāng)細(xì)胞收到外界刺激信號(hào)后，胞內(nèi)的RTKs（酪氨酸激酶受體）被激活，而激活后的RTKs與GRB2相結(jié)合，結(jié)合的方式可能是直接性的，也可能會(huì)是間接性的。RTKs與GRB2的結(jié)合體會(huì)轉(zhuǎn)移至與ras 相鄰的細(xì)胞膜上，這個(gè)轉(zhuǎn)移過程需要SOS蛋白的促進(jìn)和幫助，從而形成了SOS-ras復(fù)合體，而其中的GDP會(huì)被GTP所取代，當(dāng)GDP與ras結(jié)合后即會(huì)激活ras，如果結(jié)合的GTP被水解成GDP，那么則會(huì)使ras 失活。當(dāng)Ras蛋白被激活后，會(huì)激活下游通路，從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。

當(dāng)ras 被激活后首先會(huì)促進(jìn)raf1蛋白從胞漿轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜上，然后，raf激酶會(huì)促進(jìn)MAPK激酶的磷酸化，從而激發(fā)mek的活性，而mek則會(huì)激活erk1、erk2?；罨蟮膃rk 同樣會(huì)激活elk-1、AP-1等與細(xì)胞增殖相關(guān)的各種因子。因?yàn)槭菐讉€(gè)信號(hào)通路交織在一起，所以有多種因子均可以激活raf，而且erk同樣可以通過多種上游因子被激活[10，11]。從而我們也可以分析得出信號(hào)通路中上游基因與下游靶基因并非固定一一對(duì)應(yīng)激活的關(guān)系，也很可能是多個(gè)上游基因激活一個(gè)下游靶基因，也可能是一個(gè)上游基因激活幾個(gè)或多個(gè)下游靶基因[12]。本研究結(jié)果顯示，通過shRNA干擾降低顆粒細(xì)胞中STMN2的表達(dá)量后，Ras-MAPK信號(hào)通路中erk1、erk2、p-erk1、p-erk2、elk-1、ras的m RNA 及蛋白表達(dá)量均明顯下降，表明Ras-MAPK信號(hào)通路受到抑制，也證明了STMN2對(duì)于Ras-MAPK信號(hào)通路的信號(hào)傳導(dǎo)具有調(diào)控作用。而Ras-MAPK信號(hào)通路則與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，所以我們與可以推斷，STMN2通過調(diào)控RAS-MAPK信號(hào)通路進(jìn)而調(diào)控顆粒細(xì)胞的增殖，間接對(duì)卵母細(xì)胞的成熟發(fā)揮作用。

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