姜保平，樂亮，姚霞，許利嘉，肖偉，肖培根*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所/國家教育部中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用重點實驗室，北京 100193；2.中國中藥公司,北京 100195)

·基礎(chǔ)研究·

HepG2細胞胰島素抵抗模型的建立及在篩選兩色金雞菊活性化合物中的應(yīng)用△

姜保平1，樂亮1，姚霞2，許利嘉1，肖偉1，肖培根1*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所/國家教育部中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用重點實驗室，北京 100193；2.中國中藥公司,北京 100195)

目的：體外建立人肝癌細胞(HepG2)胰島素抵抗模型，并初步篩選兩色金雞菊中可有效改善胰島素抵抗的萃取部位及活性化合物。方法：用不同濃度的胰島素、棕櫚酸或葡萄糖分別對HepG2細胞進行不同時間的誘導(dǎo)，通過MTT法對細胞活性進行評價及葡萄糖氧化酶法對HepG2細胞葡萄糖消耗量測定，明確建立穩(wěn)定的HepG2胰島素抵抗模型的試劑誘導(dǎo)濃度及誘導(dǎo)時間。模型建立后，應(yīng)用不同濃度的兩色金雞菊粗提物、各萃取部位及七個單體化合物奧卡寧(Okanin，2)、3′，4′，8-三羥基黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(3′，4′，8-trihydroxyflavone-7-O-β-D-glucopyranoside，3)、槲皮素(Quercetin，4)、黃諾馬苷(Flavanomarein，5)、馬里苷(Marein，6)、豆甾醇(Stigmasterol，13)、紫鉚花素(Butein，16)預(yù)處理細胞24 h，再用55 mmol·L-1葡萄糖刺激24h，用葡萄糖氧化酶法或2-NBDG熒光標記葡萄糖法分別觀察不同濃度的上述成分對胰島素抵抗模型HepG2細胞糖消耗或糖吸收的影響。MTT法對各組細胞活性進行評價。結(jié)果：HepG2細胞在10-7mol·L-1濃度的胰島素中作用24 h，或在55 mmol·L-1的葡萄糖中刺激24 h，細胞葡萄糖消耗量明顯減少(P<0.01)且穩(wěn)定性良好，并且對細胞存活率未造成影響，可作為胰島素抵抗模型；而棕櫚酸組雖然糖消耗顯著下降但細胞存活率也顯著降低。兩色金雞菊總提物、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位及2號、3號、5號和16號化合物均有改善細胞胰島素抵抗作用，其中5號黃諾馬苷和6號馬里苷效果較好。結(jié)論：黃諾馬苷和馬里苷可能是兩色金雞菊中改善胰島素抵抗的主要活性成分。

兩色金雞菊；胰島素抵抗；HepG2細胞

兩色金雞菊CoreopsistinctoriaNutt.又名雪菊、金雞菊，系菊科(Asteraceae)金雞菊屬(Coreopsis)的干燥頭狀花序。載于《新華本草綱要》，味甘，性平，具有清熱解毒，化濕止痢。兩色金雞菊原產(chǎn)于北美，我國引種成功后，在新疆有大規(guī)模種植，俗稱雪菊，在當?shù)乇划斪骰ú栾嬘?，維吾爾民間用來預(yù)防心血管疾病[1]。兩色金雞菊在中國的藥用歷史并不長，然而在葡萄牙有每天喝兩杯熱兩色金雞菊茶飲用于控制糖尿病的傳統(tǒng)[2]。已有的研究表明，兩色金雞菊的化學(xué)成分主要包括黃酮類、糖類、甾類、香豆素、有機酸、鞣質(zhì)、揮發(fā)油等等[3-5]；Dias等報道兩色金雞菊顯著降低鏈脲酶素引起的血糖升高[6]，另有研究表明兩色金雞菊還具有抗氧化、降血壓、降血脂等藥理活性，有潛在的藥用價值[7-10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，兩色金雞菊茶飲能顯著降低大鼠血糖，改善胰島素抵抗，且明顯改善高糖高脂飲食引起的大鼠相關(guān)代謝通路的紊亂[7]。而對兩色金雞菊改善胰島素抵抗的活性部位及活性成分并未報道。本實驗在前期基礎(chǔ)上建立HepG2細胞IR模型，對兩色金雞菊的各萃取部位和部分單體化合物促進胰島素抵抗細胞糖吸收的活性進行篩選，為兩色金雞菊活性物質(zhì)基礎(chǔ)的研究提供參考。

1 儀器、材料

1.1 儀器

Tecan熒光酶標儀(奧地利Infinite 1000 M)；BIO-tekELx800酶標儀(美國Biotek公司)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma 公司)；超凈工作臺(日本AIR TECH 公司)；低溫離心機(德國Eppendorf)；Nikon倒置顯微鏡與照相系統(tǒng)(日本)；高壓滅菌鍋(美國Thermo Foroma)；DJ-300S分析天平(日本SHINKO公司)；電熱恒溫水浴箱(北京長安科學(xué)儀器廠)；HZQ-C振蕩器(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)。

1.2 材料

HepG2細胞購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細胞庫；人胰島素(批號：I3536)、二甲基亞砜、牛血清白蛋白(BSA)購自美國Sigma公司；DMEM低糖培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；無酚紅DMEM培養(yǎng)基(批號：11054-001)、胰酶(Trpsin)、胎牛血清(批號：10099-141)均購自美國Gibco；四甲基偶氮噻唑鹽(MTT)購自美國Amresco公司；葡萄糖測定試劑盒-氧化酶法(GOD，批號：E1010)購自普利萊基因技術(shù)有限公司；2-NBDG(批號：N13195)購自美國Life technologies。細胞培養(yǎng)板各種規(guī)格均購自美國Costar公司。4%多聚甲醛購自北京華越洋生物，無水乙醇購自北京化工廠。實驗所配試劑用水均為雙蒸水。

2 方法

2.1 高濃度的胰島素(Insulin)、棕櫚酸(Palmitic)或葡萄糖(Glucose)對細胞增殖的影響

將細胞以 10000 個/孔接種于96孔培養(yǎng)板中。分為空白組和模型組(Model)。待細胞單層貼壁后，空白組加入正常培養(yǎng)液，模型組加入新配置的含有胰島素、棕櫚酸或葡萄糖各濃度(Concentratrion)的培養(yǎng)液。MTT 法分別檢測6、12、24、48 h時細胞的生長情況。

2.2 HepG2細胞胰島素抵抗模型的建立

按文獻方法稍作改進。將處于對數(shù)生長期的細胞消化后，用含10% FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為1×105個·mL-1，轉(zhuǎn)入96孔板中。培養(yǎng)24 h后，棄去舊培養(yǎng)基加入新配制的含2% FBS的DMEM低糖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。將細胞隨機分為對照組(control)、棕櫚酸組(PA)、高糖組(HG)和高胰島素組(Insulin)，棄去培養(yǎng)基對照組(control)換以含2% FBS的DMEM低糖培養(yǎng)基，軟脂酸組(PA)換以含250、500、1000 μmol·L-1的PA并含2%FBS的DMEM低糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h和24 h；高糖組換以含25、33、 44、55、66 mmol·L-1的葡萄糖并含2% FBS的DMEM低糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)6、12、24 h；高胰島素組換以含1×10-9、5×10-9、1×10-8、5×10-8、1×10-7、5×10-7、1×10-6mol·L-1的含2% FBS的DMEM低糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)12、24、48 h。棄去培養(yǎng)基，先用PBS洗滌3次后，每孔含1×10-7mol·L-1胰島素的無酚紅培養(yǎng)基于37 ℃刺激20 min后，用葡萄糖測定試劑盒檢測培養(yǎng)基的葡萄糖含量。于酶標儀550或570 nm處測其吸光度(A)值。以不鋪細胞的空白孔為空白對照，計算胰島素刺激20 min過程中各組細胞的葡萄糖消耗量(Glucose consumption)。采用此方法通過優(yōu)化濃度和作用時間建立適宜的高濃度胰島素誘發(fā)的HepG2細胞IR模型。所有被試藥物均用DMSO溶解，DMSO的終濃度不超過0.5%。

2.3 MTT法檢測各模型組細胞存活率(Cell survival)

細胞培養(yǎng)及藥物分組同2.2，在不同濃度的PA，胰島素或高糖處理相應(yīng)的時間后，每孔加入5 mg·mL-1MTT溶液20 μL，繼續(xù)孵育4 h，棄去上清，吸干殘留液，每孔加入DMSO 150 μL，搖床上振搖10 min至生成的藍紫色甲瓚結(jié)晶完全溶解，置于酶標儀570 nm處測其吸光度值。

2.4 兩色金雞菊各萃取部位對IR-HepG2細胞葡萄糖消耗的影響

實驗分為空白組、對照組、IR 模型組、兩色金雞菊各部位組(石油醚PE、乙酸乙酯ETAC、正丁醇NBA和水W)。按照2.2方法制備 IR 模型。各組均分為加胰島素和不加胰島素組。每組設(shè)六個復(fù)孔。加藥物24 h后以葡萄糖氧化酶法檢測培養(yǎng)液上清液中的葡萄糖含量。以未接種細胞的空白組的葡萄糖含量均值減去測得的培養(yǎng)液中葡萄糖含量即得各孔細胞的葡萄糖消耗量。

2.5 兩色金雞菊各萃取部位對細胞增殖的影響

實驗分為空白組、模型組和給藥組。待細胞單層貼壁后，空白組和模型組加入無血清的培養(yǎng)液，加入新配制的含有不同濃度的兩色金雞菊各萃取部位的培養(yǎng)液刺激24 h，模型組和給藥組換成高濃度葡糖糖刺激24h，對照組換成無血清的培養(yǎng)基MTT 法分別檢測細胞的生長情況。

2.6 兩色金雞菊單體對IR-HepG2細胞糖吸收的影響

實驗分為空白組、對照組、IR 模型組、兩色金雞菊各單體組(濃度為100、50、25、12.5、6.25 μmol·L-1)。除了空白組、對照組，其他各組先用不通過濃度化合物預(yù)處理細胞24 h，再用55 mmol·L-1葡萄糖刺激細胞24 h，最后用含1×10-7mol·L-1胰島素刺激細胞20 min，每組設(shè)六個復(fù)孔。胰島素刺激細胞20 min后用葡萄糖氧化酶法檢測培養(yǎng)液上清液中的葡萄糖含量。以未接種細胞的空白組的葡萄糖含量均值減去測得的培養(yǎng)液中葡萄糖含量即得各孔細胞的葡萄糖消耗量。

2.7 兩色金雞菊單體對細胞增殖的影響

待細胞單層貼壁后，空白組加入正常培養(yǎng)液，給藥組加入新配制的含有不同濃度(100、50、25、12.5、6.25 μmol·L-1)的兩色金雞菊單體的培養(yǎng)液。MTT法分別檢測細胞的生長情況。

2.8 統(tǒng)計分析

采用 SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。兩組間計量資料比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度胰島素與HepG2細胞作用不同時間對HepG2細胞糖消耗及存活率的影響

如圖1A顯示，在不同濃度(1×10-9、5×10-9、1×10-8、5×10-8、1×10-7、5×10-7、1×10-6mol·L-1)胰島素刺激12 h，與空白組比較，胰島素組葡萄糖消耗量有一定的升高，但并無統(tǒng)計學(xué)差異；1B所示，在不同濃度的胰島素刺激24 h后，與空白組比較，1×10-9、5×10-8、5×10-7、1×10-6mol·L-1組葡萄糖的消耗量顯著下降；1C顯示，在不同濃度的胰島素刺激48 h后與空白組比較1×10-9、5×10-9、1×10-8、5×10-8、1×10-7、5×10-7mol·L-1組葡萄糖的消耗量顯著減少；1D和1E在不同濃度的胰島素刺激細胞24 h及48 h后細胞存活率與對照組比較均有顯著變化。1F，在1×10-6mol·L-1的胰島素作用細胞48 h后形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)細胞狀態(tài)良好。

3.2 不同濃度棕櫚酸與HepG2細胞作用不同時間對HepG2細胞糖消耗及存活率的影響

如圖2A顯示，在0.25 mmol·L-1棕櫚酸刺激細胞6 h，與空白組比較，細胞狀態(tài)明顯變差，表現(xiàn)為細胞體積縮小，連接消失，與周圍的細胞脫離；而2B，在不同濃度(0.125、0.25、0.5 mmol·L-1)的棕櫚酸刺激12 h后，與空白組比較0.125、0.25 mmol·L-1組葡萄糖的消耗量顯著下降；2C，在不同濃度(0.062 5、0.125、0.25、0.5 mmol·L-1)的棕櫚酸刺激24 h后與空白組比較0.25 mmol·L-1組葡萄糖的消耗量顯著減少。MTT檢測細胞存活率發(fā)現(xiàn)與棕櫚酸作用12 h和24 h細胞存活率與對照組比較顯著下降(圖2D，2E)，且2F，在0.25 mmol·L-1的棕櫚酸作用細胞24 h后形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)細胞凋亡明顯。

注：A.不同濃度胰島素作用12 h對細胞糖消耗的影響；B.不同濃度胰島素作用24 h對細胞糖消耗的影響；C.不同濃度胰島素作用48 h對細胞糖消耗的影響；D.不同濃度胰島素與HepG2細胞作用24 h對細胞存活率的影響；E.不同濃度胰島素與HepG2細胞作用48 h對細胞存活率的影響；F.HepG2細胞與1×10-6 mol·L-1的胰島素作用48 h形態(tài)學(xué)觀察(20×)；n=6，與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖1 不同濃度胰島素作用不同時間對HepG2細胞糖消耗及存活率的影響

注：A.0.25 mmol·L-1的棕櫚酸與細胞作用6 h的形態(tài)學(xué)觀察；B.不同濃度棕櫚酸作用12 h對細胞糖消耗的變化；C.不同濃度棕櫚酸作用24 h對細胞糖消耗的變化為不同濃度棕櫚酸作用12或24 h細胞糖消耗的變化；D.不同濃度的棕櫚酸與HepG2細胞作用12 h對細胞存活率的影響；E.不同濃度的棕櫚酸與HepG2細胞作用24 h對細胞存活率的影響；F.HepG2細胞與0.25 mmol·L-1的胰島素作用24 h形態(tài)學(xué)觀察；n=6，與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖2 不同濃度棕櫚酸作用不同時間對HepG2細胞糖消耗及存活率的影響

3.3 不同濃度葡萄糖與HepG2細胞作用不同時間對HepG2細胞糖消耗及存活率的影響

如圖3A顯示，不同濃度的葡萄糖刺激細胞6 h后，與空白組比較，33、55、66 mmol·L-1組細胞糖消耗顯著下降；而3B顯示，在不同濃度的葡萄糖刺激12 h后，與空白組比較，25、44、55、66 mmol·L-1組葡萄糖的消耗量顯著下降；如圖3C所示，在不同濃度的葡萄糖刺激24 h后與空白組比較25、33、44、55、66 mmol·L-1組葡萄糖的消耗量均顯著減少；而3D和3E表明，經(jīng)MTT法檢測細胞存活率發(fā)現(xiàn)，不同濃度葡萄糖作用6 h和12 h細胞存活率與對照組比較均無顯著變化，55 mmol·L-1的葡萄糖作用細胞24 h后形態(tài)學(xué)觀察，細胞生存狀態(tài)良好。

注：A.不同濃度葡萄糖作用6 h對細胞糖消耗的變化；B.不同濃度葡萄糖作用12 h對細胞糖消耗的變化；C.不同濃度葡萄糖作用24 h對細胞糖消耗的變化；D.HepG2細胞與不同濃度的葡萄糖作用6 h對細胞存活率的影響；E：HepG2細胞與不同濃度的葡萄糖作用12 h對細胞存活率的影響；F.不同濃度的棕櫚酸與HepG2細胞作用24 h形態(tài)學(xué)觀察；n=6，與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖3 不同濃度葡萄糖作用不同時間對HepG2細胞糖消耗及存活率的影響

3.4 兩色金雞菊各萃取部位對IR-HepG2細胞葡萄糖消耗及細胞存活率的影響

如圖4A顯示，在不同濃度的兩色金雞菊各萃取部位刺激細胞24 h，與空白組比較，石油醚部分(PET)各濃度組糖消耗量與模型組(55 mmol·L-1葡萄糖)比較無明顯改善；乙酸乙酯部分(EtOAc)各組細胞糖消耗與模型組比較顯著升高；正丁醇部分(nBuOH)四個濃度組與模型組比較均能顯著增加糖消耗；水部分(Water)僅12.5 μg·mL-1濃度組與模型組比較能顯著增加糖消耗；而兩色金雞菊總提物部分(Total)在50、25、12.5 μg·mL-1濃度組的糖消耗與模型組比較均顯著升高。圖4B顯示，用MTT檢測細胞存活率結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩色金雞菊各部分處理細胞24 h，細胞存活率與對照組比較，除PET 50和25 μg·mL-1兩組細胞存活率顯著下降外，其他組均無顯著變化。

3.5 兩色金雞菊7種單體對IR-HepG2細胞葡萄糖吸收的影響

為了檢測兩色金雞菊中哪些單體化合物對IR-HepG2細胞糖吸收具有改善作用，從而找到兩色金雞菊中的活性化合物。我們對兩色金雞菊中7種單體化合物(圖5)進行了促進IR-HepG2細胞糖吸收的活性篩選。

注：A.為不同濃度的兩色金雞菊各部位與細胞作用24 h對葡萄糖消耗的影響；B.HepG2細胞與不同濃度的兩色金雞菊各部位作用24 h對細胞存活率的影響；n=6，與對照組比較，*P <0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖4 不同濃度兩色金雞菊各部位對IR-HepG2細胞糖消耗及存活率的影響

圖5 7種化合物的結(jié)構(gòu)式

用不同濃度的化合物預(yù)處理細胞24 h后，用55 mmol·L-1的葡萄糖刺激細胞24 h，然后用含1×10-7mol·L-1胰島素的無酚紅培養(yǎng)基37 ℃孵育孵育細胞20 min，，酶標儀檢測吸光度值，用方法中提到的公式計算葡萄糖消耗量。如圖6A所示，與對照組比較，經(jīng)高糖刺激后，模型組對胰島素的敏感性顯著降低，細胞的糖消耗量顯著下降(P<0.05)，說明模型組細胞對胰島素產(chǎn)生抵抗。與模型組比較，四種化合物在低濃度1.56 μmol·L-1均能顯著改善HepG2細胞的胰島素敏感性，促進糖消耗，相比之下5號化合物效果最好，且有效范圍最廣，在1.562 5、12.5、25和50 μmol·L-1均能顯著改善IR-HepG2細胞的胰島素敏感性，促進糖吸收。如圖6B所示，四種化物對細胞存活率的測定結(jié)果顯示，3號化合物在各劑量濃度下均能顯著增加細胞存活率，表明3號化合物有一定的促進細胞增殖的作用；其它三種化合物對細胞存活率則無顯著影響。

注：A.為兩色金雞菊中不同濃度的13號、5號和4號化合物分別與細胞作用24 h對葡萄糖消耗的影響；B.MTT法檢測細胞存活率；n=5，與對照組比較，*P <0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖6 兩色金雞菊部分化合物對IR-HepG2細胞糖消耗及存活率的影響

如圖7A所示，與對照組比較，經(jīng)高糖刺激后，模型組細胞對胰島素的敏感性顯著降低，細胞的糖消耗量顯著下降(P<0.05)，說明模型組細胞對胰島素產(chǎn)生了抵抗。化合物預(yù)處理組與模型組比較，三種化合物的有效濃度集中于6.25～50 μmol·L-1。且相比之下，三種化合物中6號的活性顯著優(yōu)于其它兩種化合物。如圖7B，四種化物對細胞存活率的影響結(jié)果顯示，16號化合物在6.25～100 μmol·L-1均能顯著降低細胞存活率，有一定的細胞毒作用；其它兩種化合物對細胞存活率則無顯著影響。

注：A.為兩色金雞菊中不同濃度的6號、16號和2號化合物分別與細胞作用24 h對葡萄糖消耗的影響。B.MTT法檢測細胞存活率；n=5，與對照組比較，*P <0.05；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖7 兩色金雞菊部分化合物對IR-HepG2細胞糖消耗及存活率的影響

4 討論

胰島素抵抗是2型糖尿病等代謝綜合癥的共同發(fā)病基礎(chǔ)[11]，因此，改善胰島素抵抗已成為治療2型糖尿病的主要途徑。胰島素抵抗在細胞水平的定義為：由于細胞表面胰島素受體數(shù)目減少或受體后缺陷，導(dǎo)致一定濃度的胰島素不能使細胞達到預(yù)期的代謝水平。肝臟是胰島素作用的重要靶器官，也是產(chǎn)生胰島素抵抗的主要部位之一。在關(guān)于胰島素抵抗細胞模型的文獻報道中，應(yīng)用人源肝癌細胞——HepG2細胞株作為誘導(dǎo)模型的居多，因其表面表達的高親和力胰島素受體滿足典型胰島素受體所要求的標準[12-13]。研究者將HepG2與高濃度胰島素(5×10-7mol·L-1)共同孵育后，有胰島素受體和受體后的功能缺陷，受體自身磷酸化功能和胰島素刺激的糖、脂、蛋白質(zhì)代謝功能降低[14]，因而HepG2是研究肝IR的理想細胞模型。本實驗結(jié)果表明，不同濃度的胰島素誘導(dǎo)HepG2細胞IR時，以1×10-7和5×10-7mol·L-1誘導(dǎo)模型效果較佳，而1×10-7mol·L-1穩(wěn)定性最好，且細胞活力良好。而棕櫚酸誘導(dǎo)的模型以0.25 mmol·L-1作用12 h和24 h效果最佳，但棕櫚酸與細胞作用6 h即可導(dǎo)致細胞活力下降，死亡增多。高糖誘導(dǎo)的模型中以12 h中44、55和66 mmol·L-1效果較好，24 h中 33～66 mmol·L-1效果均較好，且66 mmol·L-1作用細胞24 h并未引起細胞毒性，從模型穩(wěn)定性考慮，55 mmol·L-1葡萄糖作用細胞24 h為佳。因此，綜合以上情況，確定胰島素抵抗HepG2細胞模型的最佳方案為：1×10-7mol·L-1胰島素或55 mmol·L-1葡萄糖作用細胞24 h。

利用所建立的細胞模型(55 mmol·L-1葡萄糖，24 h)對兩色金雞菊茶飲各萃取部位進行篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位和總提物效果為佳，且無細胞毒性。

利用所建立的細胞模型(55 mmol·L-1葡萄糖，24 h)對兩色金雞菊部分化合物進行篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5號化合物falavanomarein(黃諾馬苷)和6號化合物marein(馬里苷)具有較好的活性，且兩種化合物在兩色金雞菊中含量較高，推測它們?yōu)閮缮痣u菊改善胰島素抵抗的主要活性化合物。

本研究結(jié)果進一步證實兩色金雞菊改善胰島素抵抗的作用，說明其具有一定的藥用價值；另外我們篩選出其主要活性化合物，為兩色金雞菊的進一步研究開發(fā)提供參考。

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EstablishmentofInsulinResistanceHepG2CellModelandItsApplicationinScreeningBioactiveComponentsofCoreopsistinctoria

JIANGBaoping1，LELiang1，YAOXia2，XULijia1，XIAOWei1，XIAOPeigen1*

(1.KeyLaboratoryofBioactiveSubstancesandResourcesUtilizationofChineseHerbalMedicine，MinistryofEducation，InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China； 2.ChinaNationalTraditionalChineseMedicineCorporation，Beijing100195，China)

Objective：To establish human hepatoma carcinoma cell(HepG2 cell)model of insulin resistance in vitro and to initially select the effective ingredients ofCoreopsistinctoria.Methods：HepG2 cells were induced by insulin，palmic acidor glucose of different concentrations for different time.Through the estimation of the cell activity with MTT method and glucose consumption with glucose oxidase method，the effective concentrations and time of inducer in the insulin resistance cell model were ascertained.After the cell model establishment，HepG2 cells were pretreated with crude extracts ofC.tinctoria，different fractions or compounds of different concentrations for 24 h，and the influences on the model cells regarding glucose consumption were observed through the glucose oxidase method or fluorescent glucose 2-NBDG and the cell viability was evaluated by the MTT method.Results：Compared with the control group，1×10-7mol·L-1insulin-stimulated cells 24 h or 55 mmol·L-1glucose-stimulated cells 24 h has a significant insulin resistance effect，and high concentrations of insulin or glucose did not affect the cell viability，while palmitic acid group emerges insulin resistant but the cell viability was also significantly decreased.Screening results showed that the 5th compound falavanomarein and the 6th compounds marein had better preventive activity of high glucose-induced insulin resistance.Conclusion：Insulin resistance cell models are successfully made.Falavanomarein and marein could be the main active compounds ofC.tinctoria.

Coreopsistinctoria；insulin resistance；HepG2 cell

國家自然科學(xué)基金資助項目(81274188)；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程經(jīng)費資助(81573576)

] 肖培根，中國工程院院士，研究方向：藥用植物資源學(xué)；Tel：(010)62894462，E-mail：pgxiao@implad.ac.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.2.002

2016-04-12)

*[