高小寬1，劉亞軒2，梁魁景1

五味子提取物對貯藏期梨黑斑病的防治研究

高小寬1，劉亞軒2，梁魁景1

（1衡水學(xué)院生命科學(xué)系河北衡水053000；2深州市農(nóng)業(yè)局）

以蘋果梨為試驗材料，研究五味子提取物對梨黑斑病室內(nèi)毒力測定和梨果實體內(nèi)損傷接種的影響，從而篩選出最佳抑制濃度。結(jié)果表明：在內(nèi)毒力測定中用4 000 mg/L、2 000 mg/L、1 000 mg/L、500 mg/L和250 mg/L五味子提取物處理均可降低損傷接種果實的發(fā)病率和腐爛率，其中4 000 mg/L抑制率高達(dá)52.78%，毒力最強(qiáng)EC50為3 196.44 mg/L；在體內(nèi)損傷接種試驗中也使用上述濃度，其中1 000 mg/L的抑制率最低為43.55%，2 000 mg/L抑制率最高為63.31%，毒力最強(qiáng)EC50為480.722 mg/L。

五味子提取物；梨；貯藏期；黑斑病

崔建潮等[3]選用14種殺菌劑對梨黑斑病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑制作用進(jìn)行了測定，結(jié)果表明，苯醚甲環(huán)唑?qū)Σ≡z生長的毒力最強(qiáng)，有效中濃度EC50為0.421 mg/L。王中華研究了鮑曼菌素對梨黑斑病病原菌孢子萌發(fā)具有很強(qiáng)的抑制作用，其效果好于相同濃度的嘧霉胺、苯醚甲環(huán)唑、多菌靈和代森錳鋅[4]。目前，生產(chǎn)上防治梨黑斑病主要依靠化學(xué)藥劑，由于長期使用單一殺菌劑會誘導(dǎo)病，致使原物產(chǎn)生抗藥性而使得殺菌效果降低[5]。五味子作為一種重要的中藥，含有很多有效成分，包括五味子素、五味子醇、去氧五味子素等[6]，馬永全、于新的試驗表明，五味子提取物具有明顯的抗菌和抗氧化作用[7]。本試驗選用不同濃度的中藥五味子提取物的有效成分，分別通過體內(nèi)和體外試驗篩選出提取物對梨黑斑病抑制的最佳濃度，以期為中藥五味子提取物防治梨黑斑病提供依據(jù)，為新型生物防腐劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料五味子提取物由西安匯森生物科技有限公司提供，成分和性狀見表1。其提取物生產(chǎn)工藝為原料植物經(jīng)粉碎后用70%乙醇提取3遍，液體合并過濾，經(jīng)濃縮、噴粉、干燥、粉碎過篩，成品包裝。供試病原菌為梨貯藏期黑斑病，采自衡水舊城村梨園帶病的蘋果梨果，貯藏15 d后取病組織分離得到梨黑斑病菌，經(jīng)魏景超真菌鑒定手冊鑒定為梨黑斑病病菌。培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。

表1 五味子提取物成分和性狀

1.2 病原菌培養(yǎng)、PDA培養(yǎng)基及孢子懸浮液的制備

1.2.1 病原菌的培養(yǎng)參照方中達(dá)方法[8]。

1.2.2 PDA培養(yǎng)基的制備參照方中達(dá)方法[8]進(jìn)行。

1.2.3 孢子懸浮液制備取出預(yù)先培養(yǎng)好的備用病原菌，在無菌條件下，往培養(yǎng)好的菌種培養(yǎng)基上加入含有0.01%Tween 80的無菌水10 mL，用已消毒的毛筆將互隔交鏈孢孢子從培養(yǎng)皿上輕輕刮下，制成濃度為1×106CFU/mL的孢子懸浮液，懸浮液孢子計數(shù)采用在10×10倍顯微鏡下每視野30～35個分生孢子。

1.3 生物測定方法

1.3.1 對菌絲生長的抑制活性測定（采用菌絲生長速率法）在無菌條件下，分別稱取0.4、0.2、0.1、0.05和

0.025 g五味子提取物粉末，分別用1 mL的70%乙醇溶解后加入100 mL的PDA培養(yǎng)基中，搖勻后趁熱倒入直徑90 mm的培養(yǎng)皿內(nèi)。預(yù)先培養(yǎng)梨黑斑病原菌，用滅過菌的直徑為6 mm的打孔器在菌落邊緣鉆取菌餅[9，10]，接種于含有殺菌劑的PDA培養(yǎng)基的中央，菌絲面向下，每皿接種1個菌餅，每個處理3次，25℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天用十字交叉法測量供試真菌菌落生長直徑，共培養(yǎng)觀察6 d的結(jié)果。觀測每天菌落的生長量曲線和計算菌絲生長抑菌率。對照處理指正常PDA培養(yǎng)基未加入抑菌物質(zhì)，70%乙醇處理指取70%乙醇1 mL加入100 mL的PDA培養(yǎng)基中，提取物是由70%乙醇定容。

1.3.2 對分生孢子萌發(fā)的抑制活性測定在無菌條件下。五味子提取物濃度同1.3.1。用接種環(huán)取孢子懸浮液均勻涂在加五味子提取物的PDA培養(yǎng)基載玻片上，保濕，放置在25℃光照培養(yǎng)箱條件下培養(yǎng)，6 h后，對照孢子萌發(fā)率達(dá)到80%，用1 g/L的HgCl2固定，檢查孢子萌發(fā)率，每個處理觀察10個視野約300個孢子，3次重復(fù)。孢子萌發(fā)以芽管長度超過孢子直徑長度（指直徑小的一邊）的1/2為標(biāo)準(zhǔn)。70%乙醇處理指取70%乙醇1 mL加入100 mL的PDA培養(yǎng)基中，提取物是由70%乙醇溶解。

1.4 處理已經(jīng)記錄的試驗數(shù)據(jù)采用MicrosoftExcel 2010軟件處理，以藥劑質(zhì)量濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)、抑制率幾率值為縱坐標(biāo)作圖，得到毒力回歸方程及有效抑制中濃度(EC50)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 五味子提取物對梨黑斑病菌絲的抑制作用在供試條件下，從表2可以看出：五味子的提取物濃度為4 000 mg/L抑制率為52.78%，濃度在2 000、1 000、500、250 mg/L的抑制率均在50%以下。

因此五味子提取物在4 000 mg/L的較高濃度下對梨黑斑病有比較好的抑制效果，在低濃度下抑制效果并不顯著。

表2 五味子提取物對梨黑斑病菌絲生長的影響

2.2 五味子提取物對病原菌絲的的毒力測定Excel軟件計算了五味子提取物的毒力回歸曲線及EC50。供試五味子提取物不同濃度對梨黑斑病菌菌絲生長有均不同程度的抑制效果，五味子對病原菌的毒力較強(qiáng)EC50為3 196.44（表3）。

表3 五味子提取物對梨黑斑病菌菌絲生長的毒力

2.3 五味子提取物對病原孢子萌發(fā)的抑制由表4可知，隨著五味子提取物濃度增大相對萌發(fā)率降低，且提取物對孢子萌發(fā)的抑制作用不同濃度之間存在差異。五味子提取物在250和500 mg/L濃度時孢子萌發(fā)率都達(dá)到60%以上；濃度為1 000和2 000 mg/L時孢子萌發(fā)率都可達(dá)到50%，五味子提取物在濃度為4 000mg/L時孢子萌發(fā)率為44.44%。結(jié)果表明，不同濃度五味子提取物對梨黑斑病原孢子萌發(fā)均有抑制作用，且高濃度五味子提取物抑制作用較顯著。這一抑制結(jié)果與菌絲結(jié)果相符。

表4 五味子提取物對梨黑斑病原孢子萌發(fā)的抑制

2.4 五味子提取物對梨黑斑病病斑生長的影響各濃度五味子提取物處理與對照相比均能不同程度地抑制損傷接種蘋果梨果實病斑直徑的擴(kuò)展，且濃度越高抑制效果越明顯（表5），且與對照間差異達(dá)顯著水平。不同濃度五味子提取物對體內(nèi)損傷接種果實的發(fā)病率均有一定的抑制活性，在250 mg/L時病斑直徑最大，抑菌效果最差，升高濃度后相對病斑直徑減小。但在500 mg/L和1 000 mg/L濃度之間出現(xiàn)了非正比現(xiàn)象，可能是五味子中等濃度在室內(nèi)損傷接種試驗中出現(xiàn)了不可控因素導(dǎo)致與離體抑菌結(jié)果不一致。五味子提取物濃度為250 mg/L時抑制作用最差，500 mg/L和1 000 mg/L的抑制作用較好，4 000 mg/L的五味子提取物抑菌效果最好。

表5 五味子提取物對梨黑斑病病斑生長的影響

2.5 毒力測定Excel軟件計算了五味子提取物對梨果實的毒力回歸曲線及EC50。五味子提取物的EC50為979.07 mg/L（表6）。

表6 五味子提取物對梨黑斑病病斑生長的毒力

3 結(jié)論與討論

五味子提取物對梨黑斑病菌的菌落生長、菌絲伸長和在體內(nèi)損傷接種試驗中均具有不同程度的抑制效果。

其中，對菌落生長抑菌效果最好的五味子提取物濃度為4 000 mg/L，此抑制率可達(dá)到52.78%，對病原菌的毒力最強(qiáng)EC50為3 196.44 mg/L。在損傷接種試驗中，濃度為4 000 mg/L的抑菌效果最好，抑制率達(dá)到61.44%，毒力最強(qiáng)，EC50為979.07 mg/L。

以上兩種試驗結(jié)果均反映出當(dāng)五味子提取物的濃度為4 000 mg/L時對梨黑斑病菌的抑制效果最佳。在低濃度下五味子提取物對梨黑斑病菌并沒有顯著抑菌效果。

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S436.612.1+4

A

10.19440/j.cnki.1006-9402.2017.05.006

2017-06-02

河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項目（項目編號：QN2016329）

高小寬（1981-），女，河北正定人，碩士，講師，研究方向為遺傳學(xué)。E-mail：xiaokuangao811018@163.com