黃 瑩 田德英 張振綱

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院消化內(nèi)科（湖北 武漢，430030）

戊型肝炎病毒ORF3蛋白對人肝癌細胞中Ⅰ型干擾素及ISG15蛋白表達的影響*

黃 瑩 田德英 張振綱Δ

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院消化內(nèi)科（湖北 武漢，430030）

目的：探討基因Ⅲ型戊型肝炎病毒（HEV）非結(jié)構(gòu)蛋白開放閱讀框3（ORF3）對體外培養(yǎng)的人肝癌PLC/PRF/5細胞中Ⅰ型干擾素（IFN-α和IFN-β）及干擾素刺激基因（ISG）15蛋白表達的影響。方法：分別用基因Ⅲ型戊型肝炎病毒ORF3質(zhì)粒及空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PLC/PRF/5細胞，在轉(zhuǎn)染之后不同時間點（0h，8h，12h，24h，48h，72h，120h），用ELISA方法檢測細胞上清液中Ⅰ型干擾素的含量，并用Western blot方法檢測ISG15蛋白的表達。結(jié)果：ORF3組細胞上清液中IFN-α、β的水平均比空載組及空白組升高，而空載組與空白組之間無明顯改變。并且ORF3組細胞中ISG15蛋白的表達增加，而空載組與空白組無明顯改變。結(jié)論：基因Ⅲ型HEV的非結(jié)構(gòu)蛋白ORF3促進Ⅰ型干擾素（IFN-α和IFN-β）及ISG15蛋白的表達。

肝炎，戊型，病毒；非結(jié)構(gòu)蛋白ORF3；Ⅰ型干擾素；干擾素刺激基因15

戊型肝炎病毒（HEV）是世界范圍內(nèi)引起急性肝炎最常見的原因之一［1］，也是導(dǎo)致急性肝衰竭的原因之一。大多數(shù)情況下HEV感染具有自限性，但在免疫功能低下或免疫缺陷的人群中，HEV可能引起慢性感染［2－5］。然而目前HEV導(dǎo)致慢性化的機制仍不清楚。HEV是一含有3個開放閱讀框（ORF）全長約7.2kb的單股正鏈RNA病毒，ORF1編碼功能結(jié)構(gòu)域；ORF2編碼病毒衣殼；ORF3編碼一種涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和病毒顆粒分泌的小分子磷酸化蛋白［6－9］。HEV分為4種基因型，基因Ⅰ型和Ⅱ型僅感染人類，而Ⅲ型和Ⅳ型具有人畜共患性。目前發(fā)現(xiàn)的慢性化病例主要是由基因Ⅲ型引起。病毒感染機體后引起機體抗病毒免疫反應(yīng)，分泌I型干擾素（IFN）抵御病毒的入侵。Ⅰ型IFN又能夠刺激干擾素刺激基因（ISGs）的表達，其中ISG15的表達較明顯，研究發(fā)現(xiàn)ISG15蛋白能夠負性調(diào)控I型IFN的表達［10］。本研究通過瞬時轉(zhuǎn)染ORF3質(zhì)粒到人肝癌細胞株P(guān)LC/PRF/5中，探討HEV ORF3對Ⅰ型干擾素及其下游因子ISG15蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 兔抗人單克隆抗體ORF3（ABBIOTEC），鼠抗人單克隆抗體β-actin（武漢博士德），Lipofectamine2000（Invitrogen），胎牛血清，DMEN粉（Gibco），胞漿胞核蛋白提取試劑盒（PIERCE），BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天），TEMED，丙烯酰胺（Amresco）。人干擾素ELISA試劑盒（上海西唐），無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒（TIANGEN），空載質(zhì)粒pEGFP-N1及基因Ⅲ型pEGFP-ORF3由本實驗室保存及構(gòu)建。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞株及培養(yǎng) 人肝癌細胞株P(guān)LC/PRF/5由廈門大學(xué)國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心提供。將細胞種植于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，于5%的CO2，37℃條件下培養(yǎng)。當細胞的密度達到80%時，對細胞進行傳代。

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 取在對數(shù)生長期，生長狀態(tài)良好的PLC/PRF/5細胞，以每孔2×105個細胞接種于6孔板中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱過夜。于轉(zhuǎn)染前2 h，換成無血清DMEM培養(yǎng)基。對于每個轉(zhuǎn)染樣品，用100μlopti-MEM稀釋4μg質(zhì)粒，并用槍頭輕輕混勻，室溫靜置5 min。取8μl的Lipofectamine2000稀釋在100μl opti-MEM中，室溫靜置5 min后，混合含Lipofectamine2000和質(zhì)粒的稀釋液（總體積為200μl），輕輕混勻并室溫靜置20 min。每個培養(yǎng)孔中加入混合液200μl，并前后輕輕晃動六孔板，搖勻混合液后置于37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6 h后，吸出混合液換入DMEM完全培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后于免疫熒光顯微鏡下觀察質(zhì)粒的表達情況，并于指定時間點收集細胞及細胞上清液。

1.2.3 Western blot法檢測細胞內(nèi)ORF3蛋白及ISG15蛋白的表達 分別用胰酶消化按胞漿胞核蛋白提取試劑盒說明書提取胞漿蛋白。用BCA法測定蛋白濃度。配制12%SDS-PAGE膠，每孔加入40μg蛋白樣品。先恒壓80V電泳至溴酚藍指示劑在濃縮膠與分離膠交界處成線狀，改為恒壓120v至溴酚藍到凝膠底部，此過程約用時1.5h。使用濕轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)儀進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為200mA 90min。用5%脫脂牛奶封閉過夜，一抗ORF3 1∶300，ISG15 1∶500，β-actin 1∶200室溫搖床孵育2h，二抗1∶5000室溫搖床孵育2h。用BandScan分析膠片灰度值。

1.2.4 ELISA檢測細胞上清液中Ⅰ型干擾素水平 采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測不同時間點細胞上清液中Ⅰ型IFN水平，按試劑盒說明書進行操作。

2 結(jié)果

2.1 基因Ⅲ型HEV ORF3質(zhì)粒在PLC/PRF/5細胞中成功表達

將ORF3質(zhì)粒及空載質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到PLC/PRF/5細胞中，通過Western blot法檢測HEV ORF3蛋白在細胞內(nèi)的表達情況，結(jié)果顯示同空白組和空載組相比，轉(zhuǎn)染ORF3-GFP質(zhì)粒組細胞ORF3成功表達 見圖1。

圖1 基因Ⅲ型HEV ORF3質(zhì)粒在PLC/PRF/5細胞中成功表達圖

2.2 HEV ORF3蛋白對PLC/PRF/5細胞中Ⅰ型IFN的影響

通過ELISA試劑盒檢測轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后不同時間點（0h，8h，12h，24h，48h，72h，120h）細胞上清液中I型干擾素（IFN-α和IFN-β）的水平。結(jié)果顯示七個時間點，ORF3組中細胞IFN-α和IFN-β的水平均較同一時間點空白組和空載組顯著增加（P＜0.05）。但同一時間點的空白組與空載組之間差異比較無明顯意義（P＞0.05）。并且可見ORF3組細胞上清液中IFN-α和IFN-β的水平均隨時間先升高后降低，即從0 h開始升高，在24 h達到最高水平，之后逐漸降低，見圖2。統(tǒng)計學(xué)分析ORF3組細胞中IFN-α含量，可知轉(zhuǎn)染后8h、12h、24h、48h、72h等時間點均較0h和120h升高（均P＜0.05），且12h較8h、72h增高；48h較12h增高；24h較48h增高（均P＜0.05），但0h和120h兩者之間的IFN-α水平差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。統(tǒng)計學(xué)分析ORF3組細胞中IFN-β含量，可知轉(zhuǎn)染8h、12h、24h、48h、72h、120h等時間點均較0h升高（均P＜0.05），且12h、72h較8h、120h增高；24h、48h較12h、72h增高（均P＜0.05），但8h和120h、12h和72h、24h和48h兩兩之間IFN-β水平比較，差異細胞無明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。但空白組和空載組細胞，IFN-α和IFN-β水平隨時間比較無明顯變化（P＞0.05）。

圖2 3組細胞I型IFN表達圖

表1 3組細胞不同時間細胞上清液中IFN-α含量比較（±s，pg/ml）

表1 3組細胞不同時間細胞上清液中IFN-α含量比較（±s，pg/ml）

IFN-α水平組別0h 8h 12h 24h 48h 72h 120h空白組（n＝6）8.196± 0.267 8.805± 2.022 9.302± 1.366 8.089± 1.054 9.397± 1.491 12.149± 0.610 14.172± 2.295空載組（n＝6）8.787± 1.364 7.111± 1.380 7.706± 1.396 8.368± 2.142 7.779± 1.581 13.084± 1.997 20.877± 0.938 11.958± 0.986 ORF3組（n＝6）20.908± 1.482 34.078± 1.277 41.855± 0.363 52.731± 0.813 46.756± 1.419 38.490± 2.734

表2 3組細胞不同時間細胞上清液中IFN-β含量比較（±s，pg/ml）

表2 3組細胞不同時間細胞上清液中IFN-β含量比較（±s，pg/ml）

IFN-α水平組別0h 8h 12h 24h 48h 72h 120h空白組（n＝6）24.229± 12.714± 2.350 14.232± 2.679 14.172± 2.1197.882空載組（n＝6）13.630± 2.548 14.425± 1.983 17.719± 5.003 23.370± 6.401 ORF3組（n＝6）12.555± 2.674 13.483± 1.988 12.946± 3.448 14.392± 0.879 13.789± 2.031 19.205± 3.999 58.389± 2.789 33.422± 3.914 54.170± 2.884 74.666± 1.425 82.396± 1.988 80.817± 2.452 70.202± 2.787

2.3 3組細胞中ISG15蛋白表達情況見圖3。 通過Western印跡檢測轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后不同時間點（0h，8h，12h，24h，48h，72h，120h）細胞中ISG15蛋白水平。結(jié)果顯示ORF3組細胞中ISG15蛋白含量在轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后24h、48h、72h、120h等時間點均較0h顯著增加（均P＜0.05），且在轉(zhuǎn)染后24h ISG15蛋白開始表達，直至72h達到最高水平，隨后下降。但空白組和空載組細胞中未見ISG15蛋白明顯表達。

圖3A 3組細胞中ISG15蛋白表達圖

圖3B ORF 3組細胞中ISG15蛋白表達半定量分析圖

3 討論

當病毒、細菌等病原體侵入人體時，機體首先啟動抗病原體天然免疫功能以抵抗病原體的入侵。而干擾素系統(tǒng)是宿主應(yīng)對病原體天然免疫反應(yīng)的重要組成部分。病原體中的病原相關(guān)分子模式（PAMP）同細胞中的模式識別受體（PRR）相結(jié)合，激活干擾素信號通路，誘導(dǎo)Ⅰ型IFN的產(chǎn)生，發(fā)揮抗病毒作用［11，12］。而ISGs作為干擾素信號通路中的關(guān)鍵因子，對細胞抗病毒過程有影響。有研究將腎移植后合并HEV感染者和無HEV感染者血清進行比較，發(fā)現(xiàn)包括ISG15在內(nèi)的25個ISGs水平上調(diào)［13］。干擾素系統(tǒng)主要通過IFN-α和IFN-β信號通路發(fā)揮主要作用［14］。HEVORF3蛋白可以通過阻斷干擾素信號通路的信號因子STAT1的磷酸化而下調(diào)IFN-α的表達，以逃避免疫應(yīng)答，從而引起細胞中病毒的持續(xù)存在［8］。與此同時，HEV ORF3蛋白可以通過上調(diào)RIG-I的量來增強誘導(dǎo)Ⅰ型IFN的產(chǎn)生［15］。這意味著HEV可以通過ORF3蛋白發(fā)揮雙重相反的作用［7］。目前HEV ORF3蛋白在HEV感染中的明確作用尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)HEV ORF3蛋白可在細胞中誘導(dǎo)Ⅰ型IFN的表達，且Ⅰ型IFN的表達先增加后降低，但總體表達量是增加的。因作為PAMP的HEV ORF3蛋白可以通過與PRR（RIG-I和TLR3）結(jié)合，激活干擾素信號通路［16，17］。而干擾素信號通路的激活促進了下游因子ISG15蛋白的產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)ISG15蛋白在體內(nèi)干擾素免疫中起負性調(diào)節(jié)作用［10，14］。另有研究發(fā)現(xiàn)ISG15蛋白能夠促進丙型肝炎病毒（HCV）的復(fù)制，并且能夠抑制IFN-α的抗病毒作用［18，19］。故推測ISG15蛋白可能在HEV病毒感染發(fā)生慢性化過程中發(fā)揮重要的作用，但目前ISG15蛋白對HEV感染的影響尚無研究。本研究發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染ORF3質(zhì)粒的細胞中Ⅰ型IFN的表達呈先增加后降低的趨勢，并且在24小時的表達量達到最高水平，隨后開始下降，同時ISG15蛋白在24小時開始表達，之后表達量逐漸增加，那么，ISG15蛋白是否對Ⅰ型IFN的減少發(fā)揮直接作用，從而減弱機體抗病毒能力，引起HEV持續(xù)存在，最終導(dǎo)致HEV發(fā)生慢性感染，這需要進一步的實驗研究來明確。ISG15蛋白是否對Ⅰ型IFN發(fā)揮直接負性調(diào)控作用并對病毒感染存在確切影響，這也需要做進一步的研究。

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Open reading frame 3 protein of hepatitis E virus regulates typeⅠinterferon and ISG15 protein induction in Human hepatocellular carcinoma cells

HUANGYing，TIAN De-ying，ZHANG Zhen-gangΔ.Department of Infectious Diseases，TongJi Hospital，TongJi Medical College，Huazhong University of Science and Technology（Wuhan Hubei，430030）China

Objective：To study the effect of genotype 3 hepatitis E virus ORF3 protein onthe production of typeⅠinterferon and ISG15 protein in Human hepatocellular carcinoma cells.M ethods：Hepatocellular carcinoma cell line PLC－PRF－5 was respectively transfected with the genotype III hepatitis E virus ORF3 plasmid and the empty plasmid.At different time points after transfection（0h，8h，12h，24h，48h，72h，120h），the production of IFNⅠin supernatantswasmeasured by ELISA and the expression of ISG15 protein was assayed byWestern blot.Results：The levels of IFNαandβin the ORF3 plasmid groupsupernatant were obviously higher than those in the empty plasmid group and blank group，but therewas no significant change in the empty plasmid group and blank group.And the expression of ISG15 protein was increased in ORF3 plasmid group，but there was no significant change in the empty plasmid group and blank group.Conclusion：GenotypeⅢHEV ORF3 protein promotes the expression of type I interferon（IFNαand IFNβ）and ISG15 protein.

Hepatitis E virus；ORF3；Interferon-I；ISG15

，2017－04－28 編輯：程良斌）

10.3969/j.issn.1005－0264.2017.03.013

國家自然科學(xué)基金項目（No.81570540），湖北省衛(wèi)生計生科研基金項目（No.WJ2015MA002）；Δ通訊作者，E－mail：zhangzhg＠126.com