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不同比例激活劑對富血小板凝膠的生物學(xué)影響*

2017-09-19 03:45戴靜陳建蘇招志毅
關(guān)鍵詞:激活劑生長因子角膜

戴靜,陳建蘇,招志毅

[1.廣西省柳州市工人醫(yī)院 眼科,廣西 柳州 545005;2.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 眼科研究室(再生醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室),廣東 廣州 510632]

不同比例激活劑對富血小板凝膠的生物學(xué)影響*

戴靜1,陳建蘇2,招志毅1

[1.廣西省柳州市工人醫(yī)院 眼科,廣西 柳州 545005;2.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 眼科研究室(再生醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室),廣東 廣州 510632]

目的比較不同比例激活劑對富血小板凝膠的生物學(xué)影響,研究其用于角膜基質(zhì)再生的可行性。方法抽取兔全血,經(jīng)二次離心法制備富血小板血漿(PRP),將PRP與激活劑按不同比例激活,制備PRP凝膠。實驗分為3個實驗組,分別為9∶1組(PRP∶激活劑=9∶1)、11∶1組(PRP∶激活劑=11∶1)及5∶1組(PRP∶激活劑=5∶1)。將兔角膜基質(zhì)細(xì)胞與PRP凝膠共同培養(yǎng),進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察,用細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒法,分別檢測3個實驗組PRP凝膠釋放的復(fù)合生長因子促角膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖作用。對不同實驗組制備的PRP凝膠與雙層豬角膜基質(zhì)進(jìn)行黏附性觀察。結(jié)果9∶1組制備的PRP凝膠促進(jìn)兔角膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖和活化作用強于其他實驗組。3個實驗組中,只有9∶1組制備的PRP凝膠蘇木精-伊紅染色法染色結(jié)果顯示,呈有序的網(wǎng)狀支架結(jié)構(gòu),能緊密黏附并固定雙層豬角膜基質(zhì)。結(jié)論PRP與激活劑以9∶1比例制備的PRP凝膠促角膜基質(zhì)細(xì)胞增殖作用最強,同時具有有序網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和良好的組織黏附性及相容性,是一種可以用于角膜基質(zhì)再生的良好支架。

激活劑;富血小板凝膠;角膜基質(zhì);

富血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)是一種全血提取后獲得的血小板濃縮物,PRP與激活劑按一定比例激活后,就可得到PRP凝膠。PRP凝膠制備方法中,多種因素都可能影響其生物效應(yīng)的發(fā)揮,而不同激活劑及其比例的選擇對PRP凝膠促組織再生有非常重要的作用[1-2]。本文通過PRP與凝血酶激活劑按不同比例激活,制備PRP凝膠,比較不同比例的激活劑對富血小板凝膠生物學(xué)影響的差異,得出促進(jìn)角膜基質(zhì)再生所需激活劑的最佳比例,為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

Ⅱ型膠原蛋白酶、胰蛋白酶、凝血酶購自美國Sigma公司,胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)、細(xì)胞培養(yǎng)基 (dulbecco'smodified eaglemedium,DMEM)購自美國Gibico公司,活細(xì)胞計數(shù)法試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)(日本同仁化學(xué)研究所),多功能酶標(biāo)儀(奧地利Tzcan公司),倒置顯微鏡(德國Leica公司),3111型二氧化碳CO2培養(yǎng)箱、置入-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?,購自美國Forma公司,Universal 32R型低溫離心機(德國Hettich公司)。

1.2 方法

1.2.1 激活劑的配制 分別取1 000 u凝血酶,0.25g 10%氯化鈣溶于2.5 ml磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline,PBS)中制成100g/L氯化鈣與400 u/ml凝血酶的血小板血漿激活劑,0.22μm濾器過濾后離心管(eppendorf,EP)分裝,置入-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 分組及不同組別PRP復(fù)合生長因子、兔富血小板凝膠的制備 采用改良Curasan法二次離心制備富血小板血漿[3]。取100μl制備好的PRP與血小板血漿激活劑分別按9∶1、11∶1及5∶1的比例混合,從而分為3個不同實驗組,分別為9∶1組(PRP∶激活劑=9∶1)、11∶1組(PRP∶激活劑=11∶1)及5∶1組(PRP∶激活劑=11∶1)?;旌霞せ詈罂尚纬赡z凍狀物,得到3個不同實驗組的兔PRP凝膠。分別將上述3個實驗組制備的兔PRP凝膠放置于4℃冰箱24 h,4℃、5 000 r/min離心20 min。分別吸取析出的上清液,經(jīng)0.22μm濾膜過濾后分裝,得到3個不同實驗組的兔PRP凝膠釋放的復(fù)合生長因子萃取液。

1.2.3 CCK-8法 CCK-8法檢測不同比例激活劑制備的PRP復(fù)合生長因子對兔角膜基質(zhì)細(xì)胞增殖的影響。采用膠原蛋白酶消化法獲取第3代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞,以胰蛋白酶消化后,用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液制成10×103個/ml密度的兔角膜基質(zhì)細(xì)胞懸液,以100μl/孔接種在96孔板中,在5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育過夜后,棄原培養(yǎng)液,用無血清DMEM液洗滌2次,加入新的培養(yǎng)液[4]。根據(jù)加入新細(xì)胞培養(yǎng)液的不同分為4組:將3個不同實驗組的PRP復(fù)合因子萃取液用無血清DMEM配制成含5.0%兔PRP復(fù)合因子培養(yǎng)液的9∶1實驗組、11∶1實驗組及5∶1實驗組,對照組培養(yǎng)液為未加入任何PRP復(fù)合因子的無血清DMEM液。每組制備25孔,分別加入100μl/孔各自組的培養(yǎng)液,分別在培養(yǎng)第2、3、5、7和8天后,每組選取5孔加入10μl CCK-8,5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h。用酶標(biāo)儀測定 450 nm波長處的吸光度(optical density,OD),求出各組吸光度的平均值。

1.2.4 生物角膜基質(zhì)支架 采用膠原蛋白酶消化法培養(yǎng)獲得的第3代兔角膜基質(zhì)細(xì)胞,以胰蛋白酶消化后,用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液制成5×105個/ml密度的兔角膜基質(zhì)細(xì)胞懸液40μl,分別接種于3個不同實驗組的富血小板凝膠上,于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后,棄去培養(yǎng)基,分別在已貼壁細(xì)胞表面覆蓋前步制備的3個不同實驗組的富血小板凝膠,于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長狀況和形態(tài)變化,并拍照記錄。取培養(yǎng)48 h后的標(biāo)本,4%多聚甲醛固定,石蠟包埋、切片,蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色。

1.2.5 雙層豬角膜基質(zhì)的黏附 從屠宰場豬尸體上獲取新鮮豬眼球,用剪刀水平剪出全厚角膜片,解剖顯微鏡下撕去上皮層和后彈力層,環(huán)鉆鉆取并分離中央直徑約7 mm大小的角膜板層基質(zhì)片,深度約為角膜基質(zhì)厚度的1/2,在基質(zhì)片上加入120μl兔PRP,分別以不同比例加入激活劑激活得到兔富血小板凝膠,根據(jù)實驗組中制備凝膠的激活劑比例不同,分為9∶1組、11∶1組及5∶1組;在不同實驗組凝膠表面覆蓋一層直徑約7 mm大小的豬角膜基質(zhì)片,于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置過夜。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,不同培養(yǎng)時間各組細(xì)胞增生率的比較用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析,4組總體比較用兩因素方差分析,兩兩比較用Bonferronit檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兔PR P凝膠釋放的復(fù)合生長因子對細(xì)胞增殖的影響

5∶1組、11∶1組及9∶1組與對照組在培養(yǎng)2、3、5、6和8 d后OD值比較,采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析,結(jié)果:①不同時間OD值比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=819.016,P=0.000);②各實驗組與對照組的OD值比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=268.002,P=0.000),4組間兩兩比較,9∶1組與對照組、5∶1組、11∶1組比較,經(jīng)Bonferronit檢驗,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與對照組比較,各實驗組吸光度增加速度較快,而9∶1組吸光度增加速度高于其他各組,相對促角膜基質(zhì)細(xì)胞增殖作用最強;③各實驗組與對照組的OD值變化趨勢比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=103.599,P=0.000)。見圖1和附表。

2.2 富血小板凝膠作為生物角膜基質(zhì)支架

PRP與血小板血漿激活劑分別按9∶1、11∶1及5∶1的比例混合后都可以迅速形成透明膠凍狀的富血小板凝膠。倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),兔角膜基質(zhì)細(xì)胞在這3個實驗組制備的富血小板凝膠上附著良好,培養(yǎng)24 h后即可見細(xì)胞呈梭形及多角形長入凝膠內(nèi)。但9∶1組培養(yǎng)24 h的角膜基質(zhì)細(xì)胞即可達(dá)50%融合,而5∶1組和11∶1組細(xì)胞數(shù)目少于9∶1實驗組(見圖2)。石蠟切片HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),只有9∶1組制備的富血小板凝膠內(nèi)見大量的纖維素,纖維素之間交織形成多孔有序的網(wǎng)狀支架結(jié)構(gòu),與正常角膜基質(zhì)膠原纖維排列結(jié)構(gòu)極為相似,可作為組織工程角膜基質(zhì)支架。9∶1組的富血小板凝膠內(nèi)培養(yǎng)48 h后,兔角膜基質(zhì)細(xì)胞可在凝膠形成纖維網(wǎng)狀支架結(jié)構(gòu)中黏附并生長良好,在兩層凝膠之間形成典型復(fù)層細(xì)胞(見圖3A)。而5∶1組和11∶1組制備的PRP凝膠不能形成多孔有序的網(wǎng)狀支架結(jié)構(gòu),而且角膜基質(zhì)細(xì)胞接種在5∶1組和11∶1組的富血小板凝膠內(nèi)培養(yǎng)48 h后,呈單層細(xì)胞生長,不能長入凝膠內(nèi)(見圖3B)。

2.3 富血漿凝膠作為角膜黏附劑

大體觀察時,9∶1組制備富血小板凝膠作為黏附劑進(jìn)行雙層豬角膜基質(zhì)黏附時,呈透明果凍狀,能起到很好的固定黏附效果,形成穩(wěn)定規(guī)則的豬角膜基質(zhì)/兔富血小板凝膠/豬角膜基質(zhì)復(fù)合體的形狀(見圖4)。而11∶1組、5∶1組的富血小板凝膠雖然透明,但不能形成規(guī)則的固體的果凍形狀,而且與豬角膜基質(zhì)未能緊密黏附,不能形成豬角膜基質(zhì)/兔富血小板凝膠/豬角膜基質(zhì)復(fù)合體。

圖1 各組培養(yǎng)兔角膜基質(zhì)細(xì)胞O D值的變化趨勢

附表 PR P復(fù)合生長因子培養(yǎng)兔角膜基質(zhì)細(xì)胞不同時間的O D值比較 (±s)

附表 PR P復(fù)合生長因子培養(yǎng)兔角膜基質(zhì)細(xì)胞不同時間的O D值比較 (±s)

組別8 d對照組 0.379±0.032 0.353±0.039 0.306±0.053 0.324±0.020 0.359±0.322 9∶1組 0.456±0.035 0.749±0.611 1.963±0.771 2.501±0.188 2.900±0.107 5∶1組 0.324±0.012 0.494±0.588 1.051±0.225 1.794±0.107 2.173±0.363 11∶1組 0.403±0.055 0.609±0.052 1.321±0.023 1.983±0.143 2.386±0.1282 d3 d5 d6 d

圖2 9∶1組富血小板凝膠培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞形態(tài)(倒置顯微鏡×100)

圖3 兩組富血小板凝膠 (HE×200)

圖4 富血漿凝膠作為角膜黏附劑

3 討論

PRP是一種全血經(jīng)離心提取后獲得的血小板濃縮物,富血小板血漿與凝血酶等激活劑混勻激活后形成透明膠凍狀物質(zhì),即富血小板凝膠。在其激活過程中,分泌多種高濃度細(xì)胞生長因子,如血小板衍生因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β、乙烯基酯樹脂鱗片膠泥、胰島素樣生長因子及表皮細(xì)胞生長因子等,為PRP復(fù)合生長因子,該生長因子能有效地促進(jìn)細(xì)胞及組織修復(fù)[5]。此外,富血小板凝膠內(nèi)纖維素之間交織形成多孔有序的網(wǎng)狀支架結(jié)構(gòu),為細(xì)胞及組織修復(fù)提供良好的支架。目前,PRP凝膠被廣泛的應(yīng)用到組織工程領(lǐng)域。大量研究證實,PRP凝膠在臨床上的應(yīng)用取得良好的效果[6-8]。研究發(fā)現(xiàn),PRP和PRP凝膠在眼科方面也得到一定程度的應(yīng)用,在治療角膜病、眼燒傷及干眼癥等眼部疾病方面有良好的臨床效果,并廣泛用于角膜組織工程再生的研究[9-10]。

隨著PRP和PRP凝膠在各領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用,富血小板血漿凝膠的制備方法逐漸多元化,并無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。而PRP凝膠制備方法中多種因素都可能影響其生物效應(yīng)的發(fā)揮,所以針對不同的實驗和臨床用途需根據(jù)自身的需求不同,而確定其最佳的制備方法。研究發(fā)現(xiàn),制備方法中激活劑比例的選擇對PRP凝膠促組織修復(fù)再生有非常重要的作用。目前多數(shù)研究者常用的激活劑為牛凝血酶和氯化鈣的混合物(100g/L氯化鈣與400 u/ml凝血酶)[11]。制備PRP凝膠時,如果激活劑與血小板血漿選擇的比例不同,激活后制備的富血小板血漿凝膠釋放的各種生長因子的濃度、速度、比例及生長因子隨時間變化規(guī)律也大不相同。此外,制備的富血小板血漿凝膠各種成分比例不同,必然影響其組織結(jié)構(gòu)及功能,從而影響其生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮。因此針對富血小板血漿凝膠用于角膜基質(zhì)修復(fù)再生的可行性研究,需要比較選擇不同比例的激活劑制備的PRP凝膠對角膜基質(zhì)生物學(xué)效應(yīng)的影響的差異,得出促進(jìn)角膜基質(zhì)再生所需激活劑與血小板血漿的最佳配比,為臨床治療提供理論依據(jù)。

筆者參考國內(nèi)外學(xué)者的研究成果,采用改良Curasan法二次離心制備富血小板血漿,1 100g/L氯化鈣與400 u/ml凝血酶的混合物作為激活劑。使用PRP與凝血酶激活劑分別按9∶1、11∶1、5∶1的比例混合,分成3個組,激活制備的PRP復(fù)合生長因子及PRP凝膠,比較不同比例激活劑制備的PRP凝膠用于角膜基質(zhì)修復(fù)再生的可行性。

筆者先研究各組兔PRP凝膠釋放的PRP復(fù)合生長因子對兔角膜基質(zhì)細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示,與對照組相比,3組制備的PRP復(fù)合生長因子均能促進(jìn)細(xì)胞增殖,但9∶1組促角膜基質(zhì)細(xì)胞增殖作用高于其他組??梢娧“逖獫{與激活劑配比為9∶1時,激活后所得的富血小板血漿凝膠中,各種生長因子的濃度為對角膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖作用最強,為最適刺激比例。本實驗采用不同比例激活劑制備各組的PRP凝膠,并作為載體與角膜基質(zhì)細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)重建角膜基質(zhì)層,觀察細(xì)胞生長情況及構(gòu)建的效果。HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),只有9∶1組制備的富血小板凝膠內(nèi)見大量的纖維素交織形成多孔有序的網(wǎng)狀支架結(jié)構(gòu),兔角膜基質(zhì)細(xì)胞可在凝膠形成纖維網(wǎng)狀支架結(jié)構(gòu)中黏附并生長良好,在兩層凝膠間形成典型復(fù)層細(xì)胞。而5∶1組和11∶1組制備的PRP凝膠不能形成多孔有序的網(wǎng)狀支架結(jié)構(gòu),而且角膜基質(zhì)細(xì)胞接種在5∶1組和11∶1組的富血小板凝膠內(nèi)培養(yǎng)48 h后不呈復(fù)層細(xì)胞生長,不能長入凝膠內(nèi),說明9∶1組制備的PRP凝膠與其他組制備的PRP凝膠比較,既能形成與正常角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)相似有序的纖維網(wǎng)狀支架結(jié)構(gòu),作為生物細(xì)胞支架又能更有效地促角膜基質(zhì)細(xì)胞增殖分化,具有良好生物相容性。提示血小板血漿與激活劑配比為9∶1時,激活后所得的富血小板血漿凝膠未來能夠運用于角膜基質(zhì)組織工程再生的研究。本實驗對不同比例激活劑制備的兔富血小板凝膠作為黏附劑,進(jìn)行雙層豬角膜基質(zhì)黏附實驗時發(fā)現(xiàn),9∶1組制備的富血小板凝膠呈透明果凍狀,能形成穩(wěn)定規(guī)則的豬角膜基質(zhì)/兔富血小板凝膠/豬角膜基質(zhì)復(fù)合體的形狀。而11∶1組和5∶1組的富血小板凝膠雖然透明,但是未能與豬角膜基質(zhì)緊密黏附形成復(fù)合體,說明PRP與激活劑以合適的比例(9∶1)激活制備的富血小板凝膠具有良好的透明性,與異體角膜間具有良好的組織黏附性及相容性。

本實驗結(jié)果提示,與其他組比較,9∶1組制備的PRP凝膠釋放的復(fù)合生長因子能最有效地促進(jìn)角膜基質(zhì)細(xì)胞增殖,而且制備的凝膠能夠作為生物細(xì)胞支架構(gòu)建角膜基質(zhì)層,并具有良好的生物相容性及黏附性。從而說明血小板血漿與激活劑配比為9∶1時制備的PRP凝膠是一種既能黏附又能促進(jìn)角膜損傷快速修復(fù),而且還是一種接近生理狀態(tài)的天然生物材料,適合用于組織工程角膜基質(zhì)層的制備,具有良好的應(yīng)用前景。因此,制備PRP凝膠時,血小板血漿與激活劑配比為9∶1是治療眼表疾病及角膜基質(zhì)組織工程再生的最佳比例。

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(童穎丹 編輯)

Effect of different proportions of activators on biological functions of platelet-richgel*

Jing Dai1,Jian-su Chen2,Zhi-yi Zhao1
(1.Department of Ophthalmology,Liuzhou Worker's Hospital,Liuzhou,Guangxi 545005,China; 2.Research Room of Ophthalmology,Key Laboratory of Regenerative Medicine of Ministry of Education,Jinan University,Guangzhou,Guangdong 510632,China)

ObjectiveTo compare the effect of different proportions of activators on the biological function of platelet-richgel and to reaserch the feasibility for the reconstruction of corneal stroma.MethodsRabbit blood was extracted and platelet-rich plasma(PRP)was prepared by two-step centrifugation.Platelet-richgels were prepared by activation of PRP with thrombin activators in different proportions and divided into threegroups.There weregroup 9:1 (PRP:activators=9:1),group 11:1 (PRP:activators=11:1)andgroup 5:1 (PRP:activators=5:1).The rabbit keratocytes were seperately co-cultured with the three platelet-richgels and the morphological features were observed.CCK-8 assay was used to analyze the influences of compositegrowth factors released from the platelet-richgel on the proliferation of rabbit keratocytes in the threegroups. The adhesive properties of the three platelet-richgels were evaluated after adhesion to the double-layer porcine corneal stroma.MethodsThe platelet-richgel of thegroup 9:1 had better effect on promoting cell proliferation than those of other twogroups.HE staining displayed that only the platelet-richgel prepared in thegroup 9:1 formed an orderly network scaffold that could closely attach to the double-layer porcine corneal stroma.ConclusionsThe platelet-richgel,prepared by combining PRP with activators in 9:1 proportion,caneffectively promote the proliferation of keratocytes,and has the nature of orderly network structure,effective adhesiveness and favorable biocompatibility.These properties indicate that the platelet-richgel prepared by combining PRP with activators in 9:1 proportion is an excellent scaffold for the reconstruction of corneal stroma.

activator;platelet-richgel;corneal stroma

R318.08

A

2016-09-26

國家自然科學(xué)基金(No:30973244)

陳建蘇,E-mail:chenjiansu2000@163.com

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.20.004

1005-8982(2017)20-0016-05

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繃帶型角膜接觸鏡在翼狀胬肉逆行撕除聯(lián)合角膜緣干細(xì)胞移植術(shù)的應(yīng)用
變形的角膜
骨髓中缺氧誘導(dǎo)因子1α和血小板衍生生長因子B在骨髓增生異常綜合征的表達(dá)
超薄角膜瓣與普通角膜瓣的準(zhǔn)分子激光原位角膜磨鑲術(shù)(LASIK)的對比研究
肝細(xì)胞生長因子受體在腫瘤中的研究進(jìn)展
固體激活劑GJ-1的研制及應(yīng)用
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